BÍ8313 Praktikum z genového inženýrství Úloha č. 1 ODPOVĚDNÍ LIST A PROTOKOL K ÚLOZE č. 1. Klonování genu pro endolyzin bakteriofága 812F1 ze Staphylococcus aureus - seznámení s expresním vektorem pET28a(+) - návrh konstruktu pro expresi endolyzinu. 1. Jaká je funkce genu pro endolyzin lysFl a jaké další proteiny s endolyzinem interagují u přirozeného hostitele? ODPOVĚĎ: Gen kóduje bakteriofágový enzym, který má funkci peptidoglykan-hydrolázy a štěpí buněčnou stěnu hostitele [Staphylococcus aureus) v průběhu poslední fáze lytického cyklu. — GlcNac—MurNac —GlcNac—MurNac— I — GlcNac—MurNac— L"^la I I L-Ala D-Glu I I I D-Gta L-Lys—Gly—Cíly—Gly—Gly—Gly—D-Ala L-Lys—(Gly)5—D-Ala o-Ala CHAPK cleavage site Pro účinnou lyži a degradaci buněčné stěny je potřebný holin, který se akumuluje v v buněčné membráně a po dosažení kritické koncentrace tvoří póry, umožňující přístup endolyzinu k buněčné stěně, což vede ke smrti buňky. in 2. Z jakých funkčních domén se endolyzin skládá? Uveďte pozice domén na proteinu a napište, jakou mají funkci (využijte např. InterPro, Pfam nebo CD-Search). ODPOVĚĎ: Skládá se ze dvou domén: CHAP (cysteine, histidine-dependent amidohydrolases/peptidases) s peptidázovou funkcí, štěpí peptidický můstek v peptidoglykanu. Popis např. zde BÍ8313 Praktikum z genového inženýrství Úloha č. 1 (https://www.ebi.ac.uk/interpro/entry/lnterPro/IPR007921/) a SH3b (src Homology-3 -bacterial) doména má vazebnou funkci a zprostředkovává interakci proteinu se substrátem a zvýšení koncentrace v místě vazby. Role SH3b domény zatím není detailně prostudovaná, jiné teorie žíkají, že imobilizuje endolyzin na zbytcích zlyzovaných buněk, aby nedocházelo k lyži zvnějšku u dalších potenciálních hostitelů pro bakteriofága. Popis např. zde (https://www.ebi.ac.uk/interpro/entry/lnterPro/IPR003646/). 3. Může rekombinantní endolyzin LysFl způsobovat lyži E. coli při expresi, a proč? ODPOVĚĎ: Nemůže, protože v systému není přítomen holin. Přesto, pro zajištění větší stability konstruktu, se doporučuje nejprve vytvořený konstrukt transformovat do buněk, které nejsou expresní (TOP10F) a po selekci klonů transformovat do expresních buněk (BL21). 4. Proveďte in silico reštrikční analýzu předpokládaného genu pro fágový endolyzin pomocí nástroje NEBcutter V2.0 (http://nc2.neb.com/NEBcutter2/). ODPOVĚĎ: Gen štěpí následující enzymy, restriktázy Ncol a BamHI, se kterými plánujeme pracovat, gen neštěpí. 1 l _l_ _1_ II Uňcii LSmlI Hinfl Mlyl Plel Hindi Hpal -BspCNI HpylSSIII lluol NlalV PflMI BtsCI *FokI ||LEcoNI HpyňV NlalII CviAII Fatl Dral Unii AflIII I L*Hh L*Hi Hnal nPH I II l-Bpml ■Xml SfcI BstEII I I Usu BciVI EspMI Bfuňl ľlfel . 