BÍ8920 Fluorescenční mikroskopie Fluorescenční zobrazení živých buněk doc. RNDr. Jakub Neradil, Ph.D. Ústav experimentální biologie PřF MU Program přednášky: • GFP a fluorescenční proteiny • tracking metody • fluorescence v reálném čase • mikroskopování živých buněk BÍS920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 04 /19.3. Osamu Shimomura Martin Chalfie Roger Y.Tsien The Nobel Prize in Chemistry 2008 "for the discovery and development of the green fluorescent protein, GFP". http://www.youtubexom/watch?v=90wpvSp4l 0 BÍS920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 04 / 19.3. O. Shimomura 60, -70. léta: izolace fluoreskujících proteinů z medúzy Aequorea victoria, kolem klobouku bioluminiscenční orgány r ■ A. BÍS920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 04 / 19.3. Princip luminiscence Aequorea victoria * za přítomnosti Ca+2, bioluminiscence aequorinu {apoaequorin = enzym + luciferin = kofaktor) -> modré světlo -> excitace GFP -> zelené světlo • přenos energie na principu rezonančního transferu (FRET) Struktura GFP: p-barel (ll antiparalelních řetězců), uvnitřa-helix s chromoforem, 23S AMK, 27kDa, aktivní místo: Ser65-Tyr66-Gly67 přestavba a vznik fluoroforu OH CH 2 B. CH 2 ^ CH2 _u , OH CH-C^ NH,-CH-c' Ser 65 Tyr 66 H I /OH NHj-CH-qf Gŕy67 OH OH \ T c. r CHŕ ^ /7 jThe fina I fluoro phore contain t N—C^/3 *erws of conjugated double bonds NH-CH-C^ I / -c' - fj-CH-C O j u toc* t j lytic cychMlton H—CH C=0 L imidazolinový kruh http://zei5s fjhaiW) Figure 5 BÍ8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 04 / 19.3. Ds Red fluorescenční protein a jeho deriváty 1.D 0.5 :: e 1.0 ■ ,_ j '. ľi J *ao *w a» mo ooo esc MO MO UM T1 l dimer2 — tdimer2(12) tdTomato *~ dTomato AY678Z&9 AYÍ782Ů3 Hre !*™ mRFPI ouvj t un mRFPI.1 _ mTangerine AY673270 f ftľlMA nit mHoneydew AY67B271 Hl MU H(,ÍT m Banana AY678267 I1SÍV T1*SV T41F LUF mChtny Ulli. Sií T OC4M mOrange mStrawberry AYS78267 AY67B266 BÍS920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 04 / 19.3. Speciální vlastnosti fluorescenčních proteinů Photoactivation Photoconversion Photoswitchmg Fluorescent timer BÍS920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 04 / 19.3. \ Zavedení fúzního genu do buňky ve formě plazmidu Mikroinjekce - přímý přenos mikrojehlou do cytoplasmy nebo jádra pomocí rnikromanipulátoru, není vhodný pro velké množství b. linií, ideální pro protoplasty, lze si vybírat jednotlivé b. Lipofectaminová transfekce-jednoduchá a nejčastější metoda u živočišných buněk, není toxický, komplex lipidů a DNA fúzuje s plasmatickou membránou, lze i do jádra Precipitace fosforečnanem vápenatým - fosforečnan vápenatý společně s DNA precipituje, poté je fagocytován do buněk, jednoduchá metoda, část DNA i do jádra Elektroporace - elektrický puls vyvolá tvorbu pórů v plasmatické membráně, přechod do buňky Gene Gun - mechanický přenos DNA vázané na kovové míkroprojektily do ^^sr? •C"1 — — - --■ buněk pomocí tlaku plynů nebo mikroexploze (např. u rostlinných buněk) £ BÍS920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 04 / 19.3. Zavedení fúzního genu do buňky glass mierooipette containing siesta nee X cell placed in substance X between two electrodes and subjected to d very short electric shoct membrane-bounded vesicles containing substance X gold particles coated with DNA Q & "O 0 a O o o * target celí I microinjection °f 3Lfo»t*nců In^o cell I transient pores made in the membrane eliew substance To c-nicr :hc coll before reselling induced membrane Fusion between vesicles and olasma membrane ol target cell release substance into the cytoplasm + DNA-coated yold port c\cn shot into cell at high velocity allows stable transfer maliur, Or transient expression of new cjeres .A IB) IC) IDJ BÍS920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 04 / 19.3. Lipofectaminová transfekce Lipid-Mediated Transfection in Mammalian Cells Plasmid Vector DNA Lipofection Cell Reagent Figure 8 BÍS920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 04 / 19.3. Elektroporace Cíle: • b. kultura • tkáně • orgány • embryo • embryo in utero The phenomenon of electro po rati on Cel membrane before putting