1
1. Přenos genů do živočišných buněk
• vyhledávání genů, poznání jejich funkce a regulace
• studium fenotypu (př. procesů diferenciace a jejich poruch)
• homologní vs. heterologní exprese
• studium proteinových interakcí
• tvorba a purifikace cizorodých proteinů
2. Příprava transgenních živočichů
• studium fungování genů v rámci celého organismu
• příprava živočichů (savců, ptáci, ryby …) s cíleně upravenými
geny
• modely pro studium genetických chorob
• příprava zvířat s lepšími užitkovými vlastnostmi
• vytváření cizorodých proteinů (animal farming)
• hledání možností pro genovou terapii
Cíle studia přenosu genů do živočišných buněk
2
Transfekce – chemické, fyzikální, virové
• precipitace fosforečnanem vápenatým, lipofekce (liposomy)
• dendrimery (větvené org. látky), kationické polymery (PEI)
• elektroporace, mikroinjekce, sonoporace (ultrazvuk)
• cell squeezing (deformace tlakem), magnetofekce (nanočástice)
• infekce (virové vektory)
Fúze buněk (savčích, bakteriálních protoplastů), náhrada jader …
Exprese transgenu:
• transientní (přechodná)
• stabilní – začlenění – náhodné, cílené
Způsoby přenosu DNA do buněk živočichů
(volná DNA nebo DNA klonovaná ve vektorech)
3
Single cell transfection (i in vivo)
• mikroinjekce
• elektroporace mikropipetou naplněnou DNA
• fototransfekce (optická tranfekce) – multi-photon laser – zvýšení
permeability cytoplazmatické membrány
4
Způsoby přenosu cizích genů do savčích buněk
Transgenní zvíře
(+/- mozaikové)
Buňky ve
tkáňových
kulturách
DNA klonovaná
ve vektoru, nebo
infekce virovým
vektorem
Sledování exprese
mRNA v žabích oocytech
Projádro
časné
embryo
infekce rekombinantním
retrovirem
Selekce a přenos
do blastocyst
Začlenění DNA
homologní
rekombinací
5
reportérové geny
Enzym Selekční látka Mechanismus selekce
Aminoglykozidfosfotransferáza
(APH) neo
G418 (inhibice syntézy proteinů)
(kanamycin, neomycin)
APH inaktivuje G418
Dihydrofolátreduktáza (DHFR)
Metotrexát (Mtx) – analog dihydrofolátu
(inhibuje DHFR, syntéza purinů)
varianta DHFR rezistentní
k Mtx, počet kopií
Hygromycin-B-fosfotransferáza
(HPH) (Hyg)
Hygromycin-B (inhibuje syntézu
proteinů)
HPH inaktivuje
hygromycin B
Tymidinkináza (TK)
Aminopterin (analog dihydrofolátu,
inhibuje syntézu dTTP z dCDP)
TK syntetizuje tymidylát
(altern. dráha synt. dTTP)
Xantin-guanin-
fosforibozyltransferáza
(XGPRT) (Ecogpt)
Mykofenolová kyselina (inhibuje
syntézu GMP de novo)
XGPRT syntetizuje GMP
z xantinu (altern. dráha)
Chloramfenikoltransferáza
(CAT) Reportérový gen
Chloramfenikol (Clm) (inhibice
biosyntézy proteinů na ribozomu)
CAT inaktivuje Clm
Hypoxantinguaninfosforibozyltransferáza
(HGPRT)
Aminopterin (inhibuje syntézu purinů
de novo)
HGPRT syntetizuje puriny
z hypoxantinu
Luciferáza
GFP
beta-glukozidáza
Selekční markery pro přenos genů do eukaryot
6
Selective marker gene systems for mammalian cells
Selective agent Action of selective agent Marker gene
Action of marker
gene protein
Xyl-A
Blasticidin S
Bleomycin
G-418 (Geneticin)
Histidinol
Hygromycin B
MSX
MTX
PALA
Puromycin
MSX, methionine sulfoximine; MTX, methotrexate; PALA, N-(phosphoacetyl)-L-aspartate;
Xyl-A, 9-β-D-xylofuranosyl adenine
7
Metabolismus
pyrimidinů
Metabolismus
purinů
Selekční systémy Tk, HGPRT, XGPRT
Selekční media pro enzymy Tk, HGPRT a XGPRT
Medium XAT
Xantin (+ kys.
mykofenolová)
Ecogpt
8
Připravena řada
linií lidských a
hlodavčích tk-
buněk
Postup při izolaci mutant tk-.
