1 Příprava transgenních savců – přenos genů do buněk, které musí být schopny dát vznik celému jedinci - využití zárodečných buněk (x rostliny – somatické buňky) - je potřeba mít vhodný systém selekce - celá řada možností jak připravit transgenní myš V praxi se používají především 2: a) přímá mikroinjekce cizorodé DNA pro prvojádra oplozeného vajíčka - obvykle samčí prvojádro – větší a blíže povrchu - přenos do pseudopregnantní samice (hormony, kopulace se steril. samečkem) b) genové manipulace s ESC a injekce do blastocysty - přesné (cílené) modifikace genomu – lze provádět selekci in vitro (HR) - přenos zpět do blastocysty a poté do náhradní matky 2 Příprava transgenních savců 3 Možnosti přípravy geneticky modifikovaných myší Gamety ZygotaPrimordiální zárodečné buňky Transfekce Náhrada jader Transfekce Retrovirový přenosSomatické buňky ES buňky Přenos buněk Blastocysta (intracytoplasmic sperm injection) GFP Mikroinjekce DNA Životní cyklus myši; stadia během nichž lze vnášet geny Přenos do náhradní matky 4 Vytváření transgenních myší mikroinjekcí cizího genu do oplozeného vajíčka DNA SV40, tkHSV, lidský inzulin, -globin, interferon Důkaz transgenu, např. PCR, in situ hybridizací Úspěšnost uchycení 10-30% exprese umlčení Až 40% potomstva obsahuje transgen začleněný náhodně, obvykle tandemově ve více kopiích v jednom chromozomu 5 Manipulace s embryonálními kmenovými buňkami ESC – pluripotentní kmenové buňky vnitřní buněčné masy blastocysty - izolace a propagace myších – poprvé Evans 1981 - odebrání blastocyst (4-6 dní po oplození) - enzymatická/mechanická disociace buněk vnitřní buněčné masy - kokultivace s podpůrnými buňkami (fibroblasty) 6 Typy kmenových buněk 7 Manipulace s embryonálními kmenovými buňkami Vnesení genů Transfekce, elektroporace, retrovirová infekce Terapeutické klonování, náhrada tkání a orgánů Vrstva fibroblastů (produkce růstových faktorů - LIF, BMPs) selekce 8 Příprava transgenních myší přenosem genů do embryonálních kmenových buněk (ESC) 9 Příprava knokautovaných myší po přenosu genů do ES buněk 10 Nejčastěji používané myší kmeny – řada různých kombinací 129 – black agouti (hnědá), chinchilla (šedá), white (bílá) C57BL/6 – black (černá) Balb/c – white (bílá) (v kombinaci s black C57BL/6 pigmentem je agouti) - kmeny se liší robustností ESC/dospělců, znalostí genomu, produkcí potomků (C57BL/6 pojídají svá mláďata), úspěšností ESC začlenit dát vznik potomkům na určitém genet. pozadí, … Agouti 129 - dominantní nad black C57BL/6 Black C57BL/6 dominantní nad Balb/c white - ale i další možné kombinace 11 12 Příprava ES buněk s geny knokautovanými homologní rekombinací AAMm Dárkyně ES buněk PNS vektor (m) AAMM 13 Vytvoření myši nesoucí knokautovaný gen AAMm aaMM aaMM + AAMm Dárkyně ES buněk Dárkyně blastocyst A = aguti, a = black, M = standardní gen, m = mutantní alela chiméra 14 Pokračování - vytvoření myši s knokautovaným genem Stanovení genotypu analýzou DNA 15 Struktura rozpoznávací sekvence lox P fága P1 Podle orientace loxP sekvencí je úsek DNA mezi nimi místně specifickou rekombinací prostřednictvím Cre-rekombinázy buď deletován nebo invertován ::::::::::::::::::::::::::::: 16 Využití Cre-loxP rekombinačního systému k selektivní inaktivaci (deleci) genů Gen A je ohraničen sekvencemi loxP Ve vybraných buňkách nebo tkáních je gen A deletován Cre-rekombináza se tvoří specificky jen v buňkách určitých tkání Cre-rekombináza pod kontrolou Tet-systému = indukovatelnost jiný vektor – transientní exprese 17 FLP-FRT systém - kvasinkový enzym Flp rekombináza (flipáza), 34 bp FRT sekvence - různé typy FRT sekvencí – rekombinace pouze mezi stejnými typy 18 Vytvoření knock-in myší Takto lze připravit nejen knock-in myš (myš exprimující nějaký „nový gen“) … – umístěn obvykle do nekritického regionu … ale i měnit sekvence genů (oprava mutací, zavádění mutací, …) 19 BRAINBOW myš 20 Inženýrství chromozomů s využitím rekombinačního systému Cre-LoxP translokace Delece (MIKRODELECE) M1 = neo, M2 = puro 21 Základ expresního systému indukovatelného tetracyklinem Konstitutivní exprese TetR povede k inaktivaci jakéhokoli