Zajištění exprese klonovaných genů v heterologních systémech a její optimalizace i Faktory ovlivňující expresi klonovaných genů A. Regulační sekvence pro genovou expresi 1. Transkripční úroveň • Síla promotoru a jeho charakter • Terminátor transkripce • Stabilita mRNA, její posttranskripční úpravy 2. Translační úroveň • Účinnost vazby mRNA na ribozom • využívání kodonů • stabilita proteinu, posttranslační úpravy 3. Transport proteinu • charakter signální sekvence B. Vlastnosti vektorů • Počet kopií vektoru (počet kopií inzertu) • Stabilita vektoru C. Fyziologie hostitelské buňky • růstové podmínky • enzymový aparát hostitelské buňky Signály ovlivňující transkripci a translaci strukturního genu (bakterie E. co li) Regulační signály pro transkripci -35 -10 Regulační signály pro iniciaci translace +1 tgttgaca tataatg □ taaggag Vedoucí sekvence m RNA Signální peptid transport atg Klonovaný gen protein stop Faktory ovlivňující expresi klonované DNA Regulační sekvence vektoru Vlastnosti inzertu Promotor i +1 i Klonovaný strukturní gen, cDNA P I T / vedoucí / oblast 1 Terminátor transkripce síla promotoru Využívání kodonů 1. signály pro iniciaci translace 2. signály pro transport 1. sekundární struktura mRNA 2. signály pro sestřih (3' a 5' konec intronu) 4 Sekvence bakteriálních přirozených a hybridních promotorů -35 Region 17 bp -10 Region 123456789 1011121314151617 CONSENSUS • • • TTGACA • • • •.............T ATAAT • • lac GGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATATTGT trp CTGTTGACAATTAATCAT CGAACT AGTTAACTAG JtPL GTGTTGAC AT AAATACCA CTGGCGGtGATACTGA recA CACTTGAT ACTGT ATGAA G C A T A C A G T A T A A T T G tad tacll CTGTTGACAATTAATCAT CGGCTCGTATAATGT CTGTTGACAATTAATCAT CGAACTAGTTTAAT G T 15-18 bp Hybridní promotory 5-9 bp 5 Sekvence lac, trp a tac promotoru trp tac -35 consensus 5'-TTGACA- 3' -10 consensus 5■-TATAAT-3 ' lac: 5'-...tttacactttatgcttccc^cícgťatat -35 -10 RBS -35 ttgacaattaatc gcťc ätgtgtggaättgtgagcggataX^ ■HHHhI^HHHHHHBHÍIHhHWHMhBHÍB -35 -10 RBS atg...-3 Protein řTTGACAATTAATCATCGlAACTAGTTAACTAGTACGCAAGTTCACGTAAAAAGGGTATCGACA ATG... - 3 • -10 RBS Protein ATG...-3 Protein Hybridní promotor 6 Regulovatelné promotory používané v expresních vektorech Promotor Zdroj Způsob regulace £ coli lac-UV5 nezávislost na katabolické represi Využití u eukaryot XpL, XpR lac trp tac phoA recA tet Leftward and rightward early promoters of X £ coliíac Operon £ coli trp Operon trp-35 region lac-10 region hybrid £ co/Zalkaline phosphatase operon £ colirecA gene Tn 10 tetracycline-resistance gene Off 304C Tryptophan in medium Excess phosphate in medium On >37*C (in d857 host) IPTG inimedium Indoleacetic acid in medium IPTG.in medium Phosphate-limited medium Mitomycin C in medium Tetracyclines in medium Promotory fága lambda vykazují velmi striktní kontrolu transkripce s krátkým lagem mezi neindukovaným a indukovaným stavem. V neindukovaném stavu nedochází vůbec k transkripci, na rozdíl od promotorů „metabolických" operonů, kdy částečná transkripce probíhá pořád. 