Editace genomů (komentáře)    Stránka 4  První úspěšná změna genomu u organismu pomocí homologní rekombinace, Kvasinky jsou z tohoto  pohledu velmi vhodný organismus neb frekvence homologní rekombinace je u nich poměrně vysoká,  využito pozitivně/negativní selekce    Stránka 5  Vysvětlení zkratek, jež budou dále v přednášce používány, studenti by se v nich měli orientovat    Stránka 6  Buňka má obvykle několik možností jak opravit dvouřetězcový zlom v DNA. Pomalejší, ale přesnější je  homologní rekombinace. NHEJ je rychlá možnost opravy, při které ale často vznikají chyby (nejčastěji  drobné  inzerce  či  delece).  Zatímco  prvního  způsobu  se  využívá  při  náhradě  alel,  druhý  se  využívá  hojně  při  knock‐outu  cílového  genu,  neb  při  něm  často  dochází  k posunu  čtecího  rámce  a  vzniku  předčasného stop kodonu.    Stránka 16  3‐4 zinkové prsty na každém ze dvou řetězců tak zajištují specifitu rozpoznání cílové sekvence – u  člověka  je  vzhledem  k velikosti  genomu  považováno  za  zajištění  specifity  vazby  na  jediné  místo  v genomu  sekvence  o  délce  20  nukleotidů.  Při  návrhu  je  však  zapotřebí  brát  v potaz  že  některé  sekvence se v lidském opakují, nebo jsou si velmi podobné (např. příbuzné funkční domény proteinů).  Vzhledem ke znalosti lidského genomu je proto při návrhu cílových míst používán algoritmus, který  zajišťuje  návrh  pokud  možno  jedinečné  sekvence  a  tím  vysokou  specifitu  štěpení  pouze  v cílovém  místě.    Stránka 17  K návrhu ZFN je třeba mít rozsáhlé znalosti proteinového inženýrství, tak aby bylo možno upravovat  ZF  tak,  aby  rozpoznávaly  specificky  pouze  cílovou  sekvenci.  Obvykle  se  tedy  využívá  služeb  specializovaných laboratoří, jež se na návrh ZFN specializují. Celý proces od návrhu a testování cílové  sekvence po její finální doručení je tak poměrně dlouhý.      Stránka 20  TALENs jsou tedy v podstatě skládačkou tvořenou opakovanými úseky 34 aminokyselinové repetice,  kde  pouze  záměna  aminokyselin  v pozici  12  a  13  zajišťuje  specifitu  vazby  k určitému  nukleotidu  v sekvenci DNA. Štěpení DNA zajišťuje opět dimer FokI. NLS je zkratka pro jaderný lokalizační signál.     Stránky 22 a 23  DNA  binding  kód  pro  TALENs  –  ukazuje  sekvenci  aa  v pozici  12‐13  a  vazbu  cílového  nukleotidu.  V některých případech je tato vazba vysoce specifická, v jiných je více promiskuitní.    Stránka 24  Dá  trošku  práce  poskládat  za  sebe  jednotlivé  repetice  TALENs  ve  správném  pořadí.  Proto  jsou  využívány  databáze  již  předskládaných  dimerů  trimerů,  tetramerů,  které  celý  proces  zrychlí  a  zjednoduší.    Stránky 33 a 34  Rúzné možnosti PAM sekvencí – přirozené nebo mutované Cas proteiny    Stránka 37  Schéma  typického  experimentu  pro  vytvoření  knock‐outu  určitého  genu.  Transfekce  CRISPR  konstruktu  do  buněk.  Cas9  nukleáza  může  být  fluorescenčně  značená,  což  umožňuje  sortrování  buněk  po  transfekci  s vysokou  expresí  Cas9.  Jako  alternativa  lze  použít  selekci  na  rezistenci  k antibiotiku nesenou vektorem s Cas9. Po sortrování/selekce buňky rozklonujeme pro zisk single cell  kolonií.  Tyto  kolonie  poté  testujeme  na  expresi  cílového  proteinu.  V případě  ztráty  exprese  sekvenujeme cílové místo v genomové DNA pro potvrzení vzniku mutace.    