Buňky s funkčním enzymem
thymidinkinasou fosforylují
bromdeoxyuridin (BrU-dr) na
BrU-MP, který je potom
inkorporován do buněčné
DNA. Bromovaná DNA je
extrémně citlivá na ozáření UV
světlem, po kterém buňky
hynou. Vzácné mutanty tkozáření
přežívají.
9
Transientní a stabilní exprese genů v živočišných
buňkách
Selekce G418
DNA, která se do
genomu neintegrovala,
se z buněk postupně
vyředí
Selekce klonů s DNA
stabilně integrovanou
do genomu (vzácné)
Stabilní buněčné linie
(transformované buňky:
HeLa, CHO aj. po infekci
onkogenními retroviry)Analýza exprese genů.
Studium regulačních
oblastí, sestřihu; příprava
velkých množství mRNA
nebo proteinů
10
Ideální vlastnosti vektorů (in vivo)
• vysoká účinost přenosu
• přenos genů do embryí i do dospělých živočichů
• zprostředkovávají dlouhodobou a vysokou expresi
• nízká cytotoxicita
• nízká imunogenicita in vivo
• vysoká kapacita
• regulovatelná exprese
11
12
13
Lipofectamine2000, Lipofectamine LTX, Fugene, Effectene
- deregulace exprese genů a proteinů (společné i specificiké)
- metabolismus lipidů
- aktivace signálních drah (STAT3, …)
- imunitní odpověď (deregulace exprese chemokinů a cytokinů)
- efekty často buněčně specifické
Antibiotika pro selekci
- G418 – vliv na syntézu selenoproteinů (thiredoxin reduktáza, glutation peroxidáza)
- stop kodón supresor
- ovlivňuje expresi hsp proteinů
Gene dosage artefacts
14
1. Transfekce cizorodé + nosičové DNA = vytváření konkatemerů
• transgenom (selektovatelný marker, neselektovaný gen-nosičová
DNA) začleněný v jedné kopii v libovolném úseku genomu. Později
často dochází k částečné nebo úplné deleci transgenomu
2. Transfekce (Ca-P) čisté plazmidové DNA bez nosičové DNA = plazmidy
jsou stabilně integrovány do jednoho až pěti různých míst genomu, kde
se nacházejí převážně ve více kopiích.
3. Elektroporace plazmidové DNA – obvykle nižší počet integrovaných
plazmidových molekul
4. Mikroinjekce plazmidu do buněčného jádra
a) při vysoké koncentraci DNA dochází k inkorporaci dlouhých
konkatemerů (hlava-pata),
b) při malém množství DNA se začlení jednotlivě.
Osud přenášené plazmidové DNA
v recipientní buňce
Po linearizaci plazmidu přibývá pravděpodobnost tvorby konkatemerů
a začlenění do genomu, přičemž nehraje roli, kterou metodou byla DNA
plazmidu vnesena. Superhelikální plazmidová DNA, ale vyšší účinnost
transfekce.
15
transgenom
Kotransfekce několika druhy molekul DNA
Kotransformace během
přenosu genů. Při tranfekci
tk do eukaryontních buněk
pomocí precipitace Ca2+ je
část nosičové DNA
a jakákoliv další DNA
přítomná v precipitátu spojena
dohromady do velkých
struktur (800 až 1000 kb) a
včleněna do chromozómu.
