Mutageneze in vitro site-directed mutagenesis místně cílená (řízená) mutageneze lokalizovaná mutageneza, řízená evoluce reverzní genetika*, genetika „naruby" klasická genetika DNA (genotyp) ' fenotyp reverzní genetika * Reverzní genetika - „vypínání genů" navozování nuíových mutací genů nebo potlačování jejich exprese (knokauty genů, transpozonová inzertní mutageneze, knockdown - umlčování genů pomocí anti-sense RNA, RNAi, CRISPR/Cas aj). 1 Princip mutageneze in vitro Mutace se vnášejí do izolované DNA (= in vitró) Typy mutací: substituce, delece, inzerce Cíle: Výzkum: • Analýza vztahu mezi strukturou a funkcí NK • Objasnění funkce genů a regulačních oblastí Praxe: • Cílené změny aminokyselin v proteinech - příprava proteinů s novými (lepšími) vlastnostmi (proteinové inženýrství) • Příprava geneticky modifikovaných a transgenních organismů 2 Nevýhody klasické mutageneze (chemické, fyzikální, biologické mutageneze) 1. V organizmu může být zmutován kterýkoliv gen - necílené působení mutagenu; mutaci nelze cílit na konkrétní sekvenci 2. Frekvence mutací v žádaném genu může být nízká - závislost na charakteru působení mutagenu a konkrétní sekvenci 3. Žádaný fenotyp může být výsledkem mutací v různých genech - řada znaků je výsledkem působení více genů Mutageneze in vitro - prístupy Mutageneze in vitro náhodná manipulace s restrikčními místy inzerce linkerů chemická mutageneze inkorporace chybných bazí řízená evoluce vyhledání genu nebo funkčních oblastí na DNA mutace i 11 GEN + cílená (zavedení mutace do konkrétního místa) oligonukleotidová mutageneze syntéza genů (kazetová mutageneze) záměny bazí nebo delších sekvencí, změny kodonů, cílené změny struktury a funkce proteinů 4 Obecná strategie při mutagenezi in vitro Plosmld DNA Alternativa ke klonování genů ve vektorech = PCR Mutation Culture all colonies together Přenos do E. coli, selekce kolonií AmpR Grow colony Isolate plasmid DNA A mutant plasmid Skríning nebo selekce a testování funkce 1. Klonování genu (sekvence DNA) určeného k mutagenezi 2. Vlastní proces mutageneze in vitro 3. Selekce klonů obsahujících mutované geny (sekvence) 4. Stanovení pozměněné funkce mutovaných genů 5. Ověření charakteru vnesené mutace (stanovení sekvence) Stanovení sekvence pozměněného genu Test for function using genetic screen or selection Klonování genu Neznám sekvenci genu - 3 základní přístupy funkční klonovam - testuji funkci genu (pr. prohledávaní genové knihovny) poziční klonování - identifikace genu na základě znalosti jeho lokalizace (vazebné mapování, hybridizace se sondou - chromozom) -genová knihovna využití bioinformatiky pro hledání homologií Klonování genu Znalost genomu - bioinformatika, PCR, DNA klonování í f —, V i Reštrikční endonukleázy - POZOR - většina vyžaduje přesah pro účinné štěpení l— mcs —i F Mtjrr: o nl A (PC R-ampliriod of annealod oligoS) Dtgested Fragment A https://international.neb.com/tools-and- resources/usage-guidelines/cleavage-close-to the-end-of-dna-fragments DNA llgas* Bose Pwrg, froTD,-. r„i 3Ďp 4bp Bamm + +++ BitnHMiFO t + +++ Bůsl-WF* *** .