7 Promotor Zdroj Způsob regulace Off On B. subtilis bla cat Strep tornyces gyl S. cerevisiae ADH G AU GPD-PH05 Bacillus licheniformis ^-lactamase gene Bacillus pumilis chloramphenicol acetyl transferase Streptomyces coelicolor glycerol operon Yeast repressible alcohol dehydrogenase (ADR) gene Yeast galactose utilisation operon Hybrid between yeast glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase and alkaline phosphatase gene promoters Glucose in medium High glucose in medium Glucose in medium Excess phosphate in medium ß-lactams in medium Chloramphenicol in medium Glycerol in medium Low glucose in medium Galactose in medium Phosphate-limited medium 8 Vliv vzdálenosti mezi promotorem a startem translace na množství vytvářeného proteinu cro změny vzdálenosti Transcription from lac promoter -> Recognition sequence for endonuclease BamH] Translational start signal for cro gene r 1 SO cro AATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGÄAACAGGATCCeGGACTATTTTACCTATGGCGGTGATAAT^ TT AAC ACTCGCC TAT TGT T AA AGTGTGTCC T TTGT COT AGGCCC TGAT AAAA TGGATACCGCCACTA T TACCAACGT AC A TG.AŤŤ.CCTÉíCÄAC ATAC Delece různého rozsahu < ŕ pTR213 pTR199 pTR214 pTR188 pTR194 PTR210 pTR182 ^ pTR190 1.63 0.085 1.00 0.65 0.51 0.85 0.0012 <0.0006 1 Relativní množství produkovaného proteinu cro 9 Sekundární struktura cro-mRNA Množství proteinu Iniciační kodon AUG je součástí smyčky - protein cro se tvoří v malém množství Vliv regulačních sekvencí na výtěžek t-antigenu SV40 z různých plazmidových konstruktů % celkového proteinu Vzdálenost SD-ATG Sekvence oblasti pro iniciaci translace vektor 0.068 9 AGGAAACAGAAAGATGGAT pTR436 1.0 9 AGGAAACAGCCAGATGGAT HP1 0.01 5 GTCGAGGAATTCCATGGAT pPLcSVt5-372 0.1 5 ATTG G AATTCC ATG G AT pPLcSVt5-37 2.5 8 TTG G AATTATTCC ATG G AT pPLcSVt5-379 1.0 9 TTGGAATTAATTCCATGGAT pPLcSVt5-374 0.01 9 AGGAATTCCAAAGATGGAT pPLcSVt5-72 SD Inic.kodon ii Sekundární struktura mRNA (pro t-antigen) v oblasti iniciačního kodonu v různých plazmidových konstruktech Množství proteinu^ u uaa AUG ucacacagga"a m,v.,v,j akfínj ú c ú c c u u auaaggggguccg '""Va\ u a a g c g u-a g-c u-a u-a a-u a-u g a 1,0 i a g g a acagar a a u u uuG-cuA a-u a a-u u a-u ,.a-u-g-g-c.a %ga-!uSa-^ CA.G C-ICj á 'c_6-a. .u. .u.uuga, ucacacaggaá ccuucaggc * ÁIÍuNj účúccuúauaagggggúčcg.. g g '"'.V. uGaC a v- SD 1,0 r,:A-U-A, .au-u c cm u-a-^u a a g c uuuuaaa AaAÁÁÁÚ úú u'c'u U r-a c-g' c-g '.u-Aj-u g"a'a, a-u a u g cg:g-u.g-a-g a-u c-gt g rP u-g-g u-A u-a c-u u-a a-u a-u g-c g-c a-u |g-c aga-u g / a u c-g a-°-c-a.a. a g Vg-a-g* a-u a-u a-u U 'cgga' u^ a a g a Á g<-g-a a-u a-u a-u g-c c a a u auaaaguuuuaaa .g. ááááúúú a i a ^ a 'a a' 'gg.u- u-c-u u á 'c-g' c-g v-.a-u á-u-g'a'a y (3 g:cgcu-g.a-g' a-u-l c-g-g. g g u-g-g' u-a u-a c-u u-a a-u a-u g-c g-c a-u g-c ga-u u a g a g g 12 Mechanismus působení sekvence riboswitch na mRNA Riboswitch je regulační segment mRNA, který váže malou molekulu, což mění strukturu této mRNA a ovlivňuje transkripci (a) nebo translaci (b) a) Terminace transkripce. Vazba malé molekuly na riboswitch ve vedoucí sekvenci b) Iniciace translace. Vazba malé molekuly na riboswitch navodí vytvoření vlásenkové mRNA navodí vytvoření vlásenkové smyčky, smyčky, v níž se nachází RBS. Ribozom se která ukončí transkripci. nenaváže a translace nezačne. rib operon of B. subtilis works in this way. translation of mRNAs coding for enzymes involved in FMN synthesis. Riboswitch mRNA Small molecule antiterminátorová vlásenka J V uuuuuuu Transcription proceeds Hairpin loop terminates transcription. Riboswitch mRNA Small molecule Ribosome AUG I ' " Translation proceeds Hairpin loop blocks ribosome binding. C 2012 Pearson Education. Inc Lyži nový riboswitch přidání O senzor 5-1 kódující oblast lysC -I 1111111111111 (b) z aspartátkináza antiterminátor Pí Z 5' -I terminátor transkripce 0 -3.UUUUU Kódující oblast lysC Lyzin není přítomen, gen lysC je přepisován Lyzin je přítomen, transkripce genu lysC je ukončena Posun vzdálenosti mezi promotorem a klonovaným genem BamH\ EcoR\ BamH\ BamH\ Štěpení EcoR\ kohezní EcoR\ konce / X i —r klonovaný gen T4-ligáza EcoRI Štěpení BamH\ - klonovaný gen EcoRI různý rozsah odbourání DNA u jednotlivých molekul /\ EcoRI O- klonovaný gen 1 Štěpení Exolll a S1 nukleázami (f r klonovaný gen EcoRI EcoRI lac N\ Promotor- j P klonovaný gen fragment 42 EcoRI /ac-Promotor-fragment (95 bp) posun vzdálenosti 15 Použití teplotně senzitivního represoru cl857pro regulaci promotoru Pl fága X (cJ857) Operátor 0LPL Promotor inaktivní klonovací místo chromozom E. coli | CI857 | Promotory fága lambda vykazují striktní regulaci transkripce s krátkým lagem mezi neindukovaným a indukovaným stavem. V neindukovaném stavu k transkripci vůbec nedochází, na rozdíl od promotorů "metabolických" operonů, kdy částečná transkripce probíhá stále. Problém s termoindukcí u ts promotorů je ve velkokapacitních nádobách, kde je obtížné zvýšit rychle teplotu z 30 na41°C. ---Lambda cl857-lysogen Při 32°C se termolabilní represor cl857 kódovaný genem cl na chromozomu váže na operátor 0L na plazmidu a zabraňuje transkripci z promotoru PL. Zvýšením teploty na 41 °C je represor inaktivován, uvolní se z operátoru a transkripce klonovaného genu probíhá. 16 Regulace genové exprese promotorem pL fága X mRNA ,el Active cl protein cl gene TT oL pL Target gene TT Při 30°C se ts-represor cl, který je konstitutivně syntetizován pod kontrolou vlastního promotoru pel, váže na operátor oL promotoru pL a tím zabraňuje expresi cílového genu Produkt se netvorí B mRNA .cl i Active cl protein Inactive protein Produkt se tvoří cl gene TT oL pL Target gene TT Při 42°C je ts-represor cl inaktivován a dochází k transkripci cílového genu 17 Expresní vektory obsahující T7-promotor RNA-polymeráza T7 rozpoznává pouze promotory genů fága 17 Promotor lac-represor O +IPTG / O uvolnění represoru T7 promotor Klonovaný gen Produkt klonovaného genu Gen kódující T7-polymerázu 18 Regulace genové exprese cílového genu kontrolovaná promotorem pT7 fága T7 T7 RNA polymerase IPTG lac repressor 17 RNA polymerase gene , T7 Target gene TT T T Za nepřítomnosti induktoru (IPTG) represor lac reprimuje syntézu T7-polymerázy, která je pod kontrolou lac promotoru a lac operátoru a cílový gen se nepřepisuje. Po přidání IPTG je lac-represor inaktivován, T7-polymeráza se tvoří a je přepisován cílový gen mRNA Jací lacl gene TT Gen lacl může být na jiném vektoru než gen pro T7-polymerázu a cílový gen Systém T7 pro expresi proteinů v E. coli DE3 Terminátory transkripce používané v expresních vektorech u E. coli a) terminátory TI a T2 bakteriofága lambda b) terminátory TI a T2 z operonu rrnB rRNA E. coli používají se v tandemu r Účinná terminace transkripce je esenciální pro dosažení vysoké hladiny exprese: - zvyšuje stabilitu mRNA, - zvyšuje hladinu akumulovaných proteinů. Silné terminátory se zařazují rovněž před inducibilní promotory, aby zabránily transkripci z promotorů lokalizovaných před klonovaným genem („read-through") 21 Stabilita mRNA Rychlost syntézy proteinu závisí na množství mRNA v buňce Existuje rovnováha mezi syntézou a rozkladem daného druhu mRNA/turnover/ Snížení rozkladu mRNA (kombinované působení endonukleázy a 3 exonukleázy) u E. coli činí poločas rozpadu molekul mRNA 1-2 minuty poločas rozpadu mRNA genu 32 bakteriofága T4 je 20 minut a více - za zvýšenou stabilitu jsou odpovědné specifické sekvence, které se nacházejí před iniciačním kodonem genu 32 - díky této 5' nepřekládané sekvenci mohou být také stabilizovány jiné mRNA molekuly. Konstrukce plazmidu s expresní kazetou genu 32, pomocí níž je možné v buňkách E. coli syntetizovat velká množství cizích proteinů. Vzniklé hybridní transkripty mají dlouhou životnost. Poločas rozpadu se podle klonované sekvence pohybuje od 4 do 10 minut. 