RNAi 1939 - Brachet a Caspersson: buňky produkující proteiny jsou bohaté na RNA 1868 - Friedrich Miescher nuclein Nekódující “malé“ RNA v buňce •7SK snRNA (ovlivňuje transkripci u člověka vazbou na elongační faktory) •SRP RNA (ovlivnění translace, jsou součástí “signal recognition particle”) • součást telomerázy (úloha při replikaci) Nekódující “malé“ RNA v buňce •XIST RNA (inaktivace X chromozómu) •gRNA (úloha při editaci RNA) •microRNA (miRNA) •siRNA Napoli et al., Plant Cell, 1990 Rich Jorgensen a kolegové vložili gen produkující pigment do petunií Místo silné pigmentace se objevily rostliny variegované a dokonce bílé Jorgensen pojmenoval tento fenomén "cosuppression” K potlačení exprese docházelo až po proběhnutí transkripce, fenomén byl nazván PTGS (PostTrancriptional Gene Silencing) Již dříve (Matzke et al. 1989) znám fenomén TGS (Transcriptional Gene Silencing) - dva různé geny se stejným promotorem použity na transformaci tabáku - došlo k metylaci promotorové sekvence - metylace zmizela po segregaci jednotlivých genů použitých k transformaci VIGS (Virus Induced Gene Silencing) Nekodující část virového genomu, kterou byly transformovány rostliny způsobila rezistenci k danému viru Od háďátka k Nobelově ceně Fire a Mello studovali fenotypový efekt injektované sense a antisense RNA a dsRNA (v podstatě kontrola) výsledek: 1. dsRNA suprimuje expresi násobně více než ssRNA • 2. Suprese specifická pro daný gen 3. K supresi musí dsRNA být homologní k mRNA (ne intron) 4. Cílová mRNA byla degradována 5. Jenom několik molekul dsRNA bylo schopno efektivně utlumit expresi 6. dsRNA suprimující efekt se šířil mezi orgány i do další generace Cytoplazmatické siRNA (small interfering): dsRNA představující např. intermediátní stavy replikace virů siRNA mediated supression of transcription - potlačení transkripce prostřednictvím siRNA miRNA: negativní regulace specifických mRNA (genů) Různé typy a projevy krátkých RNA v buňce Jaký je rozdíl mezi miRNA a siRNA? •Funkce obou je regulace exprese •siRNA je původem dsRNA •siRNA často souvisí s cizorodou RNA (obvykle virovou) a je 100% komplementární •miRNA je původně ssRNA, která formuje vlásenkové dsRNA struktury •miRNA (microRNA) reguluje post-transkripční genovou expresi RNA interference (RNAi) •post-transkripční utišování genů (gene silencing) •dsRNA je rozštípána na 21-23 nt segmenty (“small interfering RNAs”, „microRNAs“) enzymem Dicer microRNA (miRNA) •Regulace genové exprese •Mechanizmus podobný jako u siRNA •Zabraňuje vazbě k ribozomům (u živočichů) RNA interference •Na základě homologie siRNA nebo miRNA k mRNA způsobí RISC komplex degradaci RNA interference •siRNAs nebo miRNA je inkorporována do „RNA-induced silencing complex“ (RISC) RISC •2 RNA binding proteins •RNA/DNA Helicase •RNA-Dependent RNA Polymerase (RdRP) Denli AM and Hannon GJ, Trends in Biochemical Sciences, 2003 Použití RNA interference •Studium funkce genů –Knock-out nebo knock-down genů •Terapeutická suprese •Indukce rezistence u rostlin Mechanizmus siRNA RNAi DVA kroky: –Iniciační krok –Generování siRNA molekul –Efektorový krok –Degradace cílové RNA Iniciační krok ATP ATP ADP + ppi ADP + ppi DICER KINASE RdRP Efektorový krok •Vazba na siRNA •siRNA rozvolnění •RISC aktivace Baulcombe