** 44+ Bcll-HF *: - ■*++ +++ Bglll ** - +++ +++ ■Ml *** *»• *** Bmň-nfť ■M-* *++ +++ Bsal +++ +++ +++ +++ +++ BsiWI BSlWI-HF* *+* +++ BamBt -M-+ *++ +++ SsrCl +++ +++ ■*++ +++ kriui f* *** +*+ B4EZ17I-HF* +■ +*+ +++ +++ I 8 Golden gate klonování Restríční endonukleázy Iis Type II enzyme Type Ms enzyme nnnnnr^Hinnnnnni' ii! i v A A Í Přečnívající konce jakékoli Scarless cloning (rozpoznávací místo nebude součástí výsledné sekvence) Štěpení i ligace v jedné reakci (self-ligované molekuly se znovu rozštěpí) Spojení více fragmentů dohromady (různé lepivé konce) Bbsl Bsal BsmBI Sapl 5' . . .GAAGAC(N)2 • • • 3' 3' . . .CTTCTG(N)6. . . 5' 5' . . .GGTCTC(N)i. . . 3' 3' . . . CCAGAG (N) s. . . 5' 5' . . .CGTCTC(N)i. . . 3' 3' . . .GCAGAG(N)s. . • 5' 5' . . .GCTCTTC(N)i. . . 3' 3' . . .CGAGAAG(N)4 . . . 5' GGTCTCN 6501 CCAGAGtL^ PCR-linearized destination vector PCR product 10 TOPO klonování Topoizomeráza I izolovaná z Vacci ni a viru Štěpí dsDNAv sekvenci 5'- (C/T)CCTT-3' Kovalentní vazba na 3' konec Spojení s komplementárním 5' koncem Backbone Nevyžaduje žádné úpravy PCR produktu (Taq polymeráza zanechává na 3'konci jeden A) Vektory s kovalentně navázanou Topo I lze zakoupit Stačí přidat PCR produkt „ligace" 5 minut Perform PCR with Taq or a proufroading polymerase. 1. Add 1 jjLoíPCR reaction to 1 ul_ £. IncubateS minal of TOPO cloning vector, room temperature. PGR pradúci Ruzne modifikace systému (i tupé konce) 3. Transform the competent E c-o/i provided, Sequence and ligation independent cloning (SLIC) ■ Využívá exonukleázovou aktivitu T4 DNA polymerázy k tvorbě 10-12 bp přesahujících konců ■ V reakci pouze jeden typ dNTP - na něm se exonukleázová/polymerázová funkce T4 DNA polymerázy zastaví Speciání vektory Po transformaci v baktériích se ty jednořetězcové zlomy spojí i spojení více inzertů E.coli schopná opravit i nedokonalé spojení jeli překryv dostatečně dlouhý (20-60 bp) PGR product start Insert stop 5' GACGACGACMGATG,..sense,-,TAACCGGGCTTCTCCTC3' 3 ŕ C TGCTG CTG T TCTAC. ..anti. . . .ATTGGCCCGAAGAGGAG 51 T4 DNA polymerase + cl ATP T4 pol-treated 5 - GACGACGACAAGATG . .. sense. . . TAA3 ■ PC R product T4 pol-treated linearized vector C 3*AC.++antí+,,«ATTGGCCCGAAGAGGAG51 + C-AT CCGGGCTTCTCCTCA c:T.v;:T"C?ncTCTTCT T 3 Recombinant plasmid before transformation C GňTfth^ďčš&itiSijéitq. . .sense. 12 Gene 1 Gene 2 Gene 3 Gene 4 PCR amplification I T4 digestion/ dCTP treatment I + linearized/digested vector Transformation/ repair I íří Gen ccdB Kóduje inhibitor DNAgyrázy - její inhibice vede ke smrti bakterií E coli Transcription or replication využiti pro selekci pozitivních klonu ccdA -antitoxin ccdB - transkripční represor ccdB - vazba na CCDB protein - inhibice funkce CCDB CCDB - rezistentní kmeny E. coli (mutace v DNA gyráze) Gateway klonování Integrace/excize DNAfága lambda do/z bakteriálního genomu Rekombinace attB Integration Excision B. coli genome attL Lambda phage attfí ■ 2 reakce ■ 2 rekombinázy Různé antibiotické rezistence na Entry a Destination vektorech ■ Transformace do CCDB-senzitivních kmenů ■ Výhoda - rychlost, variabilita vektorů, vysoká účinnost klonování 16 BP Reaction attRl BttR2 Gibson assembly Exonukleáza 5' - 3' (neinhibuje činnost polymerázy) Polymeráza v jedné reakci při jedné teplotě, scarless ■ DNA ligáza ^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^m 3» DNA fragments from PCR, with double ^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^m 5' stranded