BÍ8313 Praktikum z genového inženýrství Pracovní list č.3 Úloha 3: Editace septa u E.coli pomocí systému CRISPR/Cas9 - seznámení s vektorem pdCas, úprava vektoru pro editaci septa v E.coli 1. Jaká je funkce genu ftsZ u E. coli, a jaký fenotypový projev očekáváte po vyřazení jeho funkce? Geny ftsA-ftsZ se účastní regulace tvorby septa u E. coli. Před vlastním rozdělením buňky dochází k hromadění proteinů účastnících se tvorby septa ve středu buňky. Struktura se nazývá „Z-ring". Z-ring slouží jako kostra pro 20 dalších známých proteinů. Celý tento komplex se nazývá „divisome". Samotný „Z-ring" je tvořen minimálně šesti proteiny, včetně filamentárního proteinu FtsZ a membránových proteinů FtsA a ZipA. Buněčný obsah proteinu FtsZ musí být regulován. Jeho nedostatečná nebo naopak nadbytečná exprese vede k tvorbě buněk vláknitého tvaru s nadbytečným počtem kopií bakteriálního chromozomu. Takováto změna exprese je pro buňky E. coli letá lni. 2. Popište jednotlivé komponenty, které jsou nutné pro vytvoření fungujícího CRISPR/Cas9 vektoru pro editaci prokaryotických genomů. i) expresní vektor se schopností se replikovat v buňkách E. coli ii) vhodný selekční marker na vektoru pro možnou selekci úspěšných transformant iii) pro expresi je ve vektoru nezbytná přítomnost regulačních sekvencí pro transkripci (promotor, terminátor) a translaci (RBS). iv) vektor musí dále obsahovat tyto složky CRISPR/Cas9 systému: nukleáza Cas9 (v našem případě bez katalytické domény, pouze pro umlčení exprese genu, gRNA - obsahuje sekvenci mezerníku (crRNA) cílícího na upravovanou oblast, tracrRNA - krátká RNA tvořící komplex s crRNA navádějící Cas9 protein k cílovému místu editace 3. Z jakých funkčních domén se skladá Cas9 endonukleáza? Nukleáza Cas9 se skládá ze dvou funkčních domén. Oblast s nukleázovou aktivitou (NUC) a oblast s rozpoznávací funkcí (REC) tvořená a-helix (Obr. 1A). Oblast NUC obsahuje tři domény: i) HNH nukleázová doména štěpící cílový (komplementárnní) řetězec DNA, ii) RuvC nukleázová doména štěpící „nontarget" řetězec (nekomplementární) DNA, iii) Oblast REC obsahuje region rozpoznávající komplex tvořený gRNA/cílová DNA sekvence (Obr. 1B). Pro CRISPR/Cas9 je navíc nutná přítomnost PAM sekvence tzv. protospacer-adjacent motiv zajišťující specifické navedení Cas9 k cílové DNA sekvenci. PAM sekvence musí být součástí cílové sekvence DNA. Obr. 1. Struktura proteinu Cas9. A. Struktura Cas9 proteinu Streptococcus pyogenes, B. Mechanismus působení CRISPR/Cas9 systému. BÍ8313 Praktikum z genového inženýrství Pracovní list č.3 4. Navrhněte oliga pro vložení mezerníku do upraveného vektoru pdCas tak, aby mezerník cílil na gen ftsZ. V sekvenci genu ftsZ barevně znázorněte: a. sekvenční oblast na kterou cílí vámi navržený mezerník, b. PAM sekveci. Je nutné nejprve najít v naší cílové