16
Izolace genu pro tk z kuřecích buněk – „plasmid rescue“
možnost izolovat každý
gen, který je v kultuře na
základě svých
fenotypových vlastností
selektovatelný nebo
nějak poznatelný.
další možnosti značení:
supF, pBR322, alu
genomové
fragmenty
po štěpení
HindIII
vysokomolekulární celková
DNA z kuřecích buněk
transfekce tk– kuřecích buněk
HAT-Selection
primární tk+ transfektanti
1. příprava DNA z tk+ transfektantů
2. selekce v mediu HAT
sekundární tk+ transfektanti
příprava DNA
kuřecí DNA
1. štěpení EcoRI
2. cirkularizace, ligace
1. Transformace E.coli
2. Selekce ApR
na rekombinantním plazmidu se
nachází gen tk+ společně s ApR
Vyředí se plazmidy
s neselektovanými
znaky (tj. plazmidy
nevázané s tk+)
Gen tk+ je „označen“
genem ApR
Ca-koprecipitace
17
Selekce úspěšně
transfektovaných buněk na
základě změny jejich
fenotypu
Přenos lidských onkogenů do
myších buněk. Po transfekci
myších buněk DNA získanou
z lidských nádorů se za
několik týdnů objeví malá
ohniska transformovaných
myších buněk. Výsledkem
injikace takových buněk
myším jsou nádory.
18
Vektory pro přenos genů do živočišných buněk
1. Plazmidové vektory („neživé“): plazmid se nereplikuje, vzácně se
začleňuje do genomu buňky
• prokaryotický plazmid + eukaryotická transkripční jednotka +
selekční marker
Využívají se k selekci transfektovaných buněk při kotransfekci a
sledování transientní exprese genů
2. Virové vektory („živé“): kyvadlové vektory, replikující se
v hostitelských buňkách
• část bakteriálního vektoru + sekvence eukaryotických virů +
selekční marker
• vektory odvozené z SV40, bovinního papilomaviru, EBV,
retrovirů, bakulovirů, viru vakcinie, adenovirů aj.
Využívají se ke sledování stabilní nebo transientní exprese genů a
k získávání rekombinantních proteinů ve velkém množství
19
„Plazmidy pSV“Transkripční regulační
sekvence z viru SV40 Kyvadlový vektor
Konstrukce pSV vektorů
Využití pSV: nesou dominantní selekční markery při kotransfekci, (nereplikují se)
Nesou různé
selekční markery
20
Expresní vektor pro savčí buňky
pcDNA3.1/myc-HIS
Pcmv – promotor cytomegaloviru
BGHpA = polyadenylační
sekvence BGH
Neo = rezistence k G418
6 x HIS = purifikace proteinu (tag)
myc epitop = detekce proteinu
protilátkou
T7 – sekvenování inzertu
Sekvence aktivní v E. coli:
AmpR, pUC ori, f1 ori
bakteriální
plazmid
21
Silné promotory: CMV, RSV, SV40, LTR MoMULV – virové – vysoká exprese v širokém spektru
buněk
… ale – umělé vysoká exprese (neoodpovídá (pato)fyziologické situaci) – proto se používají i
promotory genů s živočišných buněk (EF-1, beta-actin, …) nebo i tkáňově specifické promotory a
inducibilní promotory
Sledování transientní
exprese klonovaných
genů, studium jejich
regulace
Expresní vektor pro savčí buňky
(z genu pro globin)
Mutageneze in vitro
22
metalothioneinový promotor – indukce transkripce přidáním těžkých kovů
(Cd, Zn). Až 200násobná indukce.
promotory indukované steroidními hormony- dexametazon na
glukokortikoidový receptor vede k indukci transkripce z MMTV LTR
hmyzí hormony - Ecdysone
Tetracyklin – tet-off, tet-on
Teplota – HSP-70 promotor
FK506/rapamycin
RU486/mifepristone
Hypoxia-inducible gene expression systems – HRE (hypoxia-responsible)
elementy
Inducibilní promotory
23
Sekvence na vektoru zajišťující translaci
• Vznik sekundární struktury v 5´nepřekládáné oblasti mRNA zabraňuje
účinné translaci –
• pravidla Kozakové– sekvence v oblasti AUG: CC(A/U)CCAUGG
• Iniciační kodony uvnitř 5´nepřekládané oblasti snižují účinnost iniciace
translace od správného iniciačního kodonu, zvláště pokud po „upstream“
AUG nenásleduje ve čtecím rámci stop kodon – často je
žádoucí zkrátit 5´netranslatovanou oblast mRNA.
