Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody doc. RNDr. Jakub Neradil, Ph.D. Ústav experimentální biologie PřF MU Fluorescenční mikroskop Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 02 / 5.3. • konstrukce a princip fluorescenčního mikroskopu • objektivy • zdroje světla • filtry Program přednášky: Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 02 / 5.3. Otto Heimstaedt a Heinrich Lehmann (1911-1913) • sestrojili první fluorescenční mikroskop s UV excitací • autofluorescence bakterií, protozoí, rostlinných a živočišných buněk • organické makromolekuly - albumin, elastin, keratin Stanislav von Prowazek (1914) • pozorování ve fluorescenčním mikroskopu vazbu fluoroforů na živé buňky • odhalení původce tyfu – Ricketsia prowazekii Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 02 / 5.3. Fluorescenční mikroskop • je mikroskopem světelným • lze pozorovat i v procházejícím „bílém“ světle Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 02 / 5.3. Základní princip fluorescenční mikroskopie Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 02 / 5.3. Transmisní fluorescenční mikroskop (Transmition light fluorescence microscope) excitační filtr emisní filtr vzorek Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 02 / 5.3. Transmisní fluorescenční mikroskop • výhodnější použití kondenzoru pro temné pole • excitační světlo nemíří do objektivu • oddělené filtry Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 02 / 5.3. • kostra • zdroj bílého světla • kondenzor • stolek • objektivy • tubus • okuláry • ovládací prvky: • makro+mikrošroub • ovládání světla • filtry, clony... ILUMINÁTOR • zdroj světla • kostky • clony, filtry Epifluorescenční mikroskop (Reflected light fluorescence microscope) Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 02 / 5.3. Invertovaný fluorescenční mikroskop • práce s vysokým vzorkem (kultivační nádoby) Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 02 / 5.3. Fluorescenční nástavec (iluminátor) Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 02 / 5.3. Köhlerovo osvětlení pro odražené světlo (1893-4) • uspořádání optické soustavy pro ideální osvětlení • výsledek: světlo vyplní celý otvor objektivu a) maximální osvětlení zvýšení intenzity díky kolektorové čočce, zdroj světla blízko ohniska čočky b) stejnoměrné osvětlení filtry k redukci „hot-spots“ (místa s nadměrnou intenzitou) nebo difuzní fitr Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 02 / 5.3. Osvětlení • osvětlení je tvořeno 3 konjugovanými (stejně zaostřenými) rovinami A) rovinou zdroje světla B) rovinou aperturní clony fluorescenčního iluminátoru C) zadní ohniskovou rovinou objektivu • vypadává přítomnost kondenzoru • osvětlení přichází z objektivu a je jím také odváděno • intenzita a kontrast osvětlení jsou regulovány jen aperturní clonou • nemění se tím velikost osvětleného pole A B C Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 02 / 5.3. Zobrazení • zobrazení je tvořeno 3 konjugovanými rovinami A) rovinou polní clony B) rovinou zobrazovaného objektu C) střední rovinou obrazu • obraz zdroje světla je mimo rovinu zaostření -> stejnoměrné osvětlení • polní clona reguluje změnu velikosti osvětlení pole • nemění se tím intenzita osvětlení • nastavení co nejmenší, ale aby nebyla vidět (x photobleaching) A B C Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 02 / 5.3. Objektivy pro fluorescenční mikroskopii intenzita fluorescence (jas) • počet fotonů na jednotku plochy za čas • u FM snímajících odražené světlo (z preparátu), závisí na numerické apertuře objektivu (NA) a zvětšení (M) • Intenzita  NA4/M2 použití objektivů • plan-fluoritových a plan-apochromatických objektivů • NA =1,3-1,4 pro olejovou imerzi • musí propouštět UV a VIS světlo • sklo musí mít minimální autofluorescenci • antireflexní vrstvy Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 02 / 5.3. Typy objektivů • Achromáty - jednoduché, složené ze 2 až 6 čoček; je u nich korigovaná chromatická vada, červená a modrá je zaostřena stejně • Apochromáty - korekce barevné vady pro tři základní barvy spektra, vyšší numerická apertura a lepší rozlišení detailů • Planachromáty - barevně korigovány jako achromáty a korigováno i vyklenutí zorného pole (mikrofotografie) • Planapochromáty - zcela odstraněno vyklenutí zorného pole i chromatická vada, patří k nejlepším a nejdražším objektivům • Fluoritové objektivy - z fluoritového skla (vynikající optické vlastnosti), dobře propouští UV záření, vhodné pro fluorescenci, ale i pro pozorování ve světlém poli Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 02 / 5.3. Numerická apertura NA = n. sinµ (NA = n. sin a/2) vzduch (n = 1) n - index lomu prostředí voda (n= 1.33) µ - polovina tzv. otvorového úhlu imerzní olej (n = 1.51) Změna indexu lomu prostředí http://olympus.magnet.fsu.edu/primer/java/microscopy/immersion/index.html Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 02 / 5.3. Rozlišovací schopnost • nejmenší vzdálenost dvou bodů, které ještě vnímáme jako oddělené R=/2NA NA = n. sinµ pro 550nm - zelená Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 02 / 5.3. Zdroje světla pro fluorescenční