Klonování genů v kvasinkách Důvody pro klonování genů v eukaryotech A. Funkce charakteristické pro eukaryotické buňky, které se u baktérií nevyskytují: - lokalizace systému regenerujícího ATP v mitochondriích, - uspořádání DNA v chromatinu - způsob dělení buněk, mitoza a meioza - diferenciace buněk, buněčné komunikace, signální dráhy B. Rozdíly v expresi genů u eukaryot oproti bakteriím: - odlišnost regulačních sekvencí pro transkripci, translaci a export - specifické posttranslační modifikace i Výhody kvasinek pro Gl • jednoduchá e u kary o ta s mikrobiálním charakterem (malý genom se známou sekvencí, krátká generační doba a vysoký počet potomstva, kultivace na definovaných půdách, řada mutant získaných a charakterizovaných klasickou i moderní genetikou • řada genů homologních vyšším eukaryotům, podobná buněčná biochemie a regulace genů • možnost stanovit dominanci a recesivitu alel (na haploidním pozadí) • vysoká frekvence homologní rekombinace - záměny genů • tradiční dobře definovaný a bezpečný biotechnologický organismus, možnost přípravy farmak pro humánní medicínu, • eukaryotické proteiny vytváří v aktivní podobě, lze dosáhnout sekrece do prostředí 2 Životní cyklus kvasinek Zygotic diplophase Conjugation 00« (20 a/a Meiosis and ^—sporulation an ^Haploid aO Oa spores Oa 0 acQ Haplophases Oa tetrádová analýza Dva typy haploidních buněk: a a g Heterotalické kmeny - stabilní Homotalické kmeny - nestabilní, haploidní buňky spontánně revertují na opačný buněčný typ Molekulární struktura kvasinkového 2\i plazmidu Type B EcoRIjjJ, /-v 6,3 kb; 50-100 kopií REP - replikace FLP - rekombince STB - rozklad kointegrátu FRT site = Flp recombination target Flp recombinase = flippase Systém Flp/FRT ~ Cre/loxP Chimérické plazmidy vytvořené spojením plazmidů 2|u a pMB9 štěpených EcoRI, (dále pak vložení genu Ieu2 z kvasinkového chromozomu do místa Pstl na plazmidu) Kyvadlové vektory pro klonování genů v kvasinkách \ kvasinkový Ieu2 Amp bakteriálni počátek replikace kvasinkový počátek replikace Přenos do kvasinek: transformace protoplastů elektroporace Príprava protoplastů: lytikáza, zymolyáza transformace E. coli E. coli plazmidy se mohou přenášet z kvasinek do E. coli a naopak transformace kvasinky leir kvasinková buňka Základní typy kvasinkových vektorů Integrující se~ pBR322, stabilní po integraci Amp ura3 Replikující se malý počet kopi nízká stabilita cirkulární 2ji-DNA ura3 Epizomální, malý počet kopi stabilní nesoucí centromeru (jediná kopie; stabilní) AmpR Amp ARS CEN3 ARS ura3 ura3 Možnost eliminace bakteriálních sekvencí jejich ohraničením FLP 6 Umělý kvasinkový chromozom (YAC) CENA ARS2 TRPJ\ AMP BamHI BamHI EcoRI ARS2 CENA TRPÍ BamHI TEL URA3 EcoR| Genomic DNA Cut with EcoRI and BamHI EcoRI AMP ori TEL BamH, i- EcoRI EcoRI L. EcoRI EcoRI Partial digest with EcoRI EcoRI EcoRI EcoRI EcoRI -1 EcoRI Selekční markery: AMPr - E. coli TRPÍ, URA3 - kvasinky Mix and ligate TEL U R A3 .EcoRI EcoRI^?S2 Genomic DNA CENA 1 Transform into ade , ura , trp yeast and select for red, URA+, TRP* colonies AMPR ori TEL 7 Virům podobné částice odvozené z Ty elementů nesoucích kódující oblast HIV1 TAT Ty-element: 30-40 kopií v genomu S. cerevisiae, velikost 5,9 kb LTR - 334 bp, levá funguje jako promotor genů pro RT a integrázu. Pseudovirion (virus like particle, VLP) obsahuje mRNA, dsDNA, RT a integrázu 8 Životní cyklus Tyl PIC - PREINTEGRATION COMPLEX 9 Promotor kvasinkových genů 2|j ORI transpozice amplifikační kazeta začleňující se do mnoha míst genomu kvasinky Transkript vloženého 8 (klonovaného) genu URA3 Struktura vysokokopiového plazmidu používaná pro začlenění modifikovaného Ty elementu nesoucího klonovaný gen do chromozomu kvasinky. pGAL a P jsou kvasinkové promotory, 5 (delta sekvence ) jsou LTR Použití při přípravě vakcín - fúzní plášťový protein obsahující