sekvenci PAM sekvenci (NGG) v blízkosti 3'konce editovaného genu, aby bylo možné expresi genu zastavit co nejdříve a nevznikaly potenciálně funkční zkrácené produkty. V sekvenci je vyznačena oblast, která byla použita pro mezerník využívaný v našem konstruktu s označením pdCas9_bact_T7p. >NC_000913.3:105305-106456 Escherichia coli str. K-12 substr. MG1655, complete genome ATGTTTGAACCAATGGAACTTACCAATGACGCGGTGATTAAAGTCATCGGCGTCGGCGGCGGCGGCGGTAATGCTGTTG AACACATGGTGCGCGAGCGCATTGAAGGTGTTGAATTCTTCGCGGTAAATACCGATGCACAAGCGCTGCGTAAAACAGC GGTTGGACAGACGATTCAAATCGGTAGCGGTATCACCAAAGGACTGGGCGCTGGCGCTAATCCAGAAGTTGGCCGCAAT GCGGCTGATGAGGATCGCGATGCATTGCGTGCGGCGCTGGAAGGTGCAGACATGGTCTTTATTGCTGCGGGTATGGGTG GTGGTACCGGTACAGGTGCAGCACCAGTCGTCGCTGAAGTGGCAAAAGATTTGGGTATCCTGACCGTTGCTGTCGTCAC TAAGCCTTTCAACTTTGAAGGCAAGAAGCGTATGGCATTCGCGGAGCAGGGGATCACTGAACTGTCCAAGCATGTGGAC TCTCTGATCACTATCCCGAACGACAAACTGCTGAAAGTTCTGGGCCGCGGTATCTCCCTGCTGGATGCGTTTGGCGCAG CGAACGATGTACTGAAAGGCGCTGTGCAAGGTATCGCTGAACTGATTACTCGTCCGGGTTTGATGAACGTGGACTTTGC AGACGTACGCACCGTAATGTCTGAGATGGGCTACGCAATGATGGGTTCTGGCGTGGCGAGCGGTGAAGACCGTGCGGAA GAAGCTGCTGAAATGGCTATCTCTTCTCCGCTGCTGGAAGATATCGACCTGTCTiflCGCGCGCGGCGTGCTGGTTAACA TCACGGCGGGCTTCGACCTGCGTCTGGATGAGTTCGAAACGGTAGGTAACACCATCCGTGCATTTGCTTCCGACAACGC GACTGTGGTTATCGGTACTTCTCTTGACCCGGATATGAATGACGAGCTGCGCGTAACCGTTGTTGCGACAGGTATCGGC ATGGACAAACGTCCTGAAATCACTCTGGTGACCAATAAGCAGGTTCAGCAGCCAGTGATGGATCGCTACCAGCAGCATG GGATGGCTCCGCTGACCCAGGAGCAGAAGCCGGTTGCTAAAGTCGTGAATGACAATGCGCCGCAAACTGCGAAAGAGCC GGATTATCTGGATATCCCAGCATTCCTGCGTAAGCAAGCTGATTAA Oligo 1_F: 5'GAAACTGGAAGATATCGACCTGTC 3' Oligo 2_R: 5'AAACGACAGGTCGATATCTTCCAG 3 5. V bodech popište další kroky klonování až po funkční test pdCas. 5'... GGTCTC (N)/. .3 3.. CCA GAG (N) . ..S' Nejprve vektor pdCas9_bact_T7p štěpíme RE Bsal: Naštěpený vektor zkontrolujeme pomocí ELFO a vyřežeme ho z gelu. Vektor pak přečistíme. Takto se zbavíme nenaštěpených fragmentů. Druhou možností je vektor po štěpení ihned defosforylovat, zabráníme tak znovuspojení štěpeného vektoru. Připravíme si kompetentní buňky Escherichia coli DH5a pro transformaci upraveného vektoru dle protokolu. Do naštěpeného vektoru budeme vkládat nasyntetizované oliga mezerníku cílícího do sekvence genu ftsZ. Oliga je nutné spojit. Připravíme si směs olig, T4 ligační pufr, T4 polynukleotid ligázu dle návodu. Krátce zahřejeme na 95°C (denaturace) a následně pomalu ochlazujeme, tak aby došlo k spojení olig (renaturace). Následně oliga a štěpený vektor spojíme ligací. BÍ8313 Praktikum z genového inženýrství Pracovní list č.3 Takto připravený vektor transformujeme do buněk Escherichia coli DH5a. Vektor izolujeme a připravený konstrukt ověříme sekvenací. Ověřený konstrukt potom přeneseme transformací do expresních buněk např. Escherichia coli BL21. V dalším kroku provedeme indukci exprese mezerníkové sekvence pomocí anhydrid-tetracyklinu. Nezapomeneme buňky s konstruktem nejprve inkubovat ve vhodném selekčním médiu, aby došlo k namnožení vektoru v buňkách (v našem případě se jednalo o přídavek chloramfenikolu). Funkční test je proveden pomocí konfokální mikroskopie, buňky jsou nejprve fixovány na sklíčku plamenem a následně barveny bazickým fuchsinem. 