D, Nature, 2004 siRNA miRNA processing mirna biogen He and Hannon, Nature Reviews Genetics, 2004 miRNA and RNAi RNAi ambion1 Identifikace miRNA a siRNA •Bioinformatické přístupy •Klonování krátkých RNA Jak vytvořit siRNA pro účely genetického inženýrství •Chemická syntéza • •Vektor exprimující siRNA –Virové a plazmidové vektory Tvorba siRNA •Počáteční užívané dlouhé dsRNA vedly k nespecifickým interakcím (velké změny v expresi proteinů apoptóza) • • •Později zjištěno, že RNAi je zprostředkována 21 a 22 bp dlouhými RNA molekulami Exprese siRNA •Pro přechodnou expresi: do buňky musí být dopravena duplexová RNA •Pro stabilní expresi: do buňky dopraven vektor zodpovědný za vznik vlásenkové (hairpin) RNA •Vektorem může být plasmid, retrovirus, adenovirus Chemická syntéza siRNA • •Sekvence –50-100 bp od start kodonu směrem do genu (downstream) –Kolem 21 nucleotidů: AA(N19)TT • •GC content: 30-70% Vectors expressing siRNAs Sense sequence Anti-sense sequence Hair-pin loop Sense sequence Anti-sense sequence siRNA knock-knock RNAi Metodické výhody a nevýhody RNAi •Umlčení všech kopií daného genu u polyploidů •Jednoduchá aplikovatelnost (C.elegans) •Embrya myší nereagují na exogenní dsRNA •Některé organismy pravděpodobně sekundárně ztratili RNAi mašinérii (Trypanosoma cruzi, Saccharomyces cerevisiae) Matzke MA and Birchler JA, Nature Reviews Genetics, 2005 RNA- directed DNA methylation Greval SIS and Rice JC, Current Opinion in Cell Biology, 2004 RNA interference-mediated heterochromatin assembly “Silencing” nezpárované DNA u rostlin Matzke and Birchler, Nature Reviews Genetics, 2005 “Silencing” nezpárované DNA u hub a živočichů Pole působnosti RNAi RNA jako molekulární přepínač Small modulatory RNA – smRNA (Kuwabara et al., Cell, 2004) Původně objeveny u myší Vyskytují se u všech obratlovců Interagují s regulačními proteiny Přemění transkripční represor v aktivátor Piwi-interacting RNA - piRNA Silencing retrotranspozonů během spermatogeneze Krátké RNA 29-30 bp Vyskytují se v klastrech mimo genové oblasti Rozdíly mezi rostlinnými a živočišnými miRNA Rostliny Živočichové Nachází se: intergenové oblasti intergenové oblasti, introny Shluky miRNA: vzácné běžné Mechanismus působení: mRNA-štěpení represe translace Místo vazby na mRNA: otevřený čtecí rámec 3′-konec CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) Přímé repetice (24bp-48bp) s unikátními spacery fágového původu Analogie RNAi u bakterií Genomy s CRISPR repeticemi obsahují Cas geny (CRISPR-associated genes), které se podílejí na antivirové obraně Tools for genome editing Historie 1972 1990 1993 1995 1969 Britten a Davidson: “RNA může sloužit jako regulátor genové exprese“ Dvouřetězcové RNA izolovány z lidských buněk Kosuprese u rostlin První microRNA (lin-4) izolována u háďátka Sense i antisense RNA konstrukty inhibují expresi u háďátka 1984 Regulace translace „antisense“ mechanizmem u E.coli Historie 1998 1999 2000 2001 2002 dsRNA efekt u háďátka Purifikace RISC komplexu Identifikace Dicer RNAi použito proti HIV Dnes Plošný „screening“ odhaluje, že až polovina genů je regulována miRNA 2004 2006 Fire a Mello získali Nobelovu cenu miRNA fungují jako onkogeny Objev krátkých RNA rostlin Nobelova cena 2018 • • • • •Co reguluje microRNA? j0302953