homologous region 3' ^^^^^^^^^^^^^^^^^^^m Exonuclease chews 5'-3'T creating a single * stranded complementary region. j Single strand region anneals Přesahy 15-40 bp i více fragmentů Gaps are filled with polymerase and ligase ■ napr. priklonovanf dlouheho tagu, fuzni geny . B DNA inserts with 15-20 bp overlapping ends (PCR-amplilied) Incubate at 50C tor 15-60 minutes NEB Gibson Assembly Cloning Kit {NEB #E5510) ' Gibson Assembly Master Mix (NEB 0E2611) ■ NEB5-alpha Competenl E. coti (NEB JCC2967) Single-tube reaction * Gibson Assembly Master Mix - 5' exonuclease - DNA polymerase - DNA hgase Transformation and plating 18 Gibson assembly ■ Obdobné způsoby klonování In fusion cloning (TaKaRa) Cold Fusion Cloning (System Biosciences) NEB HIFI DNAAssembly (NEB) Způsoby používané při mutagenezi in vitro 1. Manipulace s restrikčními místy a enzymatické úpravy DNA 2. Oligonukleotidová mutageneze (extenze primem) 3. Chemická mutageneze 4. Kazetová mutageneze 5. Metody založené na PCR 6. Mutageneze pomocí supresorových tRNA Vytváření mutací v restrikčním místě Štěpení EcoRI S1 nukleáza / Exonukleáza Exolll -rozsáhlejší delece ( DNA ligáza DNA polymeráza + dNTP í Výběrem konkrétních dNTP lze dosáhnout inzerce pouze určitých bází Delece 4 bp Inzerce 4 bp +dGTP,+dATP,-dCTP, -dTTP ACTCAATCTGA TGAGTTAGA 21 Inzerční mutageneze pomocí linkerů k vyhledání funkčních oblastí transpozonu Soubor náhodně linearizovaných molekul Vložený linker inaktivuje různé geny Transposon AmpR DNose I Mn2+ iôns štěpení rekombinantní DNA na různých místech molecules Připojení EcoRI-linkerů (= vložení inzerce inaktivující zasažený gen) Introduce into f. coli Test (or transposition Selekce klonů se ztrátou transpoziční aktivity, např. vyhledání genu pro transponázu (nebo oblasti transpozonu, která je pro transpozici nezbytná) Chemická mutageneze bisulfitem (hydrogensiŕičitan sodný) Príprava ssDNA Plazmidová dsDNA Cyíosine Uracil O Bisulfite hT H C U T 1 1 1 G A A GC AT Uracil V Připojení primeru Proti U je začleněn A Odstranění poškozeného vektoru Cytoiíne Single-stranded DMA (í Vložení inzertů do nového vektoru Knihovna klonů obsahujících mutované inzerty Působení bisulfitem Mixture of mod i Red plasm ids DNA polymeráza, dNTP, replikace Vyštépení mutovaných inzertů (Hindlll-EcoRI) Mutageneze pomocí mutagenních oligonukleotidů 1. Klonování sekvence (genu) do vhodného vektoru (M13, fágemid, fasmid), izolace jednořetězcové formy rekombinantní DNA 2. Příprava syntetického (mutagenního) oligonukleotidů nesoucího žádanou mutaci (jeho sekvence je komplementární ke klonované sekvenci vyjma místa, do něhož má být mutace vnesena) 3. Připojení (přihybridizování) mutagenního oligonukleotidů in vitro 4. Dosyntetizování komplementárního řetězce DNA-polymerázou, spojení DNA-ligázou 5. Transformace buněk E. coli heteroduplexní molekulou DNA, selekce mutantních molekul (příp. selekce in vitro a transformace mutantními molekulami DNA) 6. Pomnožení mutantní molekuly DNA v E. coli, ověření mutace stanovením sekvence DNA 24 Klonování genů ve fágemidech Klonovací vektor (např. Bluescript) ~ plazmid DNA insert Transfect E. coli Recombinant M13 vector (double-stranded DNA) Protein coat DNA core O Recombinant M13 phage Single-stranded DNA Phage are released 