Úloha 3: Blokování tvorby septa u E.coli pomocí systému CRISPR/Cas9 – seznámení s vektorem pΔCasSA, úprava vektoru pro editaci genu ftsZ řídícího dělení buněk E.coli Cílem teoretické úlohy je seznámit se podrobně s možnostmi editace prokaryotických genomů pomocí systému CRISPR/Cas9. CRISPR/Cas9 editační systém CRISPR/Cas9 systém, původně odhalen u bakterií jako forma imunitního systému, se v současnosti stal významným nástrojem pro editaci prokaryotických i eukaryotických genomů. Systém využívá tři komponenty pro štěpení cizorodých molekul DNA: CRISPR RNA (crRNA), transaktivační RNA (tracrRNA) a protein Cas9. Mezerník neboli crRNA (spacer) přímo cílí na komplementární DNA sekvenci, zajišťuje tak specifitu systému, zatímco tracrRNA je krátká RNA tvořící komplex s crRNA navádějící Cas9 protein k cílovému místu editace. Pro zjednodušení editačních systémů byly spojeny crRNA a tracrRNA do jednoho lokusu a tvoří v editačních systémech synteticky připravenou gRNA. Cas9 protein je endonukléza navádějící gRNA na cílovou sekvenci DNA. Skládá se ze dvou funkčních oblastí – oblast s nukleázovou aktivitou (NUC) a oblast s rozpoznávací funkcí (REC) tvořená α-helix (Obr. 1A). Oblast NUC obsahuje tři domény: i) HNH nukleázová doména štěpící cílový řetězec DNA, ii) RuvC nukleázová doména štěpící „nontarget“ řetězec DNA, iii) PAM sekvence tzv. protospacer-adjacent motiv zajišťující specifické navedení Cas9 k cílové DNA sekvenci. Oblast REC obsahuje region rozpoznávající komplex tvořený gRNA/cílová DNA sekvence (Obr. 1B). Komplex gRNA/Cas9 vytváří dvouřetězcové zlomy na DNA. Sekvenčně specifické delece, bodové mutace nebo inzerce mohou být zaváděny do editovaného genomu pomocí homologní rekombinace za přítomnosti vhodného DNA templátu. Systém CRISPR/Cas9 umožňuje efektivně editovat genomy pomocí navržení 20bp regionu, který je součástí gRNA. Tento region, na který cílí Cas9, musí být v blízkosti PAM sekvence (typicky NGG). Ve cvičení budeme pracovat s vektorem určeným pro umlčování genů ve Staphylococcus aureus. Tento vektor má upravenou endonukleázu Cas9, kdy byla odstraněna oblast s nukleázovou aktivitou. Cílem bude upravit vektor tak, aby ho bylo možné použít v buňkách Escherichia coli a abychom cílili na gen ftsZ, který řídí tvorbu septa u této bakterie. Obr. 1. Struktura proteinu Cas9. A. Struktura Cas9 proteinu Streptococcus pyogenes, B. Mechanismus působené CRISPR/Cas9 systému. Vektory pCasSA (vektor pro editaci v buňkách S. aureus), pΔCasSA (vektor s endonukleázou Cas bez katalytické domény pro umlčování genů) Sekvence původního vektoru pCasSA je uvedena zde: https://www.addgene.org/browse/sequence/183220/ (Chen et al., 2017; DOI: 10.1021/jacs.6b13317) Jedná se o vektor se zachovanou katalytickou funkcí proteinu Cas9. V rámci praktické úlohy budeme pracovat s vektorem, který umožňuje cílené umlčování genů. Pro účely teoretické úlohy budeme využívat sekvenci a mapy vektoru pCasSA, pΔCas_bacteria (Obr.2A, 2B) a sekvenci vektoru, který byl upraven pro účely umlčování genů v E. coli pΔCas9_bact_T7p_FtsZ_spacer (Obr. 2C). Obr. 2: Mapa vektorů pCas9SA. A. pCasSA – vektor určený k editaci u Staphylococcus aureus (Chen et al., 2017), B. pdCas9_bacteria – vektor určený k umlčování genů u bakterií (Qi et al, 2013), C. pdCas9_bact_T7p_FtsZspacer – vektor upravený v laboratoři LMDM, cílící na gen ftsZ A. B. C. Operon odpovědný za tvorbu septa u E. coli Reverzibilní indukce vláknitého růstu u E. coli byla nedávno prokázána kontrolou exprese proteinů FtsZ/FtsA účastnících se buněčného dělení. Pokud hladina proteinu FtsZ klesne pod kritickou úroveň, buňky se nemohou efektivně dělit a nedochází k tvorbě septa. Buňky však zůstávají metabolicky aktivní a pokračují v replikaci DNA. Takto upravené buňky lze jednoduše pozorovat pod světelným mikroskopem. Předtím, než se buňka E. coli rozdělí na dvě identické dceřiné buňky, proteiny účastnící se buněčného dělení se hromadí ve středu bakterie s přesností asi 2% a tvoří tzv. „Z prstenec“. Kruhový útvar „Z“ slouží jako lešení na místě budoucího septa pro dalších více než 20 proteinů, které tvoří finální podobu septa. Samotný Z prstenec je sestaven z šesti proteinů, včetně proteinu tvořícího filamentární strukturu (FtsZ) a proteinu zprostředkující jeho vazbu na buněčnou membránu (FtsA a ZipA). Hladina proteinu FtsZ je regulována, protože nedostatečná nebo nadměrná exprese vede k vláknitým bakteriím nebo minibuňkám bez DNA. V úloze budeme cílit námi upraveným vektorem na gen ftsZ. Sekvence vektorů, genu ftsZ Kompletní sekvence plazmidových vektorů je k dispozici ve studijních materiálech ve formátu GenBank a ve formátu *.dna pro prohlížeč SnapGeneViewer. Sekvence genu ftsZ naleznete v genomu E. coli, který je volně přístupný v databázi NCBI pod přístupovým číslem NC_000913.3.