850 BsaJI New DNA Custom digest View sequence ORF summary Save project Print ility All commercial All Display 2 cutters 3 cutters Zoom in More. . Minimum ORF length to display: 100 aa CK 0 cutters 1 cutters All sites Save all sites Flanking enzymes 5. Navrhněte primery s vhodnými restrikčními místy tak, aby je bylo možné použít pro klonování genu pro fágový endolyzin LysFl s His-tagem na C-konci - barevně znázorněte na sekvenci primem reštrikční místa, část komplementární ke genu pro endolyzin, případné nukleotidy navíc a případné nukleotidy pro změnu původní sekvence. ODPOVĚĎ: Použijeme strategii modifikace konců produktu PCR prostřednictvím prodloužených 5-konců primerů, které ponesou místa pro reštrikční endonukleázy. Schématické znázornění návrhu primerů pro klonování s RE místy je na následujícím obrázku (sekvence je pouze příklad, ne z naší úlohy). BÍ8313 Praktikum z genového inženýrství Úloha č. 1 Extra sekvence EcoR I Hybridizační sekvence Forward primer 51 TAACTGAATTCTACTAGCTTTTAGGGTTGGG3" Extra sekvence Kpn I HyBridizaěni sekvence Reversa přiměř 5' TGATGGTACCATAAATCTAGTACTAGCTA3' Reverse pr rer 3' AT CG AT C ATG ATCTA A ATA Cg&--~ 5TACTAGCTTTTAGGGTTGGG N^TJ>rffHWfl77 TAGCTAGTACTAGATTTAT 3 3'ATGATCGAAAATCCCAACCC J^KJ^^LjJ^LĽ ATCGATCATGATCTAAATA5' ^-rCTACTAGCTTTTAGGGTTGGG 3' -r^^C^3-^~ Forward primer V dalším kroku prověříme sekvenci vektoru a restriktázy jejichž místa budou na 5'-koncích primerů vybíráme tak, aby konstrukt obsahoval důležité regulační signály pro expresi, tj. promotor, RBS, start-kodon, His-Tag na C-konci proteinu a stop-kodon. T7 mwefef pi'iiri<*6934S-3 pET upstream primer #65214-3 ( j-, mn,BMt * / v __jj, enJII I T7 promotér >t _lac operátor_ xbai \ rbs \ AGA T C T C G A T C C C G C SA A A TnSU^C^ĽJ^J^MrfftľC' cCAATrúTCAClCCA'AACAATTCCCCTC TAGAÍA" AAT""7CT""fiAC ""TftAGAACCAír ŕxtool His-Tag_ MffeJ Nhe I T7-Tag__SV_X rATACCATCCC:ACCAiCCA":*TCATCArCATCACACCACCCGCCTCCTGCCGCCCCCCAGCCAT*TGGCTÍGCATGACTI3aTGGACAGCAJI MetGI ySerSerHI sHIsHisHIsH i sHI sSarSarG I yLeuVa I ProAr-aG I ySerH i sMs t A I oSarMetThrG I yG lyGI riG In _ BamH I EcríR I Sac I Safl Hind III Atofl Xftol / His-Tag > ATGGGTCGCGGATCCGAATTCGAGCTCCGTCGACAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGCftCCACCACCACCACC^crGAGATCCGGCTGCTAACAAAGCCC pET-26al- I Met G I yAľíjG I ySerG I uPhsG I uLeuArgAríjG I nA I qC ysC I yAi-qThrArqA I aj roJrcP roPsaPťŽLauArrjSei-G I yCysEnd Jelikož požadujeme His-Tag na C-konci proteinu, jedinou restriktázou, která připadá v úvahu na 3-konci genu je Ncol. Na 5-konci genu připadá v úvahu série restrikčních míst od BamHI až po Xhol. Primer EndoFl NcoBam low: nesoucí /Vcol-místo (5'- T AAG C>lc ATG G CT AAG ACTC AAG C AG AA -3') Primer SH3upB: nesoucí BamHI místo (5'- ATAGJGATCCTTGAATACTCCCCAGG -3') komplementární část: podtrženo, reštrikční místa (RE): žlutě Stojí za povšimnutí, že budoucí start kodon ATG je součástí restrikčního místa Nco\. Takto zajistíme zachování správného čtecího rámce klonovaného genu. Nukleotidy „navíc" v primeru (černě) vyžadují restriktázy, které neumí štěpit DNA, pokud se jejich RE místo nachází bezprostředně na konci produktu PCR. Složení této sekvence je v podstatě libovolné, jen nesmí vést k tvorbě vlásenky a dimery primerů. 