např. antigény z plazmodií (malárie) Table 13.1 Properties of different yeast vectors \/ ^ KT^) R Transformation Copy no./ non-selective Vector frequency cell medium Disadvantages Advantages integrující se Yip epizomální (ori 2 ji) replikující se (ars) YEp YRp centromérový YCp umělý chromozom YAC transpoziční Ty 102 transformants per ng DNA 103-105 transformants per )jg DNA 101 transformants per ng DNA 25-200 1-20 10" transformants per [ig DNA 1-2 1-2 Depends on vector used to introduce Ty into cell -20 Much less than 1% per generation 1% per generation Much greater than 1 % per generation but can get chromosomal integration Less than 1 % per generation Depends on length: the longer the YAC the more stable it is Stable, since integrated into chromosome 1 Low transformation frequency 2 Can only be recovered from yeast by cutting chromosomal DNA with restriction endonuclease which does not cleave original vector containing cloned gene Novel recombinants generated in vivo by recombination with endogenous 2-^m plasmid Instability of transformants Low copy number makes recovery from yeast more difficult than that of YEp or YRp vectors Difficult to map by standard techniques Needs to be introduced into ceil in another vector 1 Of all vectors, this kind give most stable maintenance of cloned genes 2 An integrated Yip plasmid behaves as an ordinary genetic marker, e.g. a diploid heterozygous for an integrated plasmid segregates the plasmid in a Mendelian fashion 3 Most useful for surrogate genetics of yeast, e.g. can be used to introduce deletions, inversions and transpositions (see Botstein & Davis 1982) 1 Readily recovered from yeast 2 High copy number 3 High transformation frequency 4 Very useful for complementation studies 1 Readily recovered from yeast 2 High copy number. Note that the copy number is usually less than that of YEp vectors but this may be useful if cloning gene whose product is deleterious to the cell if produced in excess 3 High transformation frequency 4 Very useful for complementation studies 5 Can integrate into the chromosome 1 Low copy number is useful if product of cloned gene is deleterious to ceil 2 High transformation frequency 3 Very useful for complementation studies 4 At meiosis generally shows Mendelian segregation 1 High-capacity cloning system permitting DNA molecules greater than 40 kb to be cloned 2 Can amplify large DNA molecules in a simple genetic background Get amplification following chromosomal integration 11 Selektovatelné markery u kvasinek Gen Enzym Selekce HIS3 Imidazole glycerolphosphate dehydratase histidine LEU2 (3-lsopropylmalate dehydrogenase leucine LYS2 a-Aminoadipate reductase lysine TRP1 N-(5'-phosphoribosyl)-anthranilate isomerase tryptophan U R A3 Orotidine-5'-phosphate decarboxylase uracil Pozitivní selekce na mediu bez příslušného faktoru G418 - rezistence k geneticinu (KanR) 12 Využití genu LEU2 jako selekčního markeru (a) Kvasinka Ieu2 Chromozomy bez genu LEU2 (b) Použití LEU2 jako selektivního markeru Kolonie Ieu2 Ť Médium musí obsahovat leucin Transformovat kvasinky Přežívají pouze transformované buňky Vektor - nese správný gen LEU2 / 1 i Minimální médium - bez leucinu Začleňování epizomálních plazmidů do chromozomu kvasinek YEp13 Slouží současně jako selekční marker LEU2 leu - Rekombinace --Chromozomální DNA kvasinek LEU2 leu Plazmidová DNA 14 Výhody dostupnosti různých typů kvasinkových vektorů • Všechny kvasinkové vektory mohou být použity k vytváření částečných diploidů nebo částečných polyploidů, přičemž genové sekvence zavedené do buňky mohou být buď začleněny do chromozomu nebo přetrvávat v extrachromozomálním stavu. • Do klonovaných genů mohou být zaváděny in vitro mutace a pozměněné geny lze pak vrátit do kvasinky a nahradit jimi alely standardního typu. 15 Reportérové geny