25 Mutageneze pomocí mutagenních oligonukleotidů syntéza druhého řetězce DNA-polymerázou selekce klonů s mutací rekombinantní dsDNA (fragment DNA klonovaný ve vektoru) O O příprava jednořetězcové formy rekombinantní molekuly DNA (rekombinantní ssDNA) "A mutagenní oligonukleotid obsahující mutaci hybridizační připojení mutagenního oligonukleotidů přenos do buněk E.coli a jejich replikace rodičovský fenotyp stanovení fenotypového projevu mutace Substituce delece inzerce 26 Zvýšení výnosu mutant začlenením uracilu do templátové DNA Přenos do kmene E. coli ung-, dut-příprava ssDNA In vitro Přenos do E. coli ung+, selekce AmpR DNA klonovaná do M13 vektoru Většina kolonií obsahuje mutantní plazmid Řetězec s mutací (bez U) se replikuje ung- (uracil-N-glykozidáza_) (rep-) dut- (dUTPáza-) - zvýšení koncentrace U V templátové DNA je začleněn U Připojení mutagenního oligonukleotidu Replikace, ligace Řetězec standardního typu (templátový, mateřský) obsahující U je degradován Ověření mutace stanovením sekvence DNA žádaná mutace 28 Nitrocellulo Vyhledání mutantních klonů pomocí sondy -tou je značený mutagenní oligonukleotid Mixture of colonies containing mutont and wild-type plasmids X-ray film Rocfioadive mulo gentc oligonucleotide Labeled probe hybridizes ol room temperature to -■^ both mutant and wild-type DNA Isolate mulont DNA from colony sonda 29 Master plote Mutageneze pomocí mutagenních oligonukleotidů ampr pBR322 Afl III 2. selekce pomocí RE; cílová sekvence = GEN TETR O Bglll DNA - Polymeráza DNA - Ligáza ampr Afl III tetr Netransformuje i Afl NNACPuPyGTNN Bgl II NNAGATCTNN Připojení dvou primem 1. Mutantní deleční oligonukleotid 2. Selekční oligonukleotid Bgl II ampr Bglll ampr Deletovaný plazmid Bgl II Transformace E. coli tets Izolace DNA i i Štěpení selekční RE Afl III tet5 Transformace výsev na AM P vyhledání klonů TET5 Vytváření mutací in vitro přímo na plazmidech (QuickChange) E. coli dam+ Smíchání plazmidu s primery nesoucími mutaci, syntéza komplementárních řetězců Štěpení I ▼ Dpnl ▼ Přenos do E. coli jako templát je využita dsDNA plazmidu po proběhnutí PCR se vytvoří dva komplementární řetězce nesoucí mutaci ve stejném místě, které jsou schopny se párovat za vzniku kružnice s posunutými zlomy po proběhnutí PCR jsou produkty štěpeny Dpnl, která je schopná štěpit jen metylovanou DNA rodičovské molekuly DNA jsou metylovány, neboť plazmidy byly izolovány z dam+ kmenů E. coli - proto jsou Dpnl rozštěpeny (odstranění rodičovského templátu bez mutace). nově syntetizované molekuly nejsou metylovány a tudíž nejsou štěpeny po transformaci do E. coli dojde k reparaci ss DNA zlomů a nově nasyntetizované plazmidy obsahující mutaci se replikují Komerční soupravy pro snadné vytváření mutací a selekci M etyl ova n á rodičovská DNA - DNA metyláza I Methylation -. L Plasmid j = U Mutagenesis } Plasmid template PCR Reagents Methyl Transferase Reagents Methyl ate plasm id DNA and amplify the plasmid in a mutagenesis reaction with up to three overlapping primers containing the target mutations Mutagenní oligonukleotidy Princip: rodičovská DNA standardního typu je metylována a je štěpena McrBC RE v E. coli, zachován je jen mutantní nemetylovaný produkt In vitro recombination reaction } PCR Sample 2X Enzyme Mix Add 