Živočišné buňky (komentáře)    Stránka 4  Živočišné  buňky  obvykle  přijímají  cizorodou  DNA  ochotně  (ale  ne  vždy  –  primární  buňky  vs.  ustanovené linie, adherentní vs suspenzní buňky, …). Začlenění  většinou náhodně ale i homologní  rekombinací (lze vyselektovat – viz dále). Dráhy vlevo ukazují transfekci v tkáňových kulturách. Dráhy  vpravo přípravu transgenního živočicha – využití zárodečných buněk    Stránka 5  Původně se používaly metabolické markery (TK, XGPRT, HGPRT). Nyní se častěji využívají antibiotika.  Hojně je používaný G418. Z metabolickych se používá hlavně XGPRT. Některé geny i jiné využití než  selekce.   Např. DHFR – pro amplifikaci klonovaných genů (viz dále)    Stránka 7  Používaji se markery u buněk, jež mají poškozenou některou z drah zajišťující biosyntézu nukleotidů  za standardních podmínek.  U těchto buněk pak selekčním činidlem zablokujeme alternativní dráhu  (případně dodáme i výchozí substrát).  HAT medium – aminopterin potlačí syntézu purinu i pyrimidinu, thymidin s TK nahradí pyrimidiny,  hypoxantin  je  zdroj  purinu  (medium  XAT  –  místo  hypoxantinu  se  použije  xantin),  lze  využít  i  mykofenolovou kyselinu jak selekční činidlo a XGPRT jako dominantni selekční marker. Některé formy  HGPRT (a Ecogpt) umí metabolizovat Xantin na XMP.    Stránka 9  Transientní exprese se využívá tehdy, pokud chceme studovat fungování nějakého genu, stačí nám k  tomu  relativně  krátká  doba;  obvykle  se  transientní  exprese  provádí  po  vnesení  genů  na  nějakých  vektorech, které se v těch buňkách nereplikují (po určité době z buněk mizí), ale udrží se tam až 48‐ 72 hodin, což stačí na analýzu. Pro stabilní transfekci potřebujeme selektovat buňky, do kterých se  transgen  začlenil  trvale.  Pozor  na  určitá  omezení  při  využití  selekce  ‐  začlenění  transgenu  do  heterochromatinu, poškození genu zájmu při začlenění (selektujeme na marker a ne na gen zájmu),  atd.        Stránka 11  S procesem přenosu cizorodé DNA do buněk však může být spojena celá řada nespecifických efektů,  z nichž  ty  nejznámější  jsou  znázorněny  na  tomto  schématu.  Výsledkem  je  pak  vlastně  vznik  komplexního buněčného fenotypu (stránka 12).    Stránka 14  Nosičová DNA – používala se na zvýšení účinosti transfekce – př. Salmon sperm DNA, herring sperm  DNA  a  zároveň  na  snížení  vstupního  množství  plazmidu,  také  snížení  artefaktů  spojených  s  příliš  velkou expresí cílového genu z plazmidu …    Stránka 16  metoda je použitelná obecně; cílem izolovat funkční gen pro tk (tymidinkináza), z buněk, které jsou  tk+ se izoluje genomová DNA, ta se naštěpí náhodně na fragmenty, některé z fragmentů ponesou gen  pro  tk,  potom  se  do  buněk,  které  jsou  tk‐  vnese  jednak  soubor  fragmentů,  dále  pak  rozštěpený  plazmid,  který  bude  „zachraňovat“  gen  pro  tk,  tento  plazmid  má  rezistenci  k  amp;  v  buňkách  tk‐  dochází  k  tomu,  že  se  fragmenty  náhodně  spojují  s  molekulami  plazmidu,  vznikají  primární  transfektanti  ‐  obsahují  fragmenty  z  kuřecích  buněk,  navíc  ještě  mohou  obsahovat  plazmid  (samostatně nebo v konkatemeru); u primárních transfektantů problém v tom, že ne vždy je gen pro  tk spojen přímo s plazmidovou DNA. Proto se celý postup opakuje, vznikají sekundární transfektanti  (zvýšení  šance,  že  selektujeme  klony,  kde  plasmid  bude  přímo  spojen  s  TK)  –  vyředí  se  plazmidy  nespojené přímo s TK genem    Stránka 17  Příklad izolace genů se snadno selektovatelným fenotypem.    