6. V laboratoři máte 2 vektory pCasSA a pACas_bakteria, které jste používali na jiné experimenty. Vytvořte jeden vektor, který by obsahoval gen pro ACas9 protein a gRNA, která by cílila na libovolný gen E. coli. Využijte k sestavení Vašeho vektoru informace, které jste obdrželi v teoretické části úlohy a které jsou uvedeny níže. Rozepište v jednotlivých krocích, jak budete při vytváření vektoru postupovat. Cílem je vytvořit plazmid, který bude schopný replikace a exprese v E. coli a bude obsahovat místo pro začlenění mezerníkové sekvence pro gRNA (aby se dalo měnit), dCas9 a další komponenty nezbytné pro správnou funkci vektoru. Promyslete, co je vhodnější přesunout do kterého vektoru a zda všechny expresní prvky patří organizmu, v kterém se bude celý systém exprimovat. Pro vizualizaci můžete využít volně dostupný program SnapGene Viewer (https://www.snapgene.com/snapgene-viewer/) Využijte k úpravě tyto dva plazmidy: pdCas9-bacteria: https://www.addgene.org/44249/ pCasSA: https://www.addgene.org/98211/ Námi upravený vektor vychází z vektoru pdCasSA, který byl původně vytvořen pro umlčování genů u druhu Staphylococcus aureus (Chen eŕ al., 2017). Tento vektor bylo nutné upravit tak, aby se nakloňované části exprimovaly v buňkách E. coli. Do vektoru byl v první fázi vložen indukovatelný promotor T7, terminator a RBS pro translaci (vše pro transkripci a translaci v E. coli). Součástí vektoru je potom oblast pro vkládání mezerníkové oblasti restriktázou Bsal. Nejprve jsme ale celou kazetu pro vkládání mezerníkové sekvence museli do vektoru vložit níže popsaným způsobem. Sekvence oblasti plazmidu pro vkládání CRISPR mezerníkové sekvence (vkládá se restriktázou Bsal) má tyto hlavní části: promotor......ATGGAAACGAGACCATTGGTCTCAGTTTTAGAGCTAGAAA........sgRNA Kompletní sekvence námi vložené kazety do našeho vektoru pdCas9_bact_T7p: Kazeta ve směru 5-3: TCATCCTAGGTAATACGACTCACTATAGGGAATATACAGGGGATTATATATAATGGAAACGAGACCATT GGTCTCAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGG CACCGAGTCGGTGCTTTTTTTGAGATCTGTCCATACCCATGGTCTAGAATGCTCGAGTCAGAAACCGCG GAGA Na koncích kazety jsou reštrikční místa Avrll CCTAGG a Sacll CCGCGG, kterými byla kazeta vložena do vektoru. Následně byl pomocí Bsal restriktázy vložen mezerník cílící na gen ftsZ (do oblasti zvýrazněné žlutě). BÍ8313 Praktikum z genového inženýrství Pracovní list č.3 Mapa námi vytvořeného vektoru pdCas9_bact_T7p (Obr. 2). Obr. 2: Vektor pACas9_T7 s