22 Zajištění účinné translace Interakce mRNA s 16S rRNA při iniciaci translace 16 S rRNA 3 AU UCCUCC ACUAG ^AGGAGGUl S-D sequence u u 5' 1 / U mRNA Iniciační kodon U G A C C U A U G C G A G C U 5 Kromě iniciačního kodonu AUG existují v RBS ještě tři další oblasti, jejichž sekvence jsou více či méně konzervovány: 1. Shine-Dalgarnova sekvence, v níž se obvykle vyskytuje sekvence 5'UAAGGAGGU 3'. 2. U mRNA (alespoň polycistronické) jsou součástí RBS jeden nebo více terminačních kodonů. 3. U genů, které jsou silně exprimovány (např. geny pro fágové kapsidy nebo ribozomální proteiny), se v RBS nachází sekvence PuPuUUUPuPu (nebo sekvence jí podobná). Bývá označována též jako RRUUURR sekvence. Může se vyskytovat vedle SD-sekvence nebo místo ní. Ukazuje se, že přítomnost této sekvence je nezbytná pro translaci eukaryotických genů v E. coli, jak bylo zjištěno při expresi malého T antigenu SV40. 24 Synteticky připravené ribozomové vazebné místo 1. S-D sekvence - 2. RRUUURR (GGTTTAA) 3. Terminační kodon TAA klonovaný gen v , . TAAGGAGGTTTA , , smer k promotoru A— ........... / —+ kódující sekvence 3' ACGTATTCCTCCAAATTCGA 5' í í Psřl kohezní H/ndlII kohezní místo místo 25 Zajištění účinné translace použitím optimalizované RBS A,B,C = reštrikční místa Gene gen bez RBS aATG, s terminačním kodonem RBS ATG 5^AANWMNNTAA6^SAAAAAAA^J^|!^j- 3' *C "batons lze pozměňovat sekvenci nebo vzdálenosti Gen zájmu vložen za RBS 26 Různé čtecí rámce vzhledem k iniciaci translace genů lacZ u tří různých vektorů i—v čtecí rámce 01 M2UV5 Proximální část genu pro (3-gal 02 ÁAZ2 AATT C G C TTAA GGG CCC TTAA AATT C G inzert EcoRl + 2GC inzert + 2GC 03 ÁAZ3 GGGGG CCCCC TTAA AATT C G inzert V devátém kodonu genu pro p-galaktozidázu je jedinečné místo pro EcoRl. Čtecí rámec, který tímto EcoRl místem začíná, byl označen jako O 1. Byly připraveny AAZ vektory se zabudovaným fragmentem v čtecích rámcích O 2 a O 3 připojením 2GC. Zvýšení genové exprese konstrukcí homopolycistronické sekvence A A A A £_J I RBS RBS RBS RBS jeden promotor jeden terminátor více kopií genu A Transcription Transcription from multiple RBSs m RNA 28 Srovnání využívání kodonů silně a slabě exprimovaných genů u E. coli U c A G silně/slabě silně/slabě silně/slabě silně/slabě u Phe< 39 151 113 102 Ser < 93 36 87 49 Tyr < í l 34 96 98 65 Cys ■ 13 34 23 39 u c Leu, 12 71 16 64 6 37 12 62 ochre amber opal Trp 25 66 A G 26 73 21 29 í His \ l 19 95 223 99 U c Leu 33 69 Proi 2 46 75 59 Arg ■ 101 133 C -> 3 22 345 294 26 45 162 101 Gln< 38 90 169 166 -►3 27 -»■ 1 42 A G A lie < . 