• Sekvence bohaté na AU v 3´netranslatované oblasti mRNA mohou
snižovat její stabilitu
• Kodony lze upravit pro daný hostitelský organismus
K = Kozak-sekvence; S = signální sekvence; T = tag – purifikace proteinu;
P = místo štěpení proteinu – oddělení tag od zralého proteinu; SC = stop kodon
Kozak Sequence
Most eukaryotic mRNAs contain a short recognition sequence that greatly facilitate the initial binding of mRNA to the small
subunit of the ribosome. The consensus sequence for initiation of translation in vertebrates (also called Kozak sequence)
is:ACCATGGMore general it is:(GCC)RCCATGG
where R is a purine (A or G).To improve expression levels, it may be advantageous to design the cloned insert according to
Kozak's rules.
24
25
Savčí expresní vektor – obecná struktura
Hostitelské buňky:
• Pro transientní expresi: COS (opičí fibroblasty imortalizované SV40 Tantigenem),
BHK (baby hamster kidney), HEK (human embryonic
kidney)
• Pro stabilní expresi CHO (chinese hamster ovary)
virový
Hybridní intron (D a A
místa z různých genů)
P, pa, TT = virové n. savčí
bakteriální
Selekční marker
26
heterodimery: human thyroid-stimulating hormone,
tetramery: hemoglobin, protilátky
Možnosti přípravy proteinů tvořených podjednotkami:
1. klonování genů pro podjednotky samostatně a pak jejich spojení
in vitro – nízká účinnost
2. klonování genů ve dvou vektorech v jedné buňce – sestavení
proteinu in vivo – vysoká účinnost
Možné komplikace:
• Ztráta jednoho z vektorů, aktivní protein se nevytvoří
• Různý počet kopií vektorů, jedna z podjednotek je v nadbytku,
výsledného produktu je málo
3. Řešení: Klonování genů v bicistronickém expresním vektoru
Řada komerčně významných proteinů
je tvořena více podjednotkami:
27
Dvouvektorový expresní systém – v jedné buňce
dimerní protein
Ztráta jednoho z vektorů,
aktivní protein se nevytvoří
Různý počet kopií vektorů,
jedna z podjednotek je v
nadbytku, výsledného
produktu je málo
28
Expresní vektor se dvěma klonovanými
geny kódujícími podjednotky heterodimeru
Oba geny jsou
transkribovány
a translatovány
samostatně
29
Bicistronický expresní vektor pro klonování genů
kódujících podjednotky heterodimeru
Jeden transkript
(bicistronický),
translatovaný do
dvou proteinových
podjednotek
IRES = internal ribosomal entry
site – umožňuje simultánní
translaci polycistronické mRNA
některých savčích virů
30
Důkaz začlenění genu pro lidský B-globin
homologní rekombinací – extenzívní postup
Přenos testovacího plazmidu
do somatických buněk v tkáňové
kultuře s cílem detekovat
vzácné buňky, v nichž došlo
k homologní rekombinaci
(1xCO) – ta probíhá s frekvencí
100-1000x nižší než náhodné
začlenění
Dochází k duplikaci
sekvencí, ne záměně alel
Selekční marker
31
Izolace DNA z buněk
Vznik PCR-produktu dokazuje, že gen byl začleněn homologní rekombinací
3 možné
výsledky
primery
nasedají na
vzdálená
místa
Mikroinjekce genu
do ES buňky
Sledování (skríning) způsobu začlenění cizího genu pomocí PCR (bez použití
selektovatelného markeru) (vnášený gen je přerušen inzercí – stačí několik
nukleotidů)
32
Selekce transfektant (ES buněk), v nichž došlo k začlenění
vneseného genu homologní rekombinací (gene knockout)
PNS vektor Substituční vektor pro gen A,
který je přerušen genem neo
a obsahuje HSV-tk
Gen A je inaktivní - vznik nulové mutace
Pozitivní selekce = G418
Negativní selekce = HSV-tk
2000x obohacení
o buňky obsahující
přerušený gen A
HSV-tk = fosforyluje gancyklovir na monofosfát, který je pak buňkou přeměněn na trifosfát – ten inhibuje
DNA-polymerázu a proliferující buňky jsou usmrcovány
buď nebo
33
Náhrada alel v ES buňkách homologní rekombinací
G418 senzitivní
FIAU rezistentní
Linearizovaný vektor
FIAU = deoxyfluoroarabinofuranosyl-iodouridin
PCR – ověření náhrady alely
Gen není přerušen
selekčním markerem
Druhá selekce
Vyředí se – není
schopen se replikovat
„Hit and run“
Selekce buněk, do
nichž se vektor začlenil
50% wt /50% mut.