transgenu, který obsahuje sekvenci operátoru, k níž se TetR váže. Po přidání tetracyklinu (nebo jeho analogu doxycyklinu) dojde k jeho navázání na TetR, jehož konformace se změní a není schopen se vázat na operátor, což vede k navození exprese transgenu. tetR = tetracyklinový represor 22 Genová exprese regulovaná tetracyklinem Systém tet-off tTA = tetracycline transactivator – hybridní protein složený z tetracyklinového represoru (gen = červená) a transkripčního aktivátoru (gen = modrá) Dox = doxycyklin Buněčně-specifický promotor Násobné sekvence tetracyklinového operátoru + silný eukaryotický promotorSystém tet-on Navázání tTA na promotor je nezbytné pro aktivaci transkripce transgenu rtTA = reverse tetracycline-controlled transactivator systém – nukleotidová sekvence tetracyklinového represoru obsahuje mutaci zabraňující jeho vazbě na tetO; k vazbě dojde po interakci s Dox. Přidání Dox vypíná expresi transgenu Přidání Dox zapíná expresi transgenu 23 Tetracyklinový systém regulace Obě transkripční jednotky (tTA nebo rtTA + transgen) mohou být umístěny na jeden vektor, což usnadňuje přípravu transgenních myší. Využití: • Sledování dopadu tvorby defektních proteinů • Sledování dopadu nadprodukce určitého normálního proteinu (simulace buněčně specifických poruch) • Testování exprese genů u chorob, ovlivňujících jen určitý buněčný typ (tTA/rtTA pod buněčně specifickým promotorem) • Regulace tvorby cre-rekombinázy/flipázy I jiné inducibilní systémy u eukaryot: - indukce tamoxifenem, ecdysonem, mifepristone … Výhoda: oproti rekombinační inaktivaci (cre-lox systém) umožňuje tet systém reverzibilní vypínání/zapínání genů 24 Hybridní rekombináza s vazebnou doménou estrogenového receptoru - k aktivaci enzymatické aktivity dochází po vazbě tamoxifenu 25 Využití transgenů k usmrcování specifických buněčných typů (mikrochirurgické zásahy) Gen kódující toxin (transgen) je začleněn za regulační oblast aktivní v určité tkáni – exprese transgenu je tak cílena do buněk této tkáně Toxiny: difterický toxin, ricin, Pseudomonas exotoxin A, … Problém: exprese genu pro toxin v okamžiku aktivace endogenu (např. v časné fázi vývoje) může být letální pro organismus Alternativa: použití genu TK z HSV, který je zapojen za specifickou E-P sekvenci. Buňky s tímto genem nejsou usmrceny, dokud nejsou do organismu injikovány syntetické toxické nukleotidy – ty nejsou toxické pro buňky, v nichž k expresi genu nedochází, protože v nich není aktivována specifická E-P sekvence. V buňkách, v nichž je E-P aktivní, dochází k expresi TK, která syntetické nukleotidy metabolizuje na produkty, které zabíjejí dělící se buňky exprimující daný gen. - obdoba i cytidin-deamináza + 5-fluorocytosin → 5-fluorouracil 26 * Mutantní forma genu, jehož produkt vytváří spolu s produktem endogenu nefunkční dimer (inaktivní komplex, např. receptor), i DNA-vazebné domény TF ** Intrabody: protilátka vytvářená uvnitř buňky z transgenu – inaktivuje produkt cílového genu ***Aptamer: DNA/RNA oligonukleotid vázající se na cílovou molekulu a inhibující jeho aktivitu; peptidový aptamer: peptid vázající se na cílový protein. Intramer: totéž jako aptamer, ale exprimovaný z genu uvnitř buňky Přehled metod k potlačení exprese genů bez nutnosti vytvářet jejich mutace Interference na úrovni RNA Interference na úrovni proteinů Antisense RNA Dominant negatives * Antisense oligonukleotidy protilátky, intrabodies ** Ribozymy nebo maxizymy Aptamers, intramers *** Deoxyribozymes Sense RNA (kosuprese) dsRNA (RNA interference) siRNA (RNA interference) miRNA 27 Cílená exprese genu ve specifické tkáni Detekce protilátkou Konstitutivní tvorba T-ag Řídí tkáňově specifickou expresi klonovaného genu do beta-buněk pankreatu Transgen se exprimuje jen v pankreatu, kde navozuje vznik nádorů. V ostatních tkáních se neexprimuje. Tkáňově specifická exprese transgenu T-antigen SV40 – významný onkogen – schopnost transformace 28 Akceptorové místo sestřihu Začlenění reportérového genu za intron genu X sestřiženo v ES Transgeny jako reportérové geny pro sledování exprese genů hostitele 1. Selekce ES buněk obsahujících