67 156 262 118 Thn 103 46 137 119 Asn< 13 101 159 98 Ser 10 56 49 61 U C , ; 1 Met -*■ 2 27 140 130 15 32 28 76 Lys ■ 259 163 106 44 Arg , -> 3 28 -¥ 1 17 A G Val- 192 108 41 66 Ala. 173 87 48 178 Asp< 116 183 204 ,106 Gly < 226 124 174 140 U C G 119 48 83 123 119 107 129 149 Glu ■ 333 210 106 98 _> 4 42 -v 14 66 A G Silně exprimované geny představuje 24 druhů mRNAs celkovým počtem 5253 kodonů. Mezi tyto geny patří gen pro RNA-polymerázu, geny pro dvanáct ribozomových proteinů, několik proteinů vnější membrány a geny pro elongační translační faktory. Slabě exprimované geny představuje 18 druhů mRNAs 5231 kodony. Patří sem několik represorových genů, gen pro transponázu a (3-laktamázu. Kodony, které jsou čteny jen jedinou tRNA a jejichž výběr je závislý na povaze a síle interakcí mezi kodonem a antikodonem, jsou v rámečku. Šipkami jsou označeny kodony, které jsou používány jen zřídka a mohou se podílet na regulaci genové exprese. Řešení problému rozdílného využívání kodonů 1. Koexprese genů pro tRNA pro alternativní kodony příprava kmenů s klonovanými geny pro tRNA na samostatných vektorech kmen E. coli Rosetta má geny pro tyto tRNA na plazmidu, který je kompatibilní s expresním vektorem. 2. Změna méně často používaných kodonů mutagenezí in vitro za kodony používané častěji (pracnější postup) 30 Dosažení vysoké exprese cizorodého genu v kmenech E. coli obsahujících geny pro vzácné tRNA Standardní kmen E. coli host cell Plazmid s cizorodým genem Nízká hladina exprese cizího genu Upravený kmen F. coil host cell Plazmid s cizorodým genem Overproduced tRNA Vysoká hladina exprese cizího genu 31 Zvýšení stability cizích proteinů v E. coli Změna lokalizace (poločas krysího proinzulinu v E. coli\e v cytoplazmě 2 min, v periplazmě 10 x vyšší) Tvorba fúzních proteinů (bakteriální + eukaryotická část = p-galaktozidáza + somatostatin, pak štěpení fúzního proteinu) Exprese v mutantách E. colis nižší aktivitou intracelulárních proteáz (lon-proteáza - zabraňuje akumulaci denaturovaných nebo jinak pozměněných polypeptidů). Snížení degradace proteinů produktem genu pin fága T4 (protease inhibition) - stabilizace eukaryotických proteinů (interferon) 32 Zvýšení stability proteinů změnou sekvence jeho aminokyselin Stabilita p-galaktozidázy po přidání aminokyselin k jejímu N-konci Přidané minokyseliny Poločas Met, Ser, Ala >20 h Thr, Val, Gly >20 h Ne, Glu >30 min Tyr, Gin -10 min Pro ~7 min Phe, Leu, Asp, Lys ~3 min Arg ~2 min PEST = aminokyseliny (prolin P, glutamová kys. E, serin S. treonin T), jejichž přítomnost v určitých vnitřních oblastech proteinu zvyšuje jeho citlivost k proteolytické degradaci Vytváření fúzních proteinů Fúzní protein: produkt vytvořený po spojení dvou nebo více genů/sekvencí: 1. Přirozený gen hostitelského organismu = stabilizující partner (cizí proteiny jsou v heterologních systémech často nestabilní) 2. Cizorodý gen (gen zájmu ) 3. +/- spojující sekvence (oligonukleotidový linker), kódující krátké úseky aminokyselin rozpoznávané nebakteriálními proteázami umožňují dodatečné odštěpení cílového produktu z fúzního proteinu používají se k purifikaci rekombinantních proteinů 34 Klonovací vektor pro přípravu fúzních proteinů Selekční marker Zkrácený gen pro p-galaktozidázu, vložený mimo čtecí rámec genu ompF N-terminální část genu ompF Klonovací místo Lígate Signály pro transkripci, translaci a sekreci fúzního proteinu lacZ Abel Abel Gene Abel Cizorodý gen ♦ Tribridní protein Např. antigen pro přípravu protilátek Některé fúzní systémy používané k purifikaci cizorodých proteinů vytvářených v E. coli Fuzni partner Velikost Ligand Podminky eluce ZZ 14kDa igG Low pH His tail (tag) 6-10 aa Ni2+ Imidazole Strep-tag 10 aa Streptavidin Iminobiotin PinPoint 13kDa Streptavidin Biotin MBP 40 kDa Amylose Maltose p-Lactamase 27 kDa