Gene Protein Size (amino acids) Original source Detection Reference cat Chloramfenikol- 219 £. coli Tn9 Acetylation of (Gorman, Moffat and acetyltransferáza transposon chloroamphenicol using 14C Howard, 1982) acetyl-CoA lačL ß-galactosidase 1024 E. coli Conversion of colourless ONPG to a yellow product; XGal blue-white screening (Norton and Coffin, 1985) gusk ß-glucuronidase 603 E. coli Conversion of MUG in a fluorometric assay; XGluc blue-white screening (Jefferson et aL, 1986) lue Luciferase 550 Photinus pyralis (firefly) Oxidation of luciferin to produce light (de Wet etal, 1987) GFP Green fluorescent protein 238 Aequoria victoria (jellyfish) Emits green fluorescence when exposed to blue or UV light (Chalfie etal, 1994) ONPG - o-nitrophenyl-/3-D-galactopyranoside. XGal - 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-/i-D-galactopyranoside. MUG - 4-methylumbelliferyl 0-D-glucuronide. XGluc - 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-^-D-glucuronide. 16 Exprese genů v kvasinkách • Pro účinnou expresi je žádoucí, aby klonované sekvence byly pod kontrolou kvasinkových promotorů - ty mají určitá specifika. Vektory proto mají promotory z kvasinek. • Poločas mRNA (1 -100 min) je silně ovlivněn netranslatovanými sekvencemi na 5'a 3'konci - jejich odstranění poločas zvýší • Kvasinky mají jiné využívání kodonů než bakterie nebo vyšší eukaryota. Při chemické syntéze genů je třeba volit kodony, které jsou čteny (96% aminokyselin v kvasinkových proteinech je kódováno jen 25-ti z 61 možných kodonů) • Exkrece proteinů: signální sekvence jsou dlouhé 20-90 aa. Přesná pravidla nejsou známa - u některých proteinů se exkrece nedaří. Sekrece zabrání rozkladu proteinu v cytoplazmě - proteolýze lze zabránit též změnou aa na N-konci (zábrana ubiquitace) 17 Exprese genů v kvasinkách - pokrač • Glykozylace - dochází ke glykozylaci cizích proteinů, ale struktura a sekvence oligosacharidů připojovaných na proteiny je odlišná než v přirozených hostitelích - to může mít důsledky pro stabilitu, imunogenitu a výslednou lokalizaci v tkáních (např. při terapeutickém používání) • Stabilita proteinů. Rychlá degradace proteinů po jejich syntéze nebo po rozbití buněk a purifikaci endoproteinázami, karboxypeptidázami a aminopeptidázami přítomnými ve vakuolách. Byla zkonstruována řada mutantních kmenů s pozměněnou aktivitou těchto enzymů. • Sestřih. Introny mají obecné rysy (5' GU - AG 3') a další konsenzuální sekvence. U kvasinek je před 3'místem sestřihu sekvence, která chybí u vyšších eukaryot. 18 Struktura kvasinkového promotoru 4 elementy: 1. TC(G/A)A a PuPuPyPuPu jsou u více než poloviny známých kvasinkových promotorů. Tyto sekvence nejsou u vyšších eukaryot, což ukazuje na rozdílný mechanismus jejich transkripčního aparátu. 2. TATAbox, oblast 20-120 nukleotidů před místem iniciace. 3. Sekvence umístěné proti směru transkripce podílející se na regulaci genů: A. sekvence aktivující transkripci (UAS) - vazba pozitivního regulačního proteinu na UAS zvyšuje rychlost transkripce, zatímco delece UAS transkripci potlačí. Důležitým strukturním rysem UAS je přítomnost jedné nebo více oblastí s dvojitou symetrií. B. sekvence reprimující transkripci (URS). Vazba negativního regulačního proteinu na URS snižuje rychlost transkripce genů, které jsou regulovány negativně. 