Stránka 19  vycházelo  se  z  jednoduchých  plazmidů  jako  pBR322,  amp  rezistence,  počátek  replikace,  bez  problému  se  replikuje  v  E.  coli,  tento  plazmid  byl  spojen  se  sekvencemi  pocházejícími  z  genomu  opičího  viru  SV40  a  to  z  toho  důvodu,  že  právě  z  tohoto  viru  byla  převzata  celá  řada  regulačních  sekvencí; jednak to byl počátek replikace (ori SV40), dále promotor T‐antigenu, intronová sekvence ‐  introny se používají z toho důvodu, že se zjistilo, pokud je klonován eukaryotický gen, k jeho expresi  dochází  mnohem  účinněji,  když  je  poblíž  genu  začleněn  intron;  eukaryotické  geny  mají  sice  své  introny, ale protože jsou dlouhé, často se vnáší do vektorů cDNA, která už introny nemá; používá se  také polyA signál viru SV40. Nakonec se přidá nějaký eukaryotický selekční marker. Z těchto vektorů  byla zkonstruována celá řada expresních plasmidů.    Stránka 23 a 24  Součástí sekvence mohou být i ty, jež se využívají pro odštěpení koncové značky – toho se využívá  například po purifikaci proteinů, kdy při následující charakterizaci vlastností proteinu nechceme, aby  přítomnost této značky ovlivňovala vlastnosti proteinu – příklady těchto sekvencí jsou na stránce 24.    Stránka 25  P = promoter, TT = terminátor transkripce, pa = polyadenylační signál    Stránka 30  Netřeba znát    Stránka 31  Tento postup nahrazuje postup na straně 30    Stránka 32  PNS  =  pozitivně/negativní  selekce  –  metoda  selekce  buněk,  u  kterých  došlo  k  začlenění  pomocí  homologní rekombinace, nejprve selektujeme na geneticin buňky, kde došlo k začlenění konstruktu  (kamkoli),  následuje  druhá  selekce  gancyclovirem,  buňky  jež  přežijí  nemají  gen  pro  TK  (TK  metabolizuje  gancyclovir  na  toxický  produkt)  a  tedy  pravděpodobně  k začlenění  došlo  homologní  rekombinací     Stránka 33  Použití například pro náhradu mutantní alely alelou standardní. Gen, který se vnáší není genem neo  (rezistence ke geneticinu) přerušen. Vektor se nejprve linearizuje ‐ linearizuje se ve sledovaném genu  zájmu; linearizace molekul upřednostní místo začlenění ‐ lineární konce jsou tzv. rekombinogenní,  vyhledávají komplementární sekvence; celý konstrukt se začlení do vyznačeného místa, buňky u nichž  došlo  k začlenění  selektuji  geneticinem,  následně  kultivuji  buňky  bez  selekčniho  tlaku  a  intrachromozomalni  rekombinaci  nebo  výměnou  sesterských  chromatid  se  vyčlení  jedna  z  těch  variant  (vyselektuji  buňky  rezistentní  na  FIAU)    ‐  buď  mutantní  nebo  standardní  gen,  následně  provedu sekvenaci a vyberu ty buňky, jež mají požadovanou nahrazenou formu genu  FIAU – po metabolizaci TK toxický      Stránka 35  marker  DHFR  –  enzym  účastnící  se  biosyntézy  nukleotidů,  selekční  látkou  je  metotrexát,  když  se  vnese  gen  do  buněk  na  vektoru  s tímto  markerem  a  buňky  se  vystaví  postupně  se  zvyšujícím  koncentracím  metotrexátu  ‐>spontánní  amplifikace  genu  DHFR  a  s ním  i  genu  zájmu  ‐>  tím  je  transgen  amplifikován  ‐>  tady  je  možno  dosáhnout  mnohonásobku  amplifikace  ‐>  velmi  zvýšená  produkce proteinu    Stránka 37  původní systém obnášel dvě molekuly vektorů; vlastní klonovací vektor (gen zájmu nahrazuje pozdní  oblast) a pomocný vektor (defektní časná oblast); výsledkem je smíšené potomstvo virů (polovina  obsahuje gen zájmu, polovina pomocný vektor), touto populací virů infikujeme cílové buňky a v nich  se produkuje gen zájmu     Stránka 38   COS buňky – trvale produkují T‐antigen, používaji se pro produkci virových částic z vektorů, kde gen  zájmu nahrazuje časnou oblast, poměrně nizká klonovací kapacita    Stránka 40  Virus kravských neštovic, vektory používané k vakcinaci, široké rozmezí hostitelů, velký genom (nelze  jej  modifikovat  klasickými  metodami  v E.  coli),  proto  se  využívá  začleňování  genů  homologní  rekombinací. Nejprve se připraví kyvadlový vektor v buňkách E. coli,  z viru vakcinie má pouze malou  část ‐ promotor a gen pro tk. Transgen vložen do klonovacího místa (BamHI), vzniká rekombinantní  molekula,  kde  mezi  úseky  genu  pro  tk,  je  vložen  gen  zájmu.  