Phenyl-boronate Borate GST 25 kDa Glutathione Reducing agent Flag 8 aa Specific MAb Low calcium ZZ = fragment proteinu A (S. aureus); His = histidin; Strep-tag = peptid s afinitou ke streptavidinu; PinPoint = fragment proteinu biotinylovaný in vivo v E. coli] MBP = protein vázající maltózu; GST = glutation S-transferáza; Flag = peptid rozpoznávaný enterokinázou; Mab = monoklonální protilátka. Purifikace fúzních proteinů imunoafinitní chromatografií markerový peptid interleukin-2 8 & další proteiny. Výchozí koncentrovaná směs sekretovaných proteinů Polypropylenová podložka Protilátka proti markerovému peptidu Markerový peptid se váže k protilátce o ^ Další proteiny procházejí 8 kolonou Fúzní protein je eluován 37 Fágový displej Vystavení proteinů/peptidů na povrchu bakteriofága antibody fragments (scFv) gene 3 protein (minor coat protein) gene 6 protein (minor coat protein) gene 8 protein (major coat protein) antibody genes (for Vh and V|J Phage Library various peptides- gene 3 gene 7 and 9 proteins (minor coat proteins) Proteolytické štěpení fúzního proteinu krevním koagulačním faktorem Xa Rozpoznávací linkerová sekvence štěpená Xa Místo štěpení ŕ- -V ,.. Thr-Ala-Glu-Gly-Gly-Ser-lle-Glu-Gly-Arg-Val-His-Leu ... v__j \_ _j Část prvního proteinu Funkční protein klonovaného genu Linkerová sekvence není štěpena bakteriálními proteázami 39 Fig, 7-79. Thin sections of E. coli bacteria showing granules of (3-galactosidase/proinsulin fusion peptides (fixed in formaldehyde/glutaraldehyde according to Karnofsky; embedded in Epon; stained with uranylacetate/lead hydroxide; 38 000:1; Courtesy of Dr. W. Wetekam, Hoechst AG). Tři možné způsoby transportu sekretovaných proteinů Growth medium Periplasmic space Vyžadovány produkty mnoha dalších genů i B Outer membrane Vliv struktury C-konce Inner Signal Pullulanase Signal membrane peptidase complex peptidase Cytoplasm A. obecná exportní dráha (generál export pathway, GEP) - SP + Sec proteiny (chaperony) B. dráha IgA-proteázy (SP + C-konec proteinu) C. dráha nezávislá na SP - vyžaduje ABC-transportery (ATP-dependentní transportní proteiny) 41 Příklady signálních sekvencí různých proteinů Konec ss -3* -yi -32 -31 -30 -21 -28 -71 -26 -25 -2". -23 -22 -21 -2* B-W -18 -Ví -16 -li -li. -13 -12 -11 -10 -9 -a -7. -6 -5 -4 -3 -2 -1 Preproinsulin IRatHS). met ala leu trp arg^et phe leu pro leu leu sis leu leu val leu trp glu pro lys pro ala glu ala yhe ■ I Pre-lmmunoglobulin-K—light chain (House)lS) met asp met arg ala pro ala gin iLe phe gly phe leu leu leu leu phe pro gly thr arg cys asp 1 Pre-Lysozyme (ChkkenXS) met arg s:-r leu leu ile leu val leu cys phe leu pro leu ala ala leu gly lys ' i Pre-Growth hormone (RatHS) met ala ala asp ser gin thr pro trp leu leu thr phe ser leu leu cys leu leu trp pro gin glu ala gty ala leu' Pre-Glycoprotein (Vesicular Stomatitis Virus) (M) met lys cys leu leu tyr leu ala phe leu phe ile .his val'asn cys lys;, 1 Pre-P-Lactamase IpBR 322) IS) met ser ile gin his phe arg val ala leu ile pro phe phe ala ala phe cys leu pro val phe ala his 1 Pre-Mal lose-Binding protein (E.colil(S) met lys ile lys thr gly ala arg ile leu ala leu ser ala leu thr thr met met phe ser ala ser ala leu ala lys Pre-OmpA-Protein (E.coli) IM) met lys lys thr ala ile ala ile sta val ala leu ala gly phe ala thr val ala gin ala ala i Pre-Coat protein (Phage fd)(M) met lys lys ser leu val leu lys al3 ser val ala val ala thr leu val pro met