4. Sekvence umístěné uvnitř samotného genu, které se označují jako aktivující sekvence umístěné po směru transkripce (downstream activating sequences, DAS). Nízká množství heterologních proteinů odráží nízké množství mRNAjako důsledek nízkého stupně iniciace transkripce. Např. vložení aktivující sekvence umístěné po směru transkripce genu PGK obnovuje rychlost transkripce mRNA. 19 Struktura typického kvasinkového promotoru TC(GA)A PuPuPyPuPu •*■ i Initiator Nejsou u vyšších eukaryot UAS URS TATA Kódující[ ] sekvence U regulovaných genů 40-120 bp 20-400 bp 100-1400 bp Ovlivňuje rychlost iniciace transkripce i Vložení do sekvence cizího genu Příklady konstitutivních ADHI - alkoholdehydrogenáza kvasinkových promotorů _ PGK - fosfoglycerolkináza používaných v expresních * PH05 - kyselá fosfatáza vektorech alfa-faktor (+ signální sekvence pro exkreci) -1 1-TXT Promotory S. cerevisiae využívané v expresních vektorech Promoter Podmínky pro expresi Tvorba produktu Acid phosphatase (PH05) Phosphate-deficient medium Inducible Alcohol dehydrogenase I (ADHI) 2-5% Glucose Constitutive Alcohol dehydrogenase II (ADHII) 0.1-0.2% Glucose Inducible Cytochrome cx (CYC1) Glucose Repressible Gal-l-P Glc-l-P uridyltransferase Galactose Inducible Galactokinase {GAL1) Galactose Inducible Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPD, GAPDH) 2-5% Glucose Constitutive Metallothionein (CUP1) 0.03-0.1 mM copper Inducible Phosphoglycerate kinase (PGK) 2-5% Glucose Constitutive Triose phosphate isomerase (TPf) 2-5% Glucose Constitutive UDP galactose epimerase (GAL10) Galactose Inducible 21 Gal systém S. cerevisiae využitý pro expresi genů PGAL1 GaM (galaktokináza) přirozený systém | Vazebné místo pro Gal4p Gal4p + galaktóza (induktor) Transkripční aktivátor P* t GaM Gen zájmu P*Gan= syntetický promotor obsahující více vazebných míst pro Gal4p konstrukt na vektorech + galaktóza (induktor) Gal4p GaM GAL4 ] 22 Exprese genů indukovaná galaktózou A. Gal4p vytvářený z vlastního promotoru B. Gal4p vytvářený z promotoru GaM GAL4 nízká hladina Gal4p, málo cílového produktu GAL1 vysoká hladina Gal4p, hodně cílového produktu Sekrece proteinů v kvasinkách Hlavní rysy sekretovaných proteinů: • jsou syntetizovány na endoplazmatickém retikulu • z ER jsou transportovány do Golgiho aparátu, kde jsou upraveny a zabaleny do sekrečních váčků • Fúze sekrečních váčků s plazmatickou membránou se děje konstitutivně nebo jako odpověď na externí signál • Nakonec jsou lokalizovány na buněčném povrchu nebo exportovány z buňky Proteiny přirozeně sekretované do růstového media a) pérovací feromony (a-faktor, a-faktor) b) killer toxin (proteinový produkt dsRNA n. dsDNA plazmidu n. VLP; molekuly působící toxicky na jiné kmeny kvasinek). • Polypeptidy určené k sekreci mají hydrofobní N-konec, který je odpovědný za translokaci do endoplazmatického retikula. • N-konec je obvykle tvořen 20 aminokyselinami a odštěpen ze zralého proteinu uvnitř endoplazmatického retikula. Bylo dosaženo sekrece řady ne-kvasinkových polypeptidů z rekombinantních plazmidů, ale pravidla pro sekreci nejsou zcela jasná. 24 Problémy při expresi některých proteinu v S. cerevisiae • nízká exprese klonovaných genů, nízký výtěžek proteinu • hyperglykozylace heterologních proteinů • pozměněný transport sekretovaných proteinů (zadržení v periplazmatickém prostoru) • tvorba vysoké koncentrace alkoholu, který usmrcuje buňky a snižuje výtěžek proteinů 25 Cílení proteinů do jádra Jádro kvasinky obsahuje sadu proteinů, které jsou syntetizovány v cytoplazmě. Pro objasnění mechanismu týkajícího se lokalizace proteinů v buňce byly zkonstruovány hybridní geny fúzí kvasinkového Matalfa genu, kódujícího předpokládaný jaderný protein, a genu lacZ z E. coli. Segment genového produktu MATalfa, který byl 13 aminokyselin dlouhý, byl schopen usměrnit (3-galaktozidázovou aktivitu do jádra. To bylo potvrzeno imunofluoroscencí. Podobné sekvence byly zjištěny u jiných proteinů a označeny jako nuclear localization signals (sequences) (NLS) Podle současného modelu pro import jaderných proteinů jsou proteiny obsahující NLS rozpoznány specifickými receptory (nuclear transport receptors) v cytoplazmě. Komplex NLS-receptor se pohybuje k jaderným pórům, které otvírá reakcí vyžadující ATP a dovoluje, aby protein vstoupil do jádra. 