1 pL O.S M EDTA to stop the reaction Use 2pL of recombination reaction sample for transformation Incubate on ice for 15 minutes Heat shock for 30 seconds Add 250 pL SOC Kccoverfor l hour at 37°C 2. Perform t he in vitro recombination reaction. Transform the sample into DH5a™-TlR competent E. coli.The host cell circularizes the linear mutated DNA, and McrBQ endonudease in the host cell digests the methylated template DNA, leaving only unmet hylated, mutated product Modifikace subtilizinu se změněným požadavkem na kofaktory (postupná mutagenze pomocí mutagenních oligonukleotidů) nativní subtilizin vyžadující Ca Vysoká enzymová aktivita Ztráta aktivity po deleci domény vázající Ca Mutantní varianty s nízkou aktivitou Kombinace mutantních variant: vysoká aktivita i bez navázaného Ca Vlastnosti přirozeného lysozymu (wt) a šesti jeho modifikovaných variant připravených oligonukleotidovou mutagezí Enzyme Amino acid at position: No. % 7", 3 9 21 54 97 142 164 of -S-S- Activity <°C) wt Tie Be Thr Cys Cys Thr Leu 0 100 41.9 pwt He He Thr Thr Ala Thr Leu 0 100 41.9 A Cys He Thr Thr Cys Thr Leu 1 96 46.7 B lie Cys Thr Thr Ala Thr Cys 1 106 48.3 C He He Cys Thr Ala Cys Leu 1 0 52.9 D Cys Cys Thr Thr Cys Thr Cys 2 95 57.6 E He Cys Cys Thr Ala Cys Cys 2 0 58.9 F Cys Cys Cys Thr Cys Cys Cys 3 0 65.5 Kazetová mutageneze Cleave wilh H/ndlII ond fcoRI Remove srna Fragment Two synthetic oligonucleotides. Wild-type DNA Híndlll , Wild-type fcoRI DNA Transform E. co/; All colonies contain mulant plasmid Syntéza genů postupným spojováním kratších oligonukleotidů DNA sequence or amino acid sequence Isolate double-stranded DNA molecule Express recombinant protein in E GG T T A C A|AC TN. Wildlype 'GGT TACAAaBT /oligonucleotides GGTTACAAACT Complementary "doped" oligomer r Skríning napr. fágovým displayem 546 klonu 224 wt 218- lxsubst. 104 - více subst. Wild-type plasmids and mutants with multiple tubstitutiooi Plasmids containing o single nucteoŕide change Test (or function Mutageneze pomocí „doped" oligonukleotidů Oligonukleotid obsahující inosin pro zajištění párování s náhodnými nukleotidy/kodony kodony pro různé aminokyseliny Oligonukleotid obsahující dva náhodné kodony Arg Glu lie T CGA GAA ATC -► CTT TAG *** Glu Met *** Glu Ala Val Ser Met NNg GAG ATG NNg GAA GCG GTT AGC ATG <- III CTC TAC III CTT CGC CAA TC Kazeta s dvěma náhodnými kodony AGCT G TAC Xhol Sphl N = kterýkoliv ze 4 nukleotidů NTG/C = hydrofóbní aminokyseliny (fenylalanin, izoleucin, leucin, methionin a valin) Alternativní způsob nasyntetizování druhého nukleotidu PCR 38 Záměna helixu v represorovém proteinu mutagenezou in vitro (příklad kazetové mutageneze) 434R expression vector (o) Transeríptionol terminator Transform E. co/i 434 repressor P22 repressor Dael Promoter M ----Gly Thr—Gl Remove wild-type fragment -Giy^Ser Val P22-specifk hybrid a helix 3 -Asn Ala it Trp Ar^ Mi P22 a helix 3 Glu ffpnl site Připravená kazeta Záměna aminokyselin v doméně represoru zodpovědné za rozpoznání operátoru P22 Poel site |C TCT A AT GTT TCG ATC TCG CAG CTC GAA CGC GGG AAA AC I rCATGG AGA T TA CAA AGC TAG AGC GTC GAG C T T GCG C CC T T T TGATTI Express hybrid 434/P22 protein -P22 operator DNA 39 Výhody PCR • jednoduché provedení • možnost vytváření různého typu mutací • není nutná následná selekce pro zvýšení proporce mutant (pří cílené mutagenezi) • nezávislost na RE místech • není vždy nutné následné klonování mutovaného genu do vektoru (po PCR je možný přenos lineárního amplikonu do buněk transformací, možnost rekombinace s genomovou DNA - ale nízká účinnost) 40 Využití PCR k vytváření mutací in vitro 5' 3' r -X- -X- 3' 5' Místo, do něhož má být vnesena mutace Reakce 1 Primer 2 5' 3' Reakce 2 5' 3' -X- 3' 5' 5' 3' -X- Primer 4 3'—5' -X- Primer PCR 5'-3'- »1 Vznik dvou PCR-produktů nesoucích mutaci A. 3' 5'-y-3' Primer 3 3'-*- 3' 5' I PCR 3' 5' Primery 2a3 = mutagenní primery Nemůže dojít k prodloužení od 5'konců 5' klonování 5' 3'- -3' I Smíchání, denaturace a rehybridizace 3' tzv. neproduktivní spojení 5' produktivní spojení Prodloužení DNA-polymerázou a PCR-amplifikace pomocí primerů 1 a 4 3' 5' 41 Vnášení mutací pomocí PCR : mutagenesis ---5*- —-<--1—' r- Vložená sekvence (extenze primem na jeho 5'konci) (extenze jsou vzájemně komplementární) substituce insertions ■ the nseaion can be / X" or^er than the overlap ý over|ap extension \ product AD with insertion I I PCR*1* deletions ^ \ 5' end of 'c' matches here^"--*.. a\ Ý I w overlap extension \ inner segment deleted Deletovaná sekvence (extenze jsou komplementární k sekvenci vedle místa delece) Amplifikace „produktivních" spojení pomocí primerů a a d 42 PCR-mutageneze pomocí megaprimeru Mutagenic primer -3' -5' First PCR First PCR product (megaprimer) Limited amount of first flunking primer Add second flmiking primer -3' Second PCR Megaprimer -3' -5' Restriction digestion and ligation V Mutant clone Second PCR product (mutated DNA) Obecně: The strategies require two rounds of PCR amplification using two flanking primers and one internal mutagenic primer. In the first round of PCR, one of the flanking primers and the internal mutagenic primer (having desired base substitutions) are used to generate a megaprimer. The megaprimer is purified by gel electrophoresis and extraction before being used along with the other flanking primer in the second round of PCR to generate the complete DNA sequence with the desired mutation. Nová modifikace: The first PCR (5 cycles) contains a limiting concentration of the first flanking primer and is followed by a prolonged extension step. The second flanking primer is then added and the entire mutated template is amplified by PCR (25 cycles). The second PCR product is digested with appropriate restriction endonucleases to give desired mutated fragment, which then can be ligated to the expression vector. 43 Náhrada části genu sekvencí z příbuzného genu Sekvence genu A Gen A analogie mutagenního oligonukleotidu Gen B Sekvence genu B Denature and hybridize sticky feeť extenze i Single-strand vector Polymerase plus ligase + original vector Část genu B je nahrazena částí genu A Konstrukce genu pro chimérickou protilátku Light chain v2b heavy chain I CH2 domain í^Y1CH2 domain Expression vector for y1 heavy chain Make uraci containing single stranded DNA Does not activate -4 complement Sticky foot —V^. Gene for heavy chain (v2b isotype) Antibody with chimeric heavy chain Activates complement Polymerase chain reaction ^ "^™V~ PCR 4 400 bp ^ primers Heat to denature strands Coexpress in