nakloňovaným mezerníkem pro editaci tvorby septa cílící na gen físZ. A. Schématická mapa vektoru s hlavními funkčními částmi. B. Detail sekvence vkládaného mezerníku (zelený obdélník) agRNA. A. BÍ8313 Praktikum z genového inženýrství Pracovní list č.3 B. A C-ATAAAG TT CI TAG TG CATATAACAA AC ATA G AG-AC A AAC C A AT A C GT GAACAA&C A-G AAA AT AT 7 A TTCA T T T A T T T A i: G TT C ACGAAIC TT GG A G-CTCCCG CT GC T T T TA AATATT TTG AIACAACA .........I.........i.........I.........I.........i.........i.........I.........I.........i..........i.........i.........t.........I T C TAT TTCAAuAAICA-CuTATAT TůITIGTATCTÍTůTTTů&rTAT g C ac T TíjTľCGT-CTI TTATAATAA{jTAAaTaAATú^AaCT - * i ■>■>,■■■»!.........I.........f.^.l.L.I.........I.........f.. , ■ f. ,| ., ,,|. ,. ^......... TAAtTAŮCArTIGCTATATŮCAŮATGTITTCTICAAAATCTACGŮTŮA&AATAŮŮ^ ■ . ■ ■ IMS . . , ■ 1MO , , ■ , IMS ■ ■ , , lWfl ■ ■ ■ i l3B ■ i _r ■ 1*M -1 lM* ■ ■ ' 1lť AfQ Aŕft Lrt Tyŕ TTlŕ S^f Thŕ lyl Gly Vť Hw Afrľ- Al* Thŕ Utf IJfl Hit Girt Sflf 3H Thŕ Q\y Hu Tyf Glv TTlf Aŕfl |lfr Afp ljtf Sfif Girt fcjtu Qly Ajfr B Skwnaóa T? oligo gfiNA Sanger CTCCAŮ&C^TC>A*TAAAAC&AAAůflůTC^0TCŮAAACAÍT&CůCCTTTC&TTTTATf7ŮTTŮTT7ŮTCŮCTflAACŮCTCTCTACTAůAŮTC^CACT&CtTCACtTTCůíÚTO&OCCTTTtTůCÚTTT^T .........> ... - ľ - ... I.........I.........I.........I.........I.........I.........I ■ ■ ■ ■ t ■ ■ ■ ■ I ■ ■ ■ ■ 1 ■ ■ ■ ■ I.........I.........I.........1 GAGGTCCGTAGITTATTTTGCTTTCCGAGTCAGCTTTCTflACCCQGAňAGCAAAATA3ACAACAAACAGC^ I rrne Tl ttfflftJuter I I TTT> wrrénor I ACCTAŮŮTftATACŮACTCACTATAGŮŮAATATACAŮŮŮGATIATATATAATŮ6AAACTŮGAAGATATCŮAť:tr6ICGTTTTAŮAŮCTAGAAATAGCAAŮTTAAAATAAGUCIAa7CtGTTATCAACTTŮA TaOATeCATtAISCTUÍCiTSArArCCCirArAISIC^eCTAATArAIAITAOCTTTCACCITCTATASeTCSACASCAAÍAieTeSATCTITArCGTICAATTTJATrCCSArCÍCieOAATAaiTGAACT I promoter I ^EMSIjSEĽES^^ BitXl fi..... AAAAflTGGCACÍľGAGTCGOTaCTrTITTTGAGATCTOTC^ATACCCATaGTCTAGAATflCICGAaTCAGAAACCflCGGCAAAGCCaTTITTCCATAGaCTCCflCCCCCCIOACAAGCATCACGAAATCTG ..................i.........i.........i.........i.........!■,,,>,,,,.........<.........I.........f,.,.!.,.^ TTTTCACCOTGŮCTCAŮCCACCAAAAAAACTCIAaACAGŮTATOŮOIACCAŮATCTTACOAGCTCAOTCTTTŮOtGCCOTTICŮŮCAAAAAŮOTAICCCAŮGCGaCGŮGACrúTTCŮTAŮTŮCITTAOAC ACOCTCA »' ■ - ■ ■ h ■ ■ - ■ ' TGCOAGT 5 ' otázky k praktické části 7. Doložte a popište foto z mikroskopu. V mikroskopu po indukci exprese editačního systému a obarvení buněk bazickým fuchsinem je možné pozorovat buňky E. coli filamentárního tvaru (Obr. 3B). Protože tato změna je letální, je nutné mikroskopii provádět bezprostředně po indukci. Obr. 3: Funkční ověření editačního systému CRISPR/Cas9 u E. coli. A. Buňky E. coli bez editace tvorby septa. B. Buňky E. coli po umlčení genu ftsZ. A. buňky E. coli bez editace septa, B. buňky E. coli po umlčení genu ftsZ (světelný mikroskop, barveno bazickým fuchsinem).