26 Klonování kvasinkových genů v buňkách E. colis využitím komplementace 5au3A partial cleavage Yeast cells Chromosomal DNA 30 % genů kvasinek se exprimuje v E. coli r Získávání nových kvasinkových selekčních markerů Most cells don't grow --5kbp- Four-base 1GATC " i /"sticky end" rffllfffFfrff fttfBfflih 1*1*1 Genová knihovna kvasinky Transform Leu" Piafe onto medium lacking leucin Přenos do mutantnich kmenů E. coli leu- Cells contain plasmid with LEU2 gene IEU2 gene functions in E. co/i hledaný gen 2i Klonování kvasinkových genů na základě genetické komplementace Xts recipient: kvasinkový kmen nesoucí ts mutaci v genu X a mutaci v genu Ieu2 -roste jen při 30°C Příp. ztráta nějakého znaku při vyšších teplotách Leu Plasmid library Yeast transformation Příprava genové knihovny z kvasinkového kmene s genem X(wt) ve vektoru obsahujícím jako selekční marker LEU2 Replica piafe Incubaíe plate at 30°C Plate onto medium locking leucine Incubate at 30°C (permissive temperature] |s| Only cells that contain a plasmid grow Incubate plate at 37°C (nonpermissive temperature) All cells grow Only cells that contain plasmid with wild-type gene X will grow at 37°C Determine DNA sequence of gene X izolace klonu X+ J Translate to obtain tjroteiiL sequence encoded 28 Začleňování genů homologní rekombinací Left half of URA3 Right half YFG pUC of URA3 / / Left half Right half olYFG URA3 pUC ^YFŠ I / / One chromosome contains YFG integrated at URA3 locus YFG = gen zájmu, jehož funkci sledujeme One chromosome contains URA3 gene intergrated at YFG Linearizace plazmidu v místě homologie zvyšuje frekvenci začlenění asi 100x Vnášení genů do chromozomu kvasinek pomocí integrativních vektorů Ampr gene or/'E - AI GOI LEU 2 A2 i-[ RE' RE Restriction endonuclease Transformation Kyvadlový vektor připravený v E. coli Recombination Chromosome ]—I I—I ,-|—I I-Chromosome GOI = gen zájmu Al, A2 = nesenciální geny 30 Vyprošťovací replikující se vektor Ieu2 ARS I II I 11 plazmid obsahující divokou aJelu MAT Xftol X/iOl ÄmpB ie«2 ARS plazmld s mezerou L_J MAT" □ mutovaná alela Linearizovaný plazmid se nereplikuje Část genu mat je vyštěpena, hraniční sekvence jsou ponechány Amp" Ieu2 I 1 11 ARS plazmld nesoucí MAT* může replikovat v kvasince -.j.-liÍ3^-, transformace £ ceff a vyhledání plazmidů nesoucích Inzert s MATv Homologní rekombinace a cirkularizace plazmidů, jejich izolace a přenos do E. coli, studium mutantní alely MAT" 31 Rekonstrukce plazmidu homologní rekombinací v kvasinkové buňce Vloženi nového selekčního markeru do plazmidu, preklonování genu zájmu do jiného typu vektoru JPvuI + Pvull i Recombination Pvul Eco Plazmid, který se v kvasince nereplikuje společně přeneseny do kvasinky transformací Plazmid, který se v kvasince replikuje Selekce klonů na HIS3, případně na UR A3 Vytěsnění a záměna plazmidů Piasmid shuffle Studium funkce mutantních a cizích genů Trojnásobný mutant TPK1-, TPK2-, TPK3- ura+, his+, trp+, ade-, leu- Myší cAMP dependentní PK Yeast ce O Mouse protein * kinase gene Transform into yeast Plate to select for Ade+, Leu+ transformers Medium lackin adenine and leucine All cells on plale contain both plasmids Culture a colony in complete medium {YPD) Cells can lose one of the two plasmids Plale cells onto YPD medium Cells need at least one protein kinase gene to grow Cells in colony contain only the C piasmid with TPK1 t Medium lacking adenine Cells in colony contain only the piasmid with mouse protein kinase gene Medium lacking leucine Umožňuje růst na mediu bez adeninu Zajišťuje životaschopnost buňky Selekce buněk obsahujících oba plazmidy - půda bez ade a leu Kultivace buněk za neselektivních podmínek Buňka si musí alespoň jeden z plazmidů s PK podržet Cell contains only the piasmid with TPKI Colony fails to grow Závěr: Gen pro myší proteinkinázu může nahradit gen TPK1- 33 Dvouhybridní systém ke studiu interakce proteinů (a) (b) UAS G UAS, DNA binding domain Activation domain l.