Homologní recombinace
Intrachromozomální rekombinace
G418 resistant
FIAU sensitive
mutation
tk neo
mutation
První selekce
34
Příklad využití metody „hit and run“ k záměně alel
Do ES myších buněk se do lokusu,
kde se nachází normální gen Kras,
vloží mutantní forma K-ras
(tj. onkogen). Selekce se provádí
na neo. ES buňky jsou pak použity
k přípravě myší.
Spontánní rekombinace mezi
alelami vede ke vzniku buď wt
typu genu, nebo ke vzniku
mutantního genu – onkogenu, což
probíhá v různých tkáních a
pokud vznikne onkogen K-ras,
vyvinou se nádory.
35
Zvyšování
koncentrace
+ metotrexát
Dosažení
vysokého stupně
exprese
koamplifikací
klonovaného genu
spolu s genem
DHFR
36
genom = 5,2 kb kružnicová dsDNA
životní cyklus:
1. V permisivních buňkách (šimpanz) – lytický cyklus
2. V nepermisivních buňkách (myš, křeček) – integrace do genomu,.
přeskupení, transformace buněk
časná oblast = T antigen – replikace, transkripce
pozdní oblast = proteiny kapsidu (VP1-VP3)
Konstrukce vektorů: náhrada časné nebo pozdní oblasti cizími
geny, komplementace chybějících funkcí pomocným virem
nebo pomocnými buňkami (COS)
SV40
VP1,
VP2,
VP3T ag
37
T-ag-defektní
VP
Infekce nových
buněk, vysoká
produkce proteinu
„pBR322“
Vektory s nahrazenou pozdní oblastí
Využití: Studium genové exprese, regulace,
posttranskripčních úprav atp, tvorba proteinů
DNA SV40 izolovaná z
virových částic, nebo
klonovaná v plazmidu
Komplementace
funkcí obou virů
(případně Ts)
38
Příprava COS buněk
CV-1 Origin of SV40
Náhrada časné
oblasti SV40
genem Ha viru
chřipky
Rekombinantní
virus
konstitutivní exprese
Rekombinantní
molekuly se obalují
– malá klonovací
kapacita
39
Rekombinantní molekuly
se neobalují – velká
klonovací kapacita
transientní exprese
Indukce exprese (replikace)
klonovaných genů regulací
exprese genu pro T antigen
(časný promotor):
• Tag (ts)
• Tag pod kontrolou jiného
promotoru (metalothionein)
Expresní kyvadlové
vektory na bázi plazmidů
(obsahují oriSV40)
Po transfekci COS buněk
se cizí geny replikují ve
velkém počtu kopií, pokud
jsou klonovány v plazmidu
s SV40 počátkem. Velký
počet kopií dovoluje
účinnou transkripci cizího
genu.
40
AUG
1
2
1 + 2
Živé vakcíny
Klonování do BamHI
Konstrukce infekčních
rekombinantních virů
vakcinie exprimujících
HBsAg viru chřipky
Env viru HIV a HTLV-III
Sag viru hepatitidy B
Ag viru vztekliny
Virus vakcinie
• 187 – 300 kb
• izolovaná virová DNA je
neinfekční
• vlastní aparát regulace
transkripce
• replikace a transkripce
DNA v cytoplazmě
• vnášení cizích genů
homologní rekombinací
in vivoKlonovaný gen pro
HBsAg určený
k expresi (konstrukt
připravený v E. coli)
selekce
41
Začleňování cizích genů do DNA viru vakcinie
homologní rekombinací
Gen kódující antigen je začleněn za
promotor genu viru vakcinie a vložen
do plazmidového vektoru tak, že
přerušuje sekvenci neesenciálního
genu viru vakcinie (např. gen pro Tk)
Tento plazmid se přenese
transformací do živočišných buněk
Tk- pěstovaných v kultuře (kuřecí
embryonální fibroblasty), které byly
předtím infikovány virem vakcinie
standardního typu, který tvoří funkční
Tk.