6. V sekvenci genu pro endolyzin fága 812F1 barevně znázorněte: start kodon, stop kodon, sekvenci komplementární k příměrům navrženým pro klonování >EF136588.1 Staphylococcus phage 812 strain phi812Fl putative holin and truncated endolysin genes, complete cds BÍ8313 Praktikum z genového inženýrství Úloha č. 1 t tagaagat t tagataacaaacaaat gt ct gaagt tat caaaaaactaaac caaat taatgagtaagtg t taaattaatatagataaacat gaccgacctactgttatattattgttagaaataaatataatagaaag gtcggttttttaatggctaatgaaactaaacaacctaaagttgttggaggaataaaccttagcacaaga ac taagag caaaacat tttgggtag caat tatat cag cagtag cat tat t t g c taac caaat tatag gt gctttcggtttagactactcagctcaaattgagcaaggtgtaaatattgtaggttctatactaacacta ttagcaggtttaggtattattgttgataataatactaaaggtcttaaagatagtgatattgttcaaaca gac tat c t taaac c t c gt gatagtaaagac c c taat gaat t c gt t caat g g caag caaat g caaataac actagtactttt gagatagacag c tac gaaaacaat g cagaac c t gacacagat gatagt gat gaagta c c t g c tat t gaagat gaaat t gat g gt g gt t cag cac c t t c t caagat gaagaagatac c gag gaacat ggtaaagtat t t gcagaggaggaagt taagtaat g g c taagac t caag cagaaataaataaacgtttag at g c t tat g caaaag gaacagtagatag c c c t tacagagt taaaaaag c tacaagt tat gac c cat cat ttggtgtaatggaagcaggagccattgatgcagatggttactatcacgctcagtgtcaagaccttatta cagac tat gt t t tat ggt taacagataataaagt tagaac t t g g g gtaat g c taaagac caaat taaac agagt tat g gtac t g gat t taaaatacat gaaaataaac cttctactgtacc taaaaaag gt t g gat t g cggtatttacatccggtagttatgaacagtggggtcacataggtattgtatatgatggaggtaatactt c tacat t tac tat t t tagag caaaac t g gaat ggt tat g c taataaaaaac c tacaaaac gt gtagata at tat tac g gat taac t cac t t cat t gaaatac c t gtaaaag cag gaac tac t gt taaaaaagaaacag c taagaaaag c g caagtacac c g g caac tagac cagt tacag gt t c t t g gaaaaagaac cagtac g gaa cttggtataaaccggaaaatgcaacatttgtcaatggtaaccaacctatagtaactagaataggttctc cattcttaaatgctccagtaggcggtaacttaccggcaggggctacaattgtatatgacgaagtttgta tccaagcaggtcacatttggataggttataatgcttacaacggtaacagagtatattgccctgttagaa cttgtcaaggtgttccacctaatcaaatacctggcgttgcctggggagtattcaaa^Baatataaatt tagac ggat t taaaat c c gt ctat t t t t tt t gcaaaaaagt gt t gacaaaat taaatacatagt gtata gt tatatat gtaat caaataaag gag gaat tacat g g cac tac t t t taacatat t t t g c tat t t t tat t Start kodon: zeleně, stop kodon: červeně, komplementární sekvence k templátu: žlutě a podtrženo. Přirozený stop-kodon není součástí reverzního primeru, protože chceme aby sekvence byla přeložena až po His-Tag, kdy bude využit stop-kogon za His-Tagem na vektoru. Při návrhu reverzního primeru a připojování restrikčního místa věnujeme pozornost tomu, abychom zachovali správný čtecí rámec pro překlad His-Tagu (varianty plasmidu a-c se zde mohou lišit). 