^.BePQr^rľa8nB^J- Hybridní protein Gal4p-X se váže na promotor, ale není schopen aktivovat transkripci reportérového genu Hybridní protein Gal4p-Y se není schopen vázat na promotor a tudíž není schopen aktivovat transkripci (c) DBC »/ 1 -1 1- aÄijiGpQľter Oft n ft UAS, Interakce hybridních proteinů Gal4p-X::Gal4p-Y aktivuje transkripci 34 Plazmidy určené k vytváření fúzních proteinů s doménami Gal4p (DBD a AD) Selekce plazmidů Vyhledání genů, jejichž produkty interagují SNF4-GAL4 / hybrid gene Gene segment encoding GAU pNA-binding domain p-Galactosidase produced GAL) promoter SNF1 and SNF4 tightly associate p-Galactosidase produced SNF1 a SNF4 asociují za vzniku produktu s protein-kinázovou aktivitou GFP I funkčně aktivní TF se vytvořil spojením proteinů SNF1 a SNF4 - tj. tyto proteiny vzájemně interagují 36 Genetický důkaz funkce U2 snRNA (a) Wild-type strain (strain A) U2 snRNA (b) Mutant strain (strain B) (c) Mutant strain (strain B) / Wild-type U2 gene HIS4 gene X»9pro&nyrktw4 se vpiafilujilmtaty* tíckypňMsiňtiu * pint m strukturátni funket. m7G :'■,-■:! .yi-co k'ön'z'cr. q v p n ľ a S. eerevfrta« • vyrkytujt 9*1ét ujtoydt organizmů š vylimköü jř/psmism, ktoré nemaß sexvencí QUQUA v UfrsnRNA. & čtrtv/s/** rum* pyrimftfífmvf ůavte. I "UACUAÜCA Wild-type inlron i i iii ii Wild-type U2 snRNA Medium lacking histidine v Plate Cells make their own histidine and grow his4 mRNA spliced Pokus prokazuje, že U2 RNA se při sestřihu páruje přímo s intronem. Wild-type U2 gene Mutation Mutanf his4 gene Wild-type U2 gene r7£ya~\ •fc^UAClíAHOA^ Mutant intron iii i Wild-type U2 snRNA _I I I I_I i_ / Mismatch destabilizes RNA hybrid Plate Cells fail to grow histidine his4 mRNA not spliced Mutant his4 gene Introduce plosmid into cells by transformation _JiL_ uacaaIica--i i i i i ii Y Plasmid with mutant 172 gene / Base-pairing restored Selection for cells containing plasmid Mutant inlron Mutant U2 snRNA Medium lacking leucine / Replica plate Mutant strain can now make histidine hi$4 mRNA spliced H Studium funkce genu po jeho inaktivovaci selekčním markerem pUCll YFG = your favourable gene Cleave at sites A and B YFG ura3 mutant strain tri* f® @ A pair of homologous chromosomes Tranform Ura- diploid cells Disrupted gene replaces wild-type gene in one chromosome Plate onto medium lacking uracil YFG = gen zájmu, jehož funkci sledujeme, inaktivovaný genem URA3 YFG Other chromosome normal Sporulate Buňky obsahují jednu funkční a jednu nefunkční alelu YFG Dissect tetrads Characterize haploid cells 38 Tetrádová analýza: sporulací dochází k separaci mutantní a standardní alely Four haploid spore cells encased by One chromosome contains integrated URA3 gene at YFG Individual spores are loosely stuck together in tetrads / Separate four / spores from ascus Four spores from one ascus Complete All colonies are lira" No growth Conclusion: YFG is an essential gene Spory se nechají klíčit a růst, aby se vytvořily kolonie. Ze čtyř spor dvě ponesou alely standardního typu (YFG) a dvě budou mít alelu YFG přerušenou integrovaným genem URA3. Pokud je knokautovaný gen esenciální pro růst, vyrostou ze čtyř spor z každé tetrády do kolonií jen dvě, a žádná z nich nebude schopna růst na plotnách 39 bez uracilu (protože gen URA3 je pouze v knokautované alele). Rekombinantní proteiny vytvářené v expresních systémech S. cereviasiae VACCINES Hepatitis B virus surface antigen Malaria circumsporozoite protein HIV-1 envelope protein DIAGNOSTICS Hepatitis C virus protein HIV-1 antigens HUMAN THERAPEUTIC AGENTS Epidermal growth factor Insulin Insulin-like growth factor Platelet-derived growth factor Proinsul in Fibroblast growth factor Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor GCi antitrypsin Blood coagulation factor XHIa Hirudin Human growth factor Human serum albumin 40 Kvasinka Pichla pastori s Má schopnost metabolizovat metanol jako jediný zdroj uhlíku a energie Metabolismus metylotrofů umožňuje vytvářet „single-cell" proteiny - krmivo pro dobytek i člověka bohaté na proteiny Heterologní exprese proteinů v metylotrofní kvasince - Píchla pastori s Další druhy: Kluyveromyces lactis, Hansenula polymorpha 1. Jednoduché techniky pro genetickou manipulaci u Pichia, podobné jako u S. cerevisiae. 