vnesený konstrukt (G418), 2. Injekce ES buněk do blastocyst, 3. Identifikace buněk (tkání), kde dochází k expresi lacZ, 4. Vyhledání genu X, který řídí expresi lacZ -galaktozidáza 29 Analogie fly-trap systému u Drozofily - reportérové konstrukty – P{GAL4} systém - www.fly-trap.org - náhodná inzerce GAL4 (kvasinkový TF) – může se dostat pod kontrolu endogenního promotoru/enhanceru - místo a čas exprese GAL4 lze studovat po křížení s kmenem, kde exprese reportérového genu (lacZ, GFP) – charakterizace promotoru/enhanceru - kdy a kde a za jakých podmínek je aktivní - tyto promotory pak využity pro cílenou expresi v určité tkáni v určitém čase 30 Use electroporation to introduce construct into ES cells Add G418 to select neo-containing cells Colonies of surviving cells must contain neo gene Isolate colonies Make a replica and stain with X-gal Inactive lacZ Active lacZ Grow cell lines No activation Activation during development Inactivation during development Regulated expression Expression throughout embryo Examine embryos stained with X-gal Inject cells Clone gene containing integrated transgene Využití reportérových genů k vyhledání genů aktivních v určitých fázích vývoje lacZ je aktivní v závislosti na místě začlenění Sledování exprese genu během vývoje embrya Buněčná linie obsahující transgen (lacZ) začleněný v konkrétním místě (genu) Inzerční inaktivace genů vede k pozměněným fenotypům, izolace těchto genů Analogicky lze využít retrovirových vektorů s reportérovými geny – infekce tkání vyvíjejícího se organismu 31 Příprava transgenních ptáků germinální disk Ozářené recipientní embryo (čerstvě nakladené vejce) Transgen se stal součástí zárodečných buněk Cíle transgenoze u drůbeže Odolnost proti virovým a bakteriálním chorobám, proti kokcidióze Nižší obsah tuku a cholesterolu ve vejcích, vyšší kvalita masa Příprava rekombinantních proteinů: monoklonální protilátky, růstový hormon, inzulin, HSA, interferon, lysozym Pluripotentní buňky (blastodermální a primordiální) pěstované in vitro 32 33 Příprava transgenních ptáků - i postupy s infekcí blastodermu retroviry - případně i infekce časného embrya (12-14 den) - nelze z bezpečnostních důvodů aplikovat při produkci drůbeže pro jídlo 34Primordial germ cells – migrují krví do gonád 35 • Zvířata (myši, drůbež, hospodářská zvířata, ryby) obsahující gen pro růstový hormon – rychlejší růst, změna vlastností produktů • Přežvýkavci obsahující ve střevě GMO-mikroorganismy, které redukují toxicitu některých rostlin (rozšíření potenciálu krmiv) • Drůbež s pozměněnými trávicími schopnostmi (celulóza, lignin, tuky) • Drůbež se zvýšeným obsahem lysozymu ve vejcích (antibakteriální účinky - využití v průmyslu (vejce déle vydrží) a farmakologii) • Ovce s vylepšenou srstí • Myši s pozměněnými nebo inaktivovanými geny • studium lidských genetických poruch: neurodegerativní, imunitní, hormonální choroby, • vliv faktorů na organismus (např. léků, mutagenů) • studium poruch paměti • Zvířata jako dárci orgánů pro transplantace (xenotransplantáty) – orgány s pozměněnými antigeními vlastnostmi vhodné pro člověka • Zvířata produkující cizorodé látky v mléce, moči, krvi nebo tkáních (animal farming: zvířata jako bioreaktory) Příklady transgenních živočichů 36 Transgenní zvířata • Transgenní prasata • Prasata exprimující lidský hemoglobin – 15 % lidského hemoglobinu • Náhražka krve pro transfůze, uchovávání orgánů pro transplantace • Transgenní myši používané jako modely při studiu lidských chorob • Např.: myši se změnou barvy srsti, abnormality v ledvinách, kostech, s cukrovkou, osteopetrozou, změnou vývoje T-lymfocytů, změněnou aktivitou interferonu, uspořádání genů pro imunoglobuliny, osteoartritis, s receptory pro viry /HIV/ a řada jiných. • Modifikace trávicích enzymů savců • Příprava myší, které depolymerizují celulózu v tenkém střevě – nepřežvykující savci schopni trávit celulózu. • Transgenní kmeny myší - „pomalejší stárnutí“ – dlouhověkost • Fosfoenolpyruvátkarboxykináza (PEPCK-C) – vyšší metabolická aktivita, vyšší aktivita (pořád běhají), rodí i v pozdním věku, žijí déle … Ovce, myš – KO prionového genu Myši – knockout genu pro myostatin (chybění myostatinu vede k růstu svalů) – belgický modrý skot (mutace v genu pro myostatin), jiná hospodářská zvířata 37 Transgenní zvířata • Transgenní živočichové hypersenzitivní k mutagenům nebo karcinogenům • testování toxicity látek vnějšího prostředí, farmak aj. • Transgenní prasata s genem pro somatotropin • stejná rychlost růstu, o 15 % účinnější konverze potravy • zvířata mají méně tuku a netrpí poruchami • Transgenní ovce exprimující gen kódující obalový protein visna viru • vlastní retrovirová vakcína /retrovirus způsobující pneumonie, proti nimž není možná vakcinace. Zavedení cizího genu do ovcí vede k produkci protilátek proti proteinu a tím ochraně vůči infekci. • Transgenní ryby • rezistentní k prostředí (salinita, kyselé deště) • rezistentní vůči chorobám • zvýšení přírustku ryb zavedením genu pro chimerický všeobecný růstový hormon (losos – 13-ti násobné přírustky ve srovnání s netransgenními rybami) 38 Transgenic rodent (esp. mouse) models of disease mice that produce human hybrid immunoglobulin a model of malignant skin melanoma IL-2 deficient mice that suggest IL-2 is not so important in immune response as suggested by in vitro studies IL-4 deficient mice are resistant to murine AIDS Mice with altered spatial learning studies looking at genes that can prevent diabetes in non-obese diabetic mouse models mice with altered brown fat deposits and their role in obesity research mice with central nervous system damage by expression of a HIV protein mice expressing gamma interferon in the liver get chronic active hepatitis a commercially available genetically engineered mice that expresses the human plasma enzyme, cholesterol ester transfer protein, which may accelerate heart disease transgenic mice for human disease include: deficiencies in the homeobox gene Msx1 cause palate, craniofacial and tooth development abnormalities a model for Menkes disease epilepsy in mice was found to be associated with a defect in the ceruloplasmin gene sensory and sympathetic neuropathies due to a disrupted Trk/NGF gene sensory defects with a lack of neurotrophic factor various physiological changes result from lose of plasminogen activator gene altered muscle growth and movements from disrupted neurotrophin 3 receptor gene altered spleen development from changing the homeobox gene Hox11 - this gene controls the genesis of the whole spleen, one gene one organ? Mice lacking type IX collagen develop noninflammatory degenerative joint disease A mutation in the ryanodine receptor gene that is thought to be a calcium channel for release of calcium from the sarcoplasmic reticulum in muscle that prevents muscle action, and causes early depressed mice 39 aggressive mice slow-learning mice modified dopamine receptors, mice lacking estrogen receptors, models of prion disease Mouse models for Alzheimer's disease mice lacking p53 tumour suppressor gene are predisposed to cancer A mouse model of hemophilia A was made by targetted disruption of the mouse factor VIII gene a model for Helicobacter pylori infection, that is associated with ulcers Studies on obesity and insulin processing A model for Down's syndrome Mouse models and breast cancer, Absence of DNA excision repair gene XPA increases susceptibility to UV-B and carcinogens, Genetic control of mating behaviour Human disease models: heart and lung disease in transgenic mice tuberculosis for vaccine development, Mouse models of atherosclerosis can be effected by apolipoprotein A-IV High-level expression of recombinant human fibrinogen in the milk of transgenic mice - up to 100% of the protein was incorporated into fully functional fibrinogen hexamers. A new genetically engineered strain of mice that suffers both brain degeneration and memory deficits, and develops the same brain deposits of a protein called amyloid that are seen in human sufferers, should allow researchers to test the idea that the amyloid deposition actually causes the brain changes that leads to memory loss in Alzheimer's Over 1200 mutations have now been catalogued in mice, with a wide range of phenotypes 40 Transgenní myš (vlevo) obsahující gen pro lidský růstový hormon Propojený obrázek nelze zobrazit. Příslušný soubor byl pravděpodobně přesunut, přejmenován nebo odstraněn. Ověřte, zda propojení odkazuje na správný soubor a umístění. 