Stránky 38‐39  Různé  komerční  CRISPR/Cas9  systémy  (pouze  výběr)  –  systém  na  straně  39  je  zajímavý  v tom,  že  obsahuje 5´a 3´homologické oblasti k sekvenci cílového místa v genomu. Po tvorbě ds DNA zlomu, tak  může dojít k homologní rekombinaci, díky níž je do místa začleněn gen pro rezistenci k antibiotiku  (zde puromycin). Po selekci buněk a otestování exprese je třeba pomocí PCR opět ověřit začlenění  kazety do správného místa v genomu (kazeta se může začlenit do genomu i náhodně na jiné místo,  tvorba ds DNA zlomu v cílovém genu však zvyšuje pravděpodobnost začlenění do cílového genu).      Stránka 43  Klíčovou nutností í všech gene editovacích systémů je zajištění specifity. V případě jednoduché sgRNA  s 20 nt cílovou sekvencí se v genomu nacházejí podobná cílová místa a je třeba zamezit štěpení mimo  cílové místo. Záměna jednoho nukleotidu v seed regionu sgRNA obvykle není tolerována a ke štepení  nedochází.  Pří  malé  odlišnosti  sekvencí  distálně  od  seed  regionu  však  specifita  nemusí  být  úplná.  Proto jsou vyvíjeny systémy zajišťující větší specifitu. Nikázy jsou Cas9 proteiny s mutovanou jednou  ze dvou nukleázových domén. Lze je tedy navrhnout jako pár na dvě přilehlá místa. Výsledkem jsou  dva  jednořetězcové  zlomy  na  protilehlých  řetězcích  genomové  DNA  blízko  u  sebe.  Takovéto  poškození  buňka  opravuje  jako  dvouřetězcový  zlom.  Specifita  je  zde  dána  2x20  nukleotidy  (každá  nikáza  mas  svou  sgRNA  sekvenci).  Dalším  přístupen  zvyšujícícm  specifitu  je  využití  2  nukleáza‐ deficientních forem Cas9 s navazaným monomerem FokI. Specifita je opět zajištěna 2x20 nukleotidy.  Štěpení DNA zajišťuje sestavený dimer FokI.    Stránka 45  BER – excizní reparace bází    Stránka 47  Schéma „high‐througput“ experimentu vyhledávání cílových genů či jejich mutací zodpovědných za  určitý fenotyp. Knihovna CRISPR vektorů, každý nese svou jedinečnou značku, je přenesena do buněk  – do různých buněk přeneseny jen některé vektory z knihovny. Následuje selekce na vybraný fenotyp.  Poté je určena jedinečná značka v těchto buňkách (PCR a sekvenace značky) a od ní odvozena cílová  sekvence, jež byla obsažena v původní knihovně. Takto je identifikován gen, který se pravděpodobně  podílí na vzniku selektovaného fenotypu.    Stránka 59  Na  webové  stránce  clinicaltrials.gov  je  možno  po  zadání  klíčového  slova  CRISPR  nalézt  běžící  a  ukončené klinické studie využívající v současné době CRISPR technologii    Stránka 60‐61  Specifita  CRISPR  metody  byla  nedávno  zpochybněna.  Po  hlubší  analýze  publikovaných  dat  se  však  ukázalo, že byly špatně zvoleny kontroly (kontrolní myši používané v experimentech nebyly totožné  s myšmi pokusnými a jejich genom se proto odlišoval od genomu pokusných myší přirozeně a nikoli  díky nespecifickému účinku CRISPR).      Stránka 64  Řada  metod  využívající  systém  CRISPR  pro  detekci  mikroorganismů  –  každý  organismus  má  své  jedinečné sekvence. Využívány CRISPR systémy, jež se aktivují štěpením cílové sekvence ke štěpení  dalších sekvencí. Tyto další sekvence jsou nějak označeny, abychom jejich štěpení mohli monitorovat.    Stránka 66  Do  genomu  organismu  rozmnožujícího  se  pohlavně  je  vložen  konstrukt  syntetizující  sgRNA  a  Cas9  nukleázu.  sgRNA  je  zaměřena  proti  genu,  jehož  mutace  způsobuje  sterilitu  samiček.  Po  oplození  dochází ke tvorbě dvouřetězcového zlomu v tomto genu a následné opravě. Je‐li oprava bezchybná,  gen  je  opět  rozštěpen  tímto  konstruktem.  Dojde‐li  ke  vzniku  mutace,  systém  již  toto  místo  nerozpozná,  ale  gen  je  obvykle  nefunkční  (posunová  mutace)  a  samička  proto  neplodná.  Samečči  tento konstrukt přenášejí v populaci. Výsledkem může být až vyhubení celé populace.