Do  buněk  se  vnese  současně  tento  konstrukt  a  současně  se  buňky  (TK‐)  infikují  virem  vakcinie  stand.  typu.  Pokud  dojde  k homologní  rekombinaci,  vznikají  virové  částice  bez  funkčního  genu  TK  (takové  buňky  lze  selektovat).  Virové  částice purifikujeme a můžeme použít pro produkci cílového genu nebo jako živou vakcínu.    Stránka 44  živá vakcína je vlastně rekombinantní virus nesoucí antigeny     Stránka 45  Bakuloviry jsou obalené viry z čeledi Baculoviridae, s genet. informací v dvouvláknité, kruhové DNA.  Rozmnožují  se  výhradně  v  bezobratlých  a  byly  izolovány  z  více  než  200  druhů  hmyzu,  roztočů  a  korýšů. Virová infekce se projevuje zejména v larválním stadiu živočichů (polyedrie). V napadených  buňkách  tvoří  inkluze  složené  z  jedné  nebo  více  virových  částic  tvaru  tyčinek.  Polyhedriny  jsou  obalové proteiny těchto virů.  Schéma  ‐  vnitřní  část  (modrá)  se  zamění  za  gen  zájmu  (zelená)  v  plazmidu;  buňky  se  infikují  bakulovirem  a  zároveň  se  transfekují  rekombinantním  plazmidem;  uvnitř  buněk  proběhne  rekombinace,  vytvoří  se  rekombinantní  viry,  které  budou  obsahovat  místo  genu  pro  polyhedrin  cizorodý gen ‐ rekombinace nemusí proběhnout 100%, je potřeba mít selekční systém ‐ liší se plaky,  které vytváří viry standardního typu, jež tvoří polyhedrin, a rekombinantní plaky, které polyhedrin  nevytváří     Stránka 46  Vylepšení  systému  ze  strany  45.  Bez  homologní  rekombinace  nedojde  k obnově  pro  život  viru  důležitého genu 1629.    Stránka 47  K produkci bakulovirů se používají mimo jiné buňky z larev této Spodoptery.    Stránka 48  Hmyzí buňky jsou schopné provádět složité posttranslační modifikace – vliv na funkci proteinů.    Stránka 50  bacmid ‐ kyvadlový vektor pro E.coli a hmyzí bunky      Stránka 53  Klonovaci kapacita ‐ souvisí s velikostí RNA, která se může do virové kapsidy zabalit (max. 9, někdy 10  kb); i když eukaryotické geny bývají větší, lze klonovat cDNA bez intronů, čímž je ten limit dostatečný    Stránka 54  LTR obsahují silné promotory, vektor A má omezenou klonovací kapacitu, vektory B a C potřebují  k tvorbě virových částic transfekci/infekci pomocnými vektory      Stránka 45  Vede ke vzniku smíšeného potomstva (vznikají pomocné i rekombinantní viry)    Stránka 56, 57, 58  Problém vzniku směsné populace virionů vyřešen zde. Pomocná buněčná linie produkuje RNA viru,  která  se  však  díky  mutaci  ve  sbalovacím  místě  nemůže  sbalit.  Ostatní  geny  se  však  normálně  produkují. Tuto buňku lze transfekovat rekombinantní DNA s virovou sekvencí, kde oblast mezi LTR  sekvencemi  je  nahrazena  genem  zájmu  a  selekčním  markerem.  V buňkách  pak  vznikají  pouze  rekombinantní virové částice, které lze použít pro infekci jiných buněk a produkci cílového proteinu.  Celkové schéma je znázorněno na stránce 58.    Stránka 59  Z důvodu bezpečnosti se lentivirové vektory klonují ve 3 či 4 odělených vektorech (DNA nemůže být  mobilizována).    Stránka 61  Vektory lze využít nejen pro produkci proteinů, ale také pro regulaci produkce proteinů /například  díky RNA interferenci).