41 Přenos genů do ryb: do oplozeného vajíčka nebo do časného zárodku je mikroinjekcí (elektroporací, liposomy, pomocí samčích pohlavních buněk) přenesena DNA, zisk chimerické ryby, pak křížení transgenních ryb – ustavení transgenních linií ryb Růstový hormon (all-fish n. all- salmon) – rychlejší růst Pěstování ryb v akvalkulturách Kapr, losos, siven, tilapia (okonouvec) 42 Využití GloFish – exprese různých barevných proteinů AquAdvantage losos – schválen FDA 2015 pro komerční produkci a konzumaci (růstový hormon) Sledování znečištění prostředí - luc gen pod kontrolou promotorů aktivovanými těžkými kovy - sledování mutageních látek v prostředí (mutace v transgenech lacl, cII, …) 43 Mutageneze in vivo: mutace genů fága lambda začleněného v genomu ryb Mutace genu cII snižuje pravděpodobnost, že nastane lyzogenizace. Vzorek fágů se zvýšeným počtem mutací v genu cII bude tvořit více plak než vzorek s fágy bez mutací v cII. Jiný systém testování mutagenů na transgenních rybách používá plazmidový transgen zodpovědný za citlivost k antibiotikům jako cíle pro mutační působení. E. coli je transformována plazmidovou DNA, která je izolována z ryb ovlivněných mutagenem. Zvýšená frekvence kolonií rezistentních k antibiotikům (srovnání izolátů z ryb na něž bylo a nebo nebylo působeno mutagenem) odráží sílu mutagenu. 44 Zvířata jako živé továrny („animal farming“) pharming Promotor genu pro lactoglobulin – produkce transgenu v mléce 45 koza – protein pavoučího vlákna v mléce, atp. kráva – lysozym nebo lysostafin v mléce Příklady látek vytvářených v transgenních zvířatech Zvíře Látka Využití ovce Alfa-1-antitrypsin Léčba rozedmy plic koza Tkáňový aktivátor plazminogenu Rozpouštění krevních sraženin ovce Faktor pro srážení krve VIII, IX Navození srážení krve prase hemoglobin Náhražka krve při transfúzi koza Lidský růstový hormon Léčba nanismu ovce, myš Regulátor CFTR Léčba cystické fibrózy prase Lidský protein C Antikoagulans krve 46 New genes introduced into farm animals to alter growth chatacteristics Species Regulatory element Structural gene 47 vs. Polly Klonování savců 48 Transgenní bakterie (Rhodococcus) produkující toxin (cekropin) usmrcující trypanozomy ve střevě ploštic Complementary DNA encoding cecropin A Plasmid vector Rhodococcus rhodinii Transformed R. rhodinii Transformed R. rhodinii in into hindgut od reduvii T. cruzi T. cruzi reduced or eliminated Hindgut od reduviid bug Rhodnius prolixus (reduviid bug) Insects colonized with transformed R. rhodnii Trypanosomes destroyed Cecropin A produced endogenous in hindgut Cekropiny – polypeptidy s antibakteriálním účinkem z hmyzu (složka imunity) 49 Různé osudy DNA viru leukémie po přenosu do myši – závislost na čase a metodě přenosu 20-40 kopií v jednom chromozomu Tkáňově specifická exprese Virus působí jako infekční agens Mozaikovitost, 1 kopie integrovaná v různých místech 50 Analýza sexuální determinace – funkce genu sry 1. Lokalizace genu Tdy (Sry) na chromozomu 2. 2. Klonování genů z oblasti Tdy 14 kb fragment nesoucí gen Sry (tj. jediná DNA z chromozomu Y, která je nyní ve vajíčku) samičí samčí Gen Sry podmiňuje tvorbu samčích pohlavních orgánů 51 Injekce analogů nukleosidů PGH = promotor genu pro GH PP = promotor genu pro prolaktin Zvířata s genem tk pod kontrolou PGH (1) PP (2) V buňkách, v nichž je P aktivní, dochází k expresi TK, která analogy nukleotidů metabolizuje na produkty, které zabíjejí dělící se buňky exprimující daný gen. Objasnění vývojových vztahů mezi buňkami hypofýzy Prekurzorová buňka Buňky syntetizující růstový hormon (GH) Buňky syntetizující prolaktin diferenciace GH GH tktk PGH PP Trpaslíci Normální růst Závěry: • Buňky syntetizující prolaktin se nedělí (nejsou usmrcovány) • Buňky syntetizující GH jsou prekurzory buněk syntetizujících prolaktin 1) 2) exprese exprese