Homologní rekombinací dojde
k začlenění genu pro antigen do genu
Tk viru vakcinie. V buňce pak není
žádný funkční gen pro Tk a buňky lze
selektovat v prostředí s BUdR.
Konečná selekce (ověření) se
provede hybridizací pomocí sondy
specifické pro cizí gen.
+ selekční
marker
(neoR) navíc
- vzhledem ke
spontánním
mutacím
Tk+ Tk-
42
Systém pro snadnou selekci rekombinantních virů vakcinie
(nevyžaduje selekční látku, není nutné přerušit žádný virový gen)
A. Úsek genomu viru obsahující
gen vp37, který je zodpovědný
za tvorbu plak na monovrstvě
buněk in vitro
B. Úsek genomu mutantního viru,
v němž byl gen vp37 nahrazen
markerovým genem z E. coli
(gpt, lacZ…) pod kontrolou
silného virového promotoru
(p7.5). Tento virus netvoří
plaky, neboť neobsahuje vp37
C. Vektor obsahující MCS, do
něhož se vloží gen zájmu.
Homologní rekombinace mezi
hraničními sekvencemi (flank)
na vektoru a na genomové
DNA mutantního viru vede
k současnému začlenění genu
vp37 a genu zájmu. Virus tvoří
plaky ~ selekce
vektor
virus
Silný vakciniový
promotor virus, který tvoří plaky, nese cizí gen.
43
Vektorový systém
odvozený od viru
vakcinie
Buňky z pacienta
s CF – defekt
v transportu iontů
V buňkách se tvoří
T7-RNA-polymeráza,
která aktivuje T7
promotor a dochází k
expresi klonovaného
genu Virus zastavuje syntézu
proteinů hostitelské buňky,
až 30% mRNA v buňce
tvoří CF-mRNA, která je
preferenčně translatována
1. Infekce buněk virem
vakcinie produkujícím
T7-RNA-polymerázu
2. Infekce vektorem
s klonovaným genem
(CF) pod kontrolou
T7-promotoru
• široké rozmezí hostitelů
44
• je možné vakcinovat proti několika infekcím současně – do vektoru
se umístí geny pro různé antigeny pod kontrolou různých
vakciniových nebo jiných virových promotorů (aby nedocházelo
k homologní rekombinaci a ztrátě genů), a výběrem promotorů lze
časovat expresi genů (časné x pozdní – ovlivňuje míru exprese).
Živá vakcína má tyto výhody oproti usmrceným virům nebo
podjednotkovým vakcínám:
• virus exprimuje autentický antigen způsobem, který se podobá
přirozenému
• virus se replikuje, antigenu přibývá, aktivují se B a T buňky.
Nevýhoda: u imunosuprimovaných pacientů může vakcinace navodit problémy, do
viru lze ale přidat gen pro interleukin 2, který zesiluje činnost T-buněk a tak
snižuje množení viru.
Již klonované antigeny: vzteklina, hepatitida B, chřipka, HSV, virus
stomatitidy.
Používání a výhody vakcinia viru
45
Klonování genů ve vektorech odvozených z bakulovirů
polyhedrin
Spodoptera frugiperda
(můra)
Autographa californica
(ploštice)
Bombyx mori
Bourec morušový
Lidský INF-α
Transferový vektor
1 mg na
106 buněk
Virová DNA
linearizovaná
RE
Fúzní nebo
nefúzní proteiny
pUC
1
2
46
Příprava rekombinantních bakulovirů
Do genů 603 a 1629 (který je
nutný pro replikaci viru; geny
ohraničují gen pro polyhedrin),
se vnesou místa pro RE Bsu361.
Působením Bsu361 se vyštěpí
segment s genem pro polyhedrin
a DNA bakuloviru se vnese spolu
s transferovým vektorem do
hmyzí buňky, kde dojde
k homologní rekombinaci za
vzniku rekombinantního
bakuloviru s funkčním genem
1629.