mammalian cells with light chain i Transform ung+ E. coli Isolate mutant DNA Těžký řetězec typu y2b zodpovídá za lyži buněk závislou na komplementu Protilátka s těžkým řetězcem y1 tuto lyži nenavozuje. Která oblast y2b za tuto vlastnost zodpovídá? Doména CH2 y2b Doména CH2 odpovídá za aktivaci komplementu pro lyzy buněk Chimérický těžký řetězec 45 Vytváření náhodných mutací - „error-prone" PCR 3 — 5' 3' —l' • využívají se DNA-polymerázy bez korektorské funkce _y (napr. Taq-polymeráza) - ne High s-—3' Fidelity PCR Enzymes i Error prone J J w PCR T_ t • reakční podmínky PCR lze změnit 3' it i/ tak, aby se počet chyb zvýšil a aby 3'-*-5' každý amplifikační produkt obsahoval jednu mutaci 5'_3' 3'-5' (např. zvýšení Mg++ nebo přidání 5; x 3; Mn++, koncentrace reakčních složek atp) 5; x 3; r/ * 5/ • nevýhoda: převaha určitého typu y x & mutace (např. transzice, zatímco 5'-x-st-3' transverze nevznikají) 3'->«-*-5' 46 Způsoby zavádění změn do proteinů Výsledek (např): - vyšší aktivita - termostabilita Náhodná mutageneze nebo error-prone PCR Kombinace oblastí/úseků (tzv. DNA-shuffling) pocházejících z genů genových rodin (interferon) DNA shuffling 1, Digest PCR products of homologous genes. Create pool of ssDNA fragments (short single strand DNA), DNase I digestion ■ 1, 2, Perform "pri merle is"' PCR to reassemble genes. 3. Cut and clone reassembled genes for expression. 48 Parental DNA DNA shuffling (DNasel) Priming I Elongation J B StEP + Piimin[> Elongation ^ Digestion ^ (Restriction -„ 4 idiiniideiuic, MUKA Priming I n cycle* J n cycles J Elongation 1 StEP Brief PCR cxtertoifm Brief PCR extension wilii f rynilvm priming Rvjmtt with varying extension Library of hybrid gene* Incremental limiidiiim Ligation Library of hybrid genes SHIPREC Fusion Fragmentation ■ by DNaxe í \ Size separatism I Ligatii OÔO JLinearisation digestion Library or hybrid genes RACHUT Top strand ofhotnoiogfs) Synthetic Shuffling SISDC i íl f n 4fr Fragmentation scaffold Flap digestion, gapfiHing , r and nick ligation Scaffold destroyed. Jimbte strand synthesized XXX, C XXX Diverse synthetic oligonucleotides XXX, \ \ X XXX ^ X *l£ XX it XX \ XXX e XXXXJ XX X, XJX— XXXXK XXX XXX Bae! recognition and cleavage site Tag insertion at consensus sequence sile Bael digestion J Reassembly by PCR mxrxM xxx xxxxw Tb Highly mosaic shuffled genes y\ w mvi; t \it m Library of variants (each a a recombincd independently) Ligation Vytváření hybridních genů kombinací restrikčních fragmentů Start cN <> St0P codon

10,000 klonů ) 3. Transformace 4. Exprese proteinu 5. neni aplikována 6. Screening a výběr - stabilita - selektivita • afinita aktivita $$$$ Vybrané mutantni enzymy Převzato: J. Damborský: Racionální design a řízená evoluce představují dva koncepčně rozdílné přístupy používané při konstrukci vylepšených enzymů metodami proteinového inženýrství. Dosažení náhodné záměny nukleotidů: - Použití neoptimálních podmínek pro syntézu DNA in vitro (např. změny koncentrace iontů, odlišné koncentrace prekurzorů nukleotidů mají za následek chyby v jejich zařazování do DNA) - Použití DNA-polymerázy bez korektorské funkce Základní problém: dochází ke vzniku většího počtu substitucí a je obtížné určit, která záměna (mutace) zodpovídá za změnu vlastností genu 57