leu ser phe ala ala Pre-P-Lactamase met leu lys lys phe ser thr leu lys leu lys lys ala ala ala val leu leu phe ser cys val ala leu ala gly cys ala asn asn gin thr asn ala ser (Bacillus licheniformis) (S) Fig. 7-78. Amino acid sequences of /V-terminal signal sequences of various precursors for membrane proteins (M), and a variety of secretory proteins (S). The vertical line indicates the transition from hydrophilic to hydrophobic regions within the signal sequences, the arrow the start of the mature proteins. N-konec obsahující polární aminokyseliny Místo štěpení SP i i i Hydrofobní aminokyseliny Zralý pľOtcill 42 Instabilita vektorů 1- Segregační instabilita: Ztráta plazmidu, ke které může dojít při dělení buněk v důsledku: chybění funkce par (partitioning) u některých vektorů (pBR322), která zaručuje rovnoměrné dělení kopií do dceřinných buněk. Problém lze řešit selekcí antibiotiky, nebo lze oblast par klonovat, např. z pSC101 do pBR322 a tím plazmidy stabilizovat, vytváření multimerních forem plazmidu a následné nerovnoměrné předávání kopií do dceřiných buněk. Multimerní plazmidy nevznikají u ColE1, který využívá rekombinační systém cer xer, který rozkládá multimery. Toto místo lze klonovat do plazmidu typu pBR322 a eliminovat problémy s multimerizací. Možnou strategií pro překonání segregační instability je eliminace buněk, které plazmid ztratily (např. použití genu cl fága v klonovacím vektoru a využití lyzogenních hostitelů) 2. Strukturní instabilita: Důsledek delecí, inzercí nebo translokací v chromozomech, plazmidech nebo virech (homologní rekombinace a transpozice). Překonání segregační instability vektoru eliminací buněk, které vektor ztratily Ztráta vektoru i Indukce profága Represor cl vytvářený rekombinantním vektorem udržuje buňku v lyzogenním stavu Lyže buněk 44 Vektory s dvojím počátkem replikace pro regulaci počtu kopií vektoru P-RNAII nahrazen P-lambda Počátek replikace zajišťující vysoký počet kopií Nízkokopiový počátek replikace ori pSCIOl Ap 30°C - aktivní je pouze ori pSC101 4 kopie plazmidu/ chromozom indukce (o ooooo o' oo o inactive repressor pioQ host: X clgj; lyíogen 42°C - inaktivace represoru cl, aktivace XpL, aktivace ori ColE1, 140 kopií plazmidu/ chromozom Příprava vektoru s regulovatelným ts-počátkem replikace a s regulovatelným ts-promotorem Haell Fragment c obsahuje ts-ori Haell Haell Haell Cut with Haell Isolate fragment c Růst v E. coli s genem cl Haell pPU2833 Ampr gene Cut with Haell Isolate fragments 1 and 3 Fragment 1 obsahuje pL promotor a MCS Fragment 3 obsahuje selekční marker AmpR Hae II Buňky s plazmidem pCP3 nejdříve rostou při 28°C, kde je cl funkční a promotor pL je vypnut a počet kopií pCP3 je nízký. Při 42°C je cl inaktivován, pL se aktivuje a počet kopií se zvýší více než lOx 46 Mol Biotechn 127 Vliv teploty na počet kopií plazmidů u tří expresních vektorů Plazmid Počet kopií plazmidů v buňce Promotor pL 28°C 42°C pKN402 82 512 ne pPLc2833 38 42 ano pCP3 60 713 ano 47 Důsledky vyplývající z přítomnosti rekombinantního plazmidu v buňkách 1. Snížení růstové rychlosti buněk 2. Změny morfologie buněk, nebo zvýšená fragilita buněk 3. Restrukturalizace klonovaného genu (rekombinace) výběr vhodného plazmidu RC x theta Vliv počtu plazmidových kopií na růstovou rychlost hostitelských buněk £ coli HB101 Plasmid copy Relative specific growth rate with plasmid number 0 12 None 1.00 0.92 0.91 0.87 0.82 A B C D E 24 60 122 