2. Kultivace za definovaných podmínek včetně velkokapacitní kultivace 3. Schopnost tvořit proteiny ve velkém množství, buď intra- nebo extracelulárně (samy tvoří jen málo vlastních exkretovaných proteinů) 4. Schopnost provádět eukaryotické posttranslační modifikace (glykozylace, tvorba disulfidických můstků a proteolytický procesing). 5. Dostupnost tohoto systému pro komerční účely. 42 Vektory pro expresi v Pichia a) jsou kyvadlové (+ E. coli) b) mají markery pro E. coli a pro kvasinky (ura, his, ade atd) c) mají expresní kazetu odvozenou z genu AOX 5'-promotorové sekvence terminátor transkripce mezi promotorem a terminátorem je MCS d) u sekrečních vektorů jsou signály z kyselé fosfatázy (PHO) nebo alfa-MAT (pro transport jsou někdy využívány chaperony) Hostitelské kmeny: nesou auxotrofní mutace pro selekci vektorů jsou proteáza deficientní Expresní vektory jsou často inzertovány do chromozomu Vektory s vícenásobnou kopií cizorodého genu a) kopie genu uspořádány „hlava k patě" b) vektor obsahující gen kanR - amplifikace pomocí G418 43 Metabolizmus metanolu Metanol induktor Alkoholoxidáza AOX1 aAOX2 Buněčné komponenty Formaldehyd + peroxid H dehydrogenázy Formiát + CO, energie Po indukci metanolem je 5 % transkriptů tvořeno genem pro alkoholoxidázu, která dosahuje až 30 % všech proteinů v buňce. Exprese klonovaných genů se zvýší až 1000x. V přítomnosti jiných substrátů (glukóza, glycerol, etanol) je hladina AOX nízká - promotor je přísně regulován (nepropouští) 44 Expresní vektor R pastoris gen Geny jsou klonovány za silný metanolem indukovatelný promotor genu alkoholoxidázy (AOX1) vložený do expresních vektorů. Syntéza proteinu je spouštěna přidáním metanolu do média, které neobsahuje jiný zdroj uhlíku - metanol tak tvoří jediný zdroj uhlíku 45 Konstrukce vektorů s kopiemi expresní kazety Inserce fragmentu BglII-BamHI do místa BamHI vektoru pA0816 Eafl | (EtmH lrBf>[ II) Exfíl BamHI Pat i- Ampe ■ľ-;! II Další selekční marker: rezistence ke kanamycinu (geneticinu) - selekce buněk se zvýšenou rezistencí = spontánní amplifikace kazety, vyšší výtěžky produktu 46 Začlenění genu klonovaného v integračním vektoru do specifického místa chromozomu R pastoris Integrační vektor 1 xCO GOI = gene of interest 2 x CO 5' AOX1 AOX1 3' AOX1 Reštrikční fragment vyčleněný z vektoru Chromosome 5' AOX1 GOI TT B HIS4 3' AOX1 Chromosome 47 Heterologní exprese genů v P. pastoris Selection of host strain: • wild types • protease-deficient strains • auxotrophic strains • glyco-engineered strains Swa\ Swa\ I Expression cassette \ —1 ' ! OCT TTfMrt^yHR^ Genomic integration: • single-/multicopy • homologous recombination • ectopic integration Promoter: • constitutive • inducible Selectable marker: • drug resistance • auxotrophy_ Intracellular protein expression SI sy? %ř Secretory pathway: • secretion signals: S.c. a-MF, P.p. PH01 • proteolytic processing, e.g.: Kex2p, Ste13p • glycosylation: N- or O-linked • membrane-associated proteins • surface display anchors 5HR, 3HR - úseky homologie s chromozomem pro začlenění kazety 48 Table 3: Heterologous proteins expressed in P. pastoris Protein Bacteria Bacillus. Ucheniformis a-amylase Bacillus sieurothermophilus o-alanine carboxypeptidase Bordetella pertussis pertussis pertactin (P69) Clostridium botulinum neurotoxin (BoNT) serotype A and B Clostridium botulinum neurotoxin heavy chain fragment, serotype B Clostridium botulinum neurotoxin serotype A binding domain Clostridium tetani tetanus toxin fragment C Escherichia coli acid phosphatase/phytase (appA2) Escherichia coli ß-galactosidase Escherichia coli ß-lactamase Leishmania major cathepsin B-!ike protease Staphylococcus aureus staphylokinase Streptococcus equisimilis streptokinase Streptomyces subtilisin inhibitor Streptomyces riridosporus T7A peroxidase, endoglucanase Toxoplasma gondii SAG1 antigen Vibrio cholerae accessory cholera enterotoxin (Acc) Fungi Alternaria Alt 1 allergen Aspergillus awumori glucoamylase Aspergillus awamori glucoamylase catalytic domain Aspergillus fumigatus catalase L Aspergillus fumigatus dipeptidyl peptidase IV (DPP IV) Aspergillus fumigatus dipeptidyl peptidase V (DPP V) Aspergillus giganteus ot-sarcin ribotoxin Aspergillus niger phytase (phyA) Candida guilliermondii xylose reductase gene (xyll) Candida rugosa lipase 1' (CRL) Fusarium solani pectate lyase (pelC) Fusarium solani pectate lyase (pelD) Geotrichum candidum lipase isoenzymes i Phytopluhora cryptogea ß-cryptogein Rhizopus oryzae lipase Saccharomyces cerevisiae ir.vertase Saccharomyces cerevisiae Ktrlp Saccharomyces cerevisiae (a-l,2-mannosyItransferase) Schizophyllum commune vitamin B2-aldehyde-forming enzyme Trametes versicolor (white rot fungus) laccase (IccI) Trichoderma harzianum ß-(l-6)-glucanasc Comments: mode, amount, signal sequence Reference 2.5 g r», SUC2 100 mg I"1, native 3 gl"' 78 mg I-' 390 ug g_I 2.4 mg total 12 gl"'. 28.9 U mg -l 2.0xl0J U mg-' a-MF 50 mg I-1. a-MF 77. mg I-1. . 2.47 g 1"' total protein, a-MF 12 mg rr, a-MF 7 mg I-1, a-MF S,a-MF..... S, 400 mg l"1, native S, 400 mg I"1, PHOl S, 2.3 g I-1, PHOl S. PHOl S. 0.15 mg I'1. PHOl S, I mg-l"', synthetic native, PHOl S, 65 U ml"1, a-MF I, 0.65 U mg"1; S, 0.18 U mg-1, a-MF S, 150 U ml-1, a-MF S, 1 mg I"1, PHOl S, native a-MF PHOl a-MF native S, 60 mg I-1, S, 45 mg I"1, S, 60 mg T1 S. 2.5 g r«, S, 400 mg I-1; PHOl S, 40 mg I"1, PHOl S, 120 mg r1, a-MF S, native and a-MF S, 9.3 mg I"1 [51.60] [61} [62] [63] [64] [65] [66] [67] [7] [20] [68] [69] [70] [71) [721 [73] [74] [75] [76] [47] ; [77] [78] [79] [43] [80] [81] [42] [82] [83] [84] [85] [86] [30] [87] [87] [88] [89] [90] I = intracelulární. S = sekretovaný 49 Table 3: Heterologous proteins expressed in P. pastoris Protein Protists Chondrus crispus red alga hexose oxidase Gracilariopsis knwneiformis red alga a-l,4-glucan lyase (GLql) Plasmodium falciparum merozoite surface prolein 1 (MSP-1) Plasmodium vno.v apical membrane antigen I (AMA-1) Reticulomyxa filosa (giant freshwater ameba) Cc2, ß2 tubulin isoforms Trypanosoma cruzi acid a-mannosidase Plants Allium sativum (garlic) alliin lyase Arabidopsis ihaliana NADHmitrate reductase Barley [Hordeum vulgare) sucrose fructan 6-fructosyl transferase Barky ot-amylasc ! Barley a-amylase 2 Barley aleuronc tissue a-glucosidase Coffee bean a-galactosidase Cynara cardunculus (cardoon) cyprosin Cynodon daaylon (Bermuda grass) Cyn d 1 Galuniluis nivalis agglutinin Hevea brasiliensis hydroxynitrile lyase Hevea brasiliensis Hcv b 7 patatin-like allergen Maize cytokinin oxidase Oat photochrome A, phA Oat photochrome A. phyA65 apoprotein Comments: mode, amount, Reference sjgnaj sequence l [91] I . (92] S,.24 mg I-1, a-MF [93] S, 50 mg I"1, PHOl [94] I, 400 ngg-' . .". [95) S, 11.5 fig I"1, native [96) I, 2.167 Ug_l [97] I, 18 jig g"1 [98.99] S, cc-MF [1001 S, 50 mg 1"', native [48] S, 1 mg l-', native [48] S, cc-MF [101] S, 400 mg I"1, a-MF [102] S, 1 mg l-', native [103] S, 1.5 g r1, PHOl [104,105] S, PHÄ-E (45] I. 22 g I"1 [106] S, 10 mg r1, a-MF (107.108] S, native [109] t, 30 >ig g~' (110.111] I, 20 ug g"1 [112] I = intracelulärni, S = sekretovany 51