7. Uveďte vámi navrženou sekvenci konstruktu LysFl+His-tag od start kodonu až po stop kodon, ověřte translaci in silico. Jaká je délka genu a proteinu? Start kodon: zeleně, velkými písmeny sekvence genu bez stop-kodonu, malými písmeny sekvence z vektoru, stop-kodon: červeně ATGGCTAAGACTCAAGCAGAAATAAATAAACGTTTAGATGCTTATGCAAAAGGAACAGTAGATAGCCCTTACA GAGTTAAAAAAGCTACAAGTTATGACCCATCATTTGGTGTAATGGAAGCAGGAGCCATTGATGCAGATGGTTA CTATCACGCTCAGTGTCAAGACCTTATTACAGACTATGTTTTATGGTTAACAGATAATAAAGTTAGAACTTGGG GTAATGCTAAAGACCAAATTAAACAGAGTTATGGTACTGGATTTAAAATACATGAAAATAAACCTTCTACTGTA CCTAAAAAAGGTTGGATTGCGGTATTTACATCCGGTAGTTATGAACAGTGGGGTCACATAGGTATTGTATATG ATGGAGGTAATACTTCTACATTTACTATTTTAGAGCAAAACTGGAATGGTTATGCTAATAAAAAACCTACAAAA CGTGTAGATAATTATTACGGATTAACTCACTTCATTGAAATACCTGTAAAAGCAGGAACTACTGTTAAAAAAGA AACAGCTAAGAAAAGCGCAAGTACACCGGCAACTAGACCAGTTACAGGTTCTTGGAAAAAGAACCAGTACGG AACTTGGTATAAACCGGAAAATGCAACATTTGTCAATGGTAACCAACCTATAGTAACTAGAATAGGTTCTCCAT TCTTAAATGCTCCAGTAGGCGGTAACTTACCGGCAGGGGCTACAATTGTATATGACGAAGTTTGTATCCAAGCA G GTCACATTTG G ATAGGTTATAATGCTTACAACG GTAACAG AGTATATTG CCCTGTTAG AACTTGTCAAG GTGT TCCACCTAATCAAATACCTGGCGTTGCCTGGGGAGTATTCAAggatccgaattcgagctccgtcgacaagcttgcggccgcact cgagcaccaccaccaccaccaďjjjjj] Protein charakterizujeme např pomocí https://web.expasv.org/protparam/ Number of amino acids: 3 05 Molecular weight: 337 0 0.8 7 Theoretical pi: 9.18 maktqaeinkrldayakgtvdspyrvkkatsydpsfgvmeagaidadgyyhaqcqdlitd BÍ8313 Praktikum z genového inženýrství Úloha č. 1 yvlwltdnkvrtwgnakdqikqsygtgfkihenkpstvpkkgwiavftsgsyeqwghigi vydggntstftileqnwngyankkptkrvdnyyglthfieipvkagttvkketakksast patrpvtgswkknqygtwykpenatfwgnqpivtrigspflnapvggnlpagativyde vciqaghiwigynayngnrvycpvrtcqgvppnqipgvawgvfkdpnsssvdklaaaleh hhhhh* 8. Uveďte vhodné reakční podmínky pro PCR s navrženými primery pro klonování, vezměte v úvahu Tm primerů, délku produktu, interakce primem. ODPOVĚĎ: Pokud je k dispozici ověřený protokol, je ideální řídit se tímto protokolem. V opačném případě použijeme následující postup: Vždy se však optimalizuje Annealing temperature - teplota pro hybridizace primerů a doba jejich prodlužování. Pro výpočet Annealing temperature je vhodné využít některý z online nástrojů - například Tm Calculator (ThermoFisher Scientific). Výstup po vložení komplementárních sekvencí primerů: ID #1 Sequence #1 Molecular Extinction Tm ID#2 Sequence #2 Molecular weight coefficient °C weight g/mol ľ(moľcm) g'inol Export table data into Excel Extinction Tm Annealing coefficient l/(mol'cm) Temperature °C Primer* 1 ATGGCTAAGACTC AAGCAGAA 6472.3 218800.0 62.4 Primerŕŕ2 TTGAATACTCCCC AGG 4841.2 151100.0 64.6 Doporučovaná Annealing Temperature je pro tento pár primerů 54,6 °C. Čas prodlužování primerů je výrobcem Taq-polymerázy doporučován 15 - 30 sekund na kb. Budeme-li počítat s 30 s na každou kb u našeho genu, vyjde nám optimální potřebný čas přibližně 25 s. Dále můžeme optimalizovat koncentraci MgCI2. 