408 0.77 48 Kompetice mezi pomalu rostoucími buňkami produkčního kmene (— ) (obsahuje vektor) a rychle rostoucími mutantami (které ztratily vektor) Počet buněk, 107 které ztratily plazmid k*- 1 buňka Cas 0 1. ztráta rekombinantního plazmidu (x antibiotika) 2. snížení počtu kopií plazmidu 3. restrukturalizace transgenu >r-1010 Parent (ixmax = 0.347 Ir1) 109 C 2 a 108 ä ů E 3 C ä> 107 O Počet buněk produkčního kmene obsahuje plazmid 2x106buněk 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 Time (h) Cas 0 49 Integrace klonovaného genu do bakteriálního chromozomu A Chromozómová DNA Místo integrace B Klonovaný gen Místo integrace plazmid Klonovaný gen Chromozómová DNA Klonovaný gen plazmid Chromozómová DNA plazmid 1 Klonovaný gen A. Klonovaný gen je vložen do sekvence klonovaného úseku chromozomu, 2 x CO vede k integraci klonovaného genu. B. Klonovaný gen je vložen poblíž klonovaného úseku chromozomu, 1 x CO vede k integraci celého plazmidu včetně klonovaného genu. 50 Počet kopií klonovaného genu pro a-amylázu v B. subtilis a její aktivita v buňkách Počet kopií/genom 2 ^ geny na chromozomu 5 7 y 8 9 J Multicopy plasmid (20-40 kopií) Activita (U/mL rostoucích buněk) 500 2,300 3,100 3,400 4,400 700 Gen pro a-amylázu z B. amyloliquefaciens byl vložen do oblasti pocházející z chromozomu B. subtilis nakloňované v plazmidu E. coli, konstrukt byl vnesen do B. subtilis. Plazmid nesl rovněž geny pro rezistenci k chloramfenikolu a ampicilinu. Buňky B. subtilis s plazmidem byly pěstovány v prostředí s chloramfenikolem, což vedlo k selekci buněk se zvýšeným počtem kopií integrovaného plazmidu, tím zvýšení počtu kopií genu pro amylázu a ke zvýšení jejího množství v buňkách. 51 Struktura rozpoznávací sekvence lox P fága P1 —> GCATACAT AT/ At . GCATACAT ATAAC. GCATACAT 1 Podle orientace loxP sekvencí je úsek DNA mezi nimi místně specifickou rekombinací prostřednictvím Cre-rekombinázy buď deletován nebo invertován 52 Odstranění selekčního markem po vnesení plazmidu do bakteriálního chromozomu Marker loxP gene loxP Cloned gene Site of recombination v/Am Plasmid Homologous chromosomal DNA Homologous recombination II IS : 1 + Cre protein <- Gen cre je na samostatném plazmidu pod kontrolou lac promotoru (indukce IPTG) ŽŽŽŽH 53 Vlivy prostředí ovlivňující expresi genů a tvorbu produktů 1. Složení kultivačního media, zdroje živin (laktóza x glukóza - ovlivňují inducibilní systémy - lac) 2. Teplota (při nižší teplotě bývají cizí proteiny méně toxické) 3. pH 4. Koncentrace kyslíku 54 Důkaz tvorby cizorodého produktu • Imunologické testy • Enzymové testy • SDS-PAGE • Minibuňky • Maxibuňky • Transkripce a translace in vitro 55 Až 80% problémů při klonování cizorodých genů spočívá v toxicitě proteinů, zbývajících 20% je způsobeno jinými faktory (např. využívání kodonů) - Toxicita jednotlivých typů rekombinantních molekul pro hostitelské buňky: Rekombinantní DNA není obvykle „toxická", pokud neobsahuje repetitivní sekvence (méně než 1% případů) Funkční rekombinantní RNA může být toxická (asi 15% případů) Toxické proteiny (více než 80% případů) - normálně je protein vytvářen v určitém kompartmentu buňky, během definované časové periody a v určitém množství (prostorová, časová a kvantitativní exprese) - rekombinantní proteiny jsou vytvářeny do nefyziologických koncentrací - funkce rekombinantních proteinů může být pro buňky škodlivá až toxická -pomalejší růst buněk, nižší hustota buněk 56 57