Většina potomstva bakulovirů je
rekombinantní (až 99%).
p a t z genu pro polyhedrin
Selekce není nutná, rostou jen
rekombinantní viry
47
Spodoptera frugiperda
Insecta: Lepidoptera: Noctuidae
(Subfamily Amphipyrinae, Tribe Amphipyrini)
48
Příklady rekombinantních proteinů připravených v bakulovirových expresních systémech¨.
HIV-1, human immunodeficiency virus type 1; HSV, herpes simplex virus.
α-Interferon G-protein-coupled receptors Malaria proteins
Adenosine deaminase HIV-1 envelope protein Mouse monoclonal antibodies
Anthrax antigen HSV capsid proteins Multidrug transporter protein
β-Amyloid precursor protein Human alkaline phosphatase Poliovirus proteins
β-Interferon Human DNA polymerase α Pseudorabies virus glycoprotein 50
Bovine rhodopsin Human pancreatic lipase Rabies virus glycoprotein
Bluetongue virus neutralization
antigen
Influenza virus hemagglutinin Respiratory syncytial virus antigen
Cystic fibrosis transmembrane
conductance regulator
Interleukin-2 Simian rotavirus capsid antigen
Dengue virus type 1 antigen Lassa virus protein Tissue plasminogen activator
Erythropoietin
49
Alternativní způsob přípravy rekombinantních
bakulovirových vektorů - bacmidů
• Expresní kazeta se vloží místně-specifickou transpozicí do
bakulovirového kyvadlového vektoru (bacmidu). Bacmid, který se
replikuje v E. coli jako velký plazmid, obsahuje úplný genom
bakuloviru (bez PH), nízkokopiový počátek replikace z F plazmidu a
att místa pro transpozon T7.
• Rekombinantní bacmid se připraví transpozicí modifikovaného
transpozonu T7 z donorového plazmidu, který obsahuje cílový gen
určený k expresi, do att míst na bacmidu (je vyžadován pomocný
plazmid kódující transponázu).
• Rekombinantní bacmid je pak izolován z E. coli a přenesen
transfekcí do hmyzích buněk.
50
Konstrukce rekombinantního bacmidu
Začleněním plazmidu do genomu
bakuloviru (2xCO) vzniká kyvadlový
vektor (E.coli+ hmyzí buňky)
Autographa californica multiple nuclear polyhedrosis virus
Transpoziční funkce pomocného
plazmidu umožní transpozici úseku
donorového plazmidu obsahujícího
gen zájmu (GOI), který je pod
kontrolou bakulovirového promotoru
a terminátoru (p a t).
Rekombinantní bacmid má
přerušený gen lacZ´. Buňky E. coli
obsahující rekombinantní bacmid
nejsou schopny tvořit funkční galaktozidázu
(bílé kolonie).
Úseky ohraničující gen
pro polyhedrin
51
1. Infikují široké spektrum buněk živočišných druhů a různé typy
lidských buněk
2. Infekce vede k integraci virového genomu do genomu
hostitelské buňky – místo integrace je libovolné (přednostně
v transkripčně aktivním chromatinu)
3. Infekce retrovirem nemá za následek smrt buňky, často vede
ke stálé produkci nových virionů
4. Retroviry nesoucí onkogeny lze využít k infekci buněk různých
tkání, čímž lze získat permanentně transformované buněčné
linie – onkogenní retroviry = přirozené vektory
5. Nevýhodou je schopnost retrovirových vektorů aktivovat
transkripci genů sousedících s místy jejich začlenění
Retroviry a retrovirové vektory
52
• Virová RNA vstupující do buňky je doprovázena RT a integrázou,
zabalenou do virionu
RT spolu s RNázaH aktivitou přepíše RNA do cDNA, pak do dsDNA. Tato
kopie DNA, zvaná provirová DNA, je mírně delší než RNA díky
duplikacím koncových sekvencí během procesu konverze RNA na DNA
• Provirová DNA se cirkularizuje a pomocí integrázy se inzertuje do
genomu. Do genomu se obvykle integruje jen jedna nebo málo kopií,
místa integrace jsou náhodná (preferenčně do transkribujících se oblastí)
• V LTR sekvenci je silný promotor pro RNA polymerázu II
• Provirový genom má tři geny: gag, pol, env, které jsou transkribovány a
translatovány do prekurzorových proteinů, které jsou proteolyticky
štěpeny za vzniku zralých proteinů.