mikroskop Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 02 / 5.3. Zdroje světla pro světelný mikroskop žárovky - el. proud rozžhaví vlákno wolframová žárovka • 300-1400nm • W vlákno ve vakuu nebo inertní atmosféře (Kr, Xe) • na světlo se spotřebuje 5-10% energie (zbytek na teplo) • vysoká teplota vlákna (až 2500°C při 100W) • s časem klesá intenzita světla, černání wolframovo-halogenové žárovky • v ochranné atmosféře přítomnost jódu nebo bromu • vlákno má delší životnost Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 02 / 5.3. Zdroje světla pro fluorescenční mikroskop výbojky • naplněná plynem pod vysokým tlakem (xenon, páry rtuti) • obsahuje elektrody • světlo vzniká ionizací plynu mezi elektrodami • 10x-100x jasnější než žárovky • připojeno počítadlo hodin Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 02 / 5.3. Rtuťová výbojka (HBO) • obsahuje rtuťové páry • neposkytuje souvislé spektrum • emituje v několika úzkých pásmech • UV, fialová, modrá, zelená, žlutá, oranžová • životnost 200-400h Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 02 / 5.3. Xenonová výbojka (XBO) • obsahuje xenon • stejná intenzita ve viditelném spektru • v UV nízká emise • v IR vysoká emise -> přehřívání • životnost 400-1200h Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 02 / 5.3. Zdroje světla pro fluorescenční mikroskop LASER -Light Amplification by the Stimulated Emission of Radiation • emituje paprsek světla o určité vlnové délce (nebo několika délek) • světlo je koherentní – má stejnou frekvenci, směr kmitání, fázi • vlnová délka je specifická v závislosti na typu kostrukce a materiálu Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 02 / 5.3. 1. aktivní prostředí v rezonátoru (různé skupenství - pevné, plyn, kapalina, plazma) 2. zdroj záření (elektrický proud, výbojka, chemické reakce..) 3. odrazné zrcadlo 4. polopropustné zrcadlo 5. laserový paprsek Konstrukce laseru: Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 02 / 5.3. Princip laseru • zdroj energie vybudí elektrony aktivního prostředí ze základní energetické hladiny do vyšší energetické hladiny -> excitace • postupná excitace většiny elektronů aktivního prostředí • při přestupu elektronu na nižší hladinu dojde k emisi fotonů • fotony interagují s dalšími excitovanými elektrony, spouštějí stimulovanou emisi fotonů • emitované fotony mají stejnou frekvenci a fázi • mezi zrcadly (v rezonátoru) dochází k odrazu paprsku fotonů a jeho opětovnému průchodu prostředím -> zesilování toku fotonů • paprsek opouští tělo laseru průchodem skrze polopropustné zrcadlo Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 02 / 5.3. Stimulovaná emise http://olympus.magnet.fsu.edu/primer/java/lasers/heliumneonlaser/index.html Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 02 / 5.3. Nejčastěji používané lasery využití - konfokální mikroskopie Kryptonový laser emituje v UV i VIS (647 nm) Argonový laser emituje v UV i VIS (488 a 514 nm) He-Ne, He-Cd ... Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 02 / 5.3. Další užívané lasery ve fluorescenční mikroskopii Laser vs. fluorochrom Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 02 / 5.3. Filtry ve fluorescenční mikroskopii excitační filtr – propouští takové světlo, které je schopno vyvolat excitaci s následnou emisí u daného fluoroforu emisní (bariérový ) filtr – propouští světlo, které je emitováno fluoroforem Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 02 / 5.3. FM obsahuje 3 typy filtrů v optické dráze uloženy v bloku (kostce) – důležitá orientace • excitační filtr • dichromatické (dichroické) zrcátko (= beamsplitter) • emisní filtr Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 02 / 5.3. Funkce dichromatického zrcátka • u mikroskopů s odrazem fluorescence • odráží excitační záření • propouští emisní žáření • sklon 45° k excitačnímu i emisnímu filtru Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 02 / 5.3. rozdělení filtrů dle šířky propouštěného spektra • short pass – propouští kratší vlnové délky než je určitá hodnota • long pass – propouští delší vlnové délky než je určitá hodnota • wide band pass – omezen z obou stran spektra • narrow band pass – omezen na úzké rozmezí vlnové délky Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 02 / 5.3. Základní typy kostek - Olympus Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 02 / 5.3. Kombinace excitačního a emisního filtru OLYMPUS http://olympus.magnet.fsu.edu/primer/java/fluorescence/optical paths/index.html Kombinace fluoroforu s blokem NIKON http://www.microscopyu.com/tutorials/flash/spectralprofiles/ind ex.html Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 02 / 5.3. Filtry pro vícenásobné značení • double band • triple band Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 02 / 5.3. http://www.microscopyu.com/tutorials/java/fluorescence/excitationbalancer Excitační balancer • při použití vícepásmových kostek • změna intenzity excitačních vlnových délek • dvojice short pass a long pass filtrů Bi8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 02 / 5.3. Filtry a zdroje světla pro fluorescenční mikroskopii http://media.invitrogen.com.edgesuite.net/tutorials/3Light_So urces_Filters/player.html