9. V bodech popište další kroky klonování až po expresi fágového endolyzinu a funkční test pro ověření exprese. a) Štěpení vektoru i inzertu a defosforylace štěpeného vektoru b) Ligace vektoru s inzertem c) Transformace E. coli TOP10F', ověření pozitivních klonů d) Pretransformovaní do expresních buněk BL21 e) Indukce exprese pomocí IPTG a test citlivosti k rekombinantnímu endolyzinu na plotnách ----------------------------------------------Protokol z praktické úlohy----------------------------------------- 10. Uveďte koncentrace DNA stanovené na Nanodropu a. Koncentrace izolovaného vektoru b. Koncentrace štěpeného vektoru po defosforylaci a purifikaci z gelu c. Koncentrace PCR produktu po štěpení restriktázami a přečištění Naměřené koncentrace použijeme v následujícím příkladu BÍ8313 Praktikum z genového inženýrství Úloha č. 1 11. Vypočítejte složení ligační směsi: Máte vektor s délkou 5369 bp a inzert o velikosti 855 bp. Vektor má koncentraci 25 ng/u.1, inzert 60 ng/u.1. Kolik u.1 vektoru a inzertu dáte do 20 u.1 ligační směsi, pokud chcete dosáhnout molární poměr 1:3. Trochu jiný vzorec, než jste měli v zadání: (ng) vektoru x (kb) velikost inzertu inzert -7771—77\-;-x molarni poměr—:- = ng inzertu kb) velikost vektoru vektor Na 25 ng (1 u.1) vektrou přidáme do ligační směsi: [(25 x 0,855)/5,369]x3/l = 11,9 ng inzertu, tj. 0,2 u.1 uvažujeme-li koncentraci 60 ng/ul I Skríning klonů pomocí PCR z kolonií I BÍ8313 Praktikum z genového inženýrství Úloha č. 1 13. Doložte a popište foto ploten s transformovanými E. coli TOPlOF's příslušnými kontrolami. 14. K čemu dochází při působení par chloroformu na expresní buňky E. coli v kterých je přítomen expresní vektor s nakloňovaným genem pro endolyzin. Po přidání IPTG nejprve inkubueme kulturu několik hodin, aby došlo k expresi. Potom působíme parami chloroformu, kdy dojde k narušení buněčné stěny a membrány E. coli a k uvolnění exprimovaného endolyzinu. Lytickou aktivitu prokážeme přelitím plotny agarem s buněčnými stěnami stafylokoků. 15. Doložte a popište foto ploten s chloroformovým testem s příslušnými kontrolami. Foto ploten s chloroformovým testem s příslušnými kontrolami. Kolem pozitivních klonů jsou patrné lytické zónky. 16. Doložte a popište foto zymogramu s příslušnými kontrolami. BÍ8313 Praktikum z genového inženýrství Úloha č. 1 Nahoře standardní SDS-PAGE gel obarvený Coomassie Brilliant Blue. Dole zymogram - renaturovaný SDS-PAGE gel, do kterého jsou zalité buněčné stěny stafylokoka, obarvený metylénovou modří. Vz, bakteriální proteiny po expresi; FT, proteiny z kultury BL21 bez plazmidu; M, marker; D4-D8, frakce purifikovaného proteinu SDS-PAGE ZYMOGRAM c Zymogram studentů, kde renaturovaný gel není obarvený a lytická zóna je vidět přímo na úbytku zákalu buněčných stěn přidaných do gelu