• Transkripty plné délky se zabalují do částic viru. Důležité je místo psi –
pro interakci virové RNA s proteiny, sestavení virionů probíhá v buněčné
membráně, viry pučí z buněk, nedochází k lyzi buněk
Životní cyklus retrovirů
53
Výhody:
• vysoká účinnost přenosu genů
• dobře prostudovaný systém
• klonovací kapacita až 8 kb (i více)
• integrace vektoru do genomu, stabilní začlenění genu a jeho
permanentní exprese
Nevýhody:
• infikuje jen dělící se buňky (výhoda v GT) x lentiviry: i nedělící se b.
• nízké titry rekombinantního vektoru
• náhodná integrace do genomu – inaktivace genů n. aktivace
endogenu
Vektory odvozené od retrovirů
54
Replikace, transkripce
Defektní virový genom = nová transkripční
jednotka v genomu hostitelské buňky
Sekvence in cis nezbytné pro
transkripci, replikaci a obalování:
• LTR: integrace DNA do genomu,
transkripce
• PBS (primer binding site):
reverzní transkripce,
• ψ (psi) místo: obalování RNA
Příklady konstrukce retrovirých vektorů
ATG
marker
351 bp lacZ, neo, gpt, aj.
55
Transfekce rekombinantním retrovirovým vektorem
do buněk produkujících viriony pomocného viru
Molekuly RNA vzniklé
transkripcí DNA integrovaného
rekombinantního
vektoru a proviru pomocného
viru se obalí proteiny,
které jsou kódovány tímto
provirem. Tvoří se viriony
pomocného a
rekombinantního viru.
V úspěšně infikovaných
cílových buňkách se
exprimují geny
rekombinantního
retroviru. Oba typy virů
jsou produkovány
cílovými buňkami.
56
MoMuLV = Moloney Murine Leukemia Virus
Schéma přípravy linie pomocných buněk Ψ2
Pomocný virus
57
Pomocná buňka
Příprava čisté linie rekombinantních retrovirů
Rekombinantní virus je
trvale začleněn do genomu
58
Využití
retrovirových
vektorů pro
stabilní expresi
cizorodých
genů
Klonování retrovirových
sekvencí do plazmidu,
vytvoření kyvadlového
vektoru, klonování v E. coli
Rozmezí hostitele –
pseudotyp viru
amfotropní MuLV –
široké rozmezí
hostitele, včetně
lidských buněk
Genomová DNA
mRNA
cDNA
sestřih
neoR
částice viru s RT
59
Lentivirové vektory – přenos genů do nedělících se buněk
Odvozeny od HIV, BIV, EIAV, FIV, SIV
genom lentivirů
Nese gen
zájmu
Určuje rozmezí
hostitele
Zabaluje gen
zájmu a vytváří
virové částice
60
Přenos genů lentivirovým vektorem (systém obsahující 3 plazmidy)
HEK293T = pomocné
buňky (packaging cell line)
Systém založen na třech
plazmidových konstruktech:
1. Klonovací (přenosový)
2. Obalovací (vytváří env)
3. Zabalovací
Třetí generace
Druhá generace
61
To act as a suitable vehicle for delivery, the coding regions of the lentivirus are removed. The vector
consists of the Long-Terminal Repeats (LTR) and the packaging signal psi that permits packaging
Helper plasmids, transfected together with pLKO.1, provide the viral genes (gag, pol and env) needed for
the production of the viral particles. The use of different env-genes enables modification of the viral
tropism depending on the target cells to be infected.
shRNA = short
hairpin RNA –
funkčně analogická
miRNA, navození
RNAi
62
Table 15.2 High-level expression systems in animal cells
Host cell Mode of transfer Applications
*The recombinant vaccinia virus expresses T7 RNA polymerase in the host cell.
Target genes are constructed by linking to T7 promoter and terminator regions.
When cells are infected by the recombinant vaccinia virus, and transfected with
plasmid containing the target gene, the target gene is expressed at a very high level