Cell membrane during putting Cell membrane after pulsing ŕcrll nrturm to • Controlled, milUiecond electrical putt** indue* temporary pore* in the cell membrane • Cell membrane reseat* and I* left unharmed BÍ8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 04 / 19.3. GFP exprese v rybím embryu zebřička (Danio rerio) BÍ8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 04 /19.3. GFP transfekce „in utero" např. hlodavci - mozek Uterus exposure DNA injection EiectfOporation (0 ) hippocampus and motor cortex Electroporation (90 ) visual cortex OR BÍS920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 04 / 19.3 ^NA * Fluorescenční indikátory změna fluorescence (spektra nebo intenzity) v závislosti na určité látce - prvek, pH, ROS... Iontové indikátory: kationty: H+, Ca2+, Li\ K+, Mg2+, Zn2+, Pb2+, ... anionty: C\, P042, citrát, ATP... měření: změna intenzity v závislosti na koncentraci nebo posun emisního spektra BÍS920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 04 / 19.3. Indikátory Ca2+ FURA-2 excitace při dvou vl. délkách měření poměru 340/380nm při konstantní emisní vlnové délce 510nm CalciumGreen-5N měření intenzity fluorescence při konstantní excitační vlnové délce 488nm A Em - S10 nm 39.8 pfllree Cíľ" E= 2 1.35. jf\ 0.60. yyC^ä I 0.35 v ^tí/Coi 1 o^s^/v/y^ojl S c o io/\Jm/V^ o ^^l|ézí2^0.03B ^^^^ 250 300 350 400 450 Wavelength (nm) 'jOO HO 600 550 Wavelength (nm) BÍS920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 04 / 19.3. kombinace indikátorů Ca2+ • dva indikátory s neměnící se vl. délkou emise • jeden snižuje fluorescenci (Fura Red) • druhý zvyšuje fluorescenci (Fluo-3) v závislosti na Ca2+ • měření poměru fluorescence v jednotlivých emisních maximech Calcium Ratiometric Titration with Fluo-3 and Fura Red Organelové sondy - próby označení specifické membránové organely: • mitochondrie • Golgiho aparát • endoplasmatické retikulum • lysosomy složení: fluorochrom + vazebná doména (zajišťuje specificitu vazby) • schopnost průniku přes pl. membránu bez poškození • navázání na cílovou organelu studium: transport, buněčná respirace, mitóza, apoptóza, degradace proteinů, sekreční dráhy rozdělení: na stálé a nestálé BÍS920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 04 / 19.3. Mitochondrie * studium buněčné respirace dříve Rhodamin 123 (po fixáži slábne) * nyní MítoTracker, Mito Fluor (lze fixovat) * JC-1 indikátor membránového potenciálu - v aktivních mitochondriích mění emisi ze zelené na červenou BÍS920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 04 / 19.3. Neonatálnľ kardiomyocyty : rhodaminl23, (A) kontrola, (B) ovlivněno mitochondrial ním uncouplerem mitothondrie - bovinní endotel : MitoTracker* Deep Red FM dye rnitochondrie/DNA - býci spermie: MitoTracker(E) Green FM Hoechst 33342 mitochondrie - fibroblasty norka : JC-1 / JC-1 vysoký membránový potenciál - červená nízký membránový potenciál - zelená BÍS920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 04 / 19.3. Golgiho aparát • CelILight™ Golgi-GFP , enzym specifický pro GA, fúzovaný s GFP ve vektoru • konjugované lektiny - vazba na glykosylované proteiny GA Endoplasmatické retikulum • prostupují pres membránu, selektivní pro ER, dříve DiOC6,- není tak specifický, vykazuje fotodynamickou toxicitu * nyní ER-Tracker + Blue-White, Red , Green - menší toxicita, lze i fixovat Lysozómy * LysoTracker, LysoSensor obsahují ve struktuře heterocyklické dusíkaté skupiny, které napomáhají transportu do lysozomů živých buněk, vysoká senzitivita pro organelys nízkým pH, možnost fixace (LysoTracker) • pouze živé b, (LysoSensor) - vzrůstá intenzita fluorescence v nízkém pH funkce jako pH indikátor BÍS920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 04 / 19.3. SH^/ BacMam Reagents • připravené virové konstrukty • baculovirus - hmyzí, aktivně neinfikují savčí buňky, nereplikují se konstrukt: 1) savčí promotor: zaručuje expresi v savčích buňkách 2) funkční část: protein nebo peptid cílený na strukturu (cytoskelet, organely aj.) nebo funkci (buněčný cyklus, autofagie, tok Ca2+) 3) fluorescenční protein: CFP, GFP, RFP; na C- nebo N-konci peptidu * jednoduchá aplikace * lze sledovat v reálném čase • lze koexprimovat více prób • lze fixovat Promoter O O o BÍ8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 04 /19.3. Sledovaní fází buněčného cyklu S/Gř SCF Skp2 late M / Gi APC Cdh1 SIG2 Cdťl (accumulation in G1) FUCCI- fluorescence ubiquitination cell cycle indicator Geminin-GFP -> S/G2/M Cdtl-RFP -> Gl regulace ubiquitin-ligázami, exprimovanými v určitých fázích cyklu lze spojit s BacMam systémem transfekce (LifeTechnologies) aleM/Gi Geminin (accumulatioo in S/G2/M) Sakaue-Sawano et al . Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 2008 Feb 8;132(3):487-58 BÍ8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 04 / 19.3. IN) 6 IVU Č my Testovaní viability/cytotoxicity měření podílu živých a mrtvých buněk na základě rozdílných vlastností 1. fluorogenní substráty esteráz • pronikají do buněk, zde metabolizovány - vznik aktivního fluoroforu • ověření soudržnosti membrány-fluorofor zadržován v cytoplasmě fluoresceindiacetát (FDA), calcein AM (CAM) 2. sondy pro nukleové kyseliny * neprostupují přes membránu živých buněk * EtBr, Pl, ethidium homodimer, SYTOX Green... lze společně kombinovat BÍS920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 04 / 19.3. linie krysích buněk: živé: substrát esterázy calcein AM—> zelené mrtvé: ethidium homodimer-1—> červené Annexin V + PI: detekce buněčné smrti Live CelJ Apoptotic Cell Late-apoptotic Cell Annexin V-FITC (FL1) BÍS920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 04 / 19.3. TUNEL: Detekce štěpení DNA v apoptóze TUNEL: Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling FRAP - Fluorescence Recovery after Photobleaching • studium mobility a molekulární dynamiky proteinů v živých b • narušení rovnoměrné fluorescence preparátu vysvícením (photobleaching) daného regionu • použití excitačního laseru o vyšší intenzitě -trvalé poškození fluoroforu • v místě postupné zvyšování intenzity fluorescence - přesun fluorescenčních a odbarvených molekul • různé metody v závislosti na velikosti odbarveného regionu, počtu odbarvovacích procesů a způsobu analýzy fluorescence _ . BÍS920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 04 / 19.3. Princip FRAP [A| FRAP BLEACH WtTH LASER BEAM b)nachet* area I-1 9 íí # f» c o c c o 9 RECOVERY 1—i f Photobleaching Kinetic Analysis 1(b) _!_ •Ume (t)— Figure BÍS920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 04 / 19.3. re 5 i 70 60 50 - 40 30 20 10 - (v- ROI3 BÍ8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 04 / 19.3. m FRET: Förster (Fluorescence) Resonance Energy Transfer • studium interakce fluorescenčně značených molekul ■ měření nanometrových vzdáleností a jejich změn mezi molekulami (1-lOnm) ■ 2 fluorofory: donorový + akceptorový ■ podmínky: a) překryv emisní spektra donoru s excitačním spektrem akceptoru, b) vzdálenost do lOnm, c) orientace 3 Spéct ral overlap *-NurWET Donor Acceptor emission excitaiion FRET Donor AoceplOr emission excitaiion Correct orientalion No FRET 405 nm No FRET 405 nm TRCT 405 nm I 1_ 405 n m FRET >10 nm <10 nm < O i "D c V BÍS920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 04 / 19.3. Princip přenosu energie mezi fluorofory s, i o I o 3 '0 Relaxation (ps) t/3 O tu U OJ FRET (ns) Donor Acceptor BÍS920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 04 / 19.3. Examples for common FRET Donor/Acceptor pairs: Donor (Em.) Acceptor (Exc.) FITC (520 nm) TRITC (550 nm) Cy3 (566 nm) Cy5 (649 nm) EGFP(508 nm) Cy3 (554 nm) CFP (477 nm) YFP (514 nm) EGFP (508 nm) YFP (514 nm) BÍS920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 04 / 19.3. Princip FRET interakce receptor-ligand Protein Acceptor-labeled protein Sensitized emission Donor Donor emission emission Fig. I. TRENDS in Ceil Biology BÍS920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 04 / 19.3. Další aplikace FRET Biomolecular Fluorescence Resonance Energy Transfer Applications Conformational Changes □ Donor Acceptor Ligand-Receptor Interactions Figure 11 Protein Hydrolysis Fusion of Lipid Vesicles BÍS920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 04 / 19.3. IMI aplikace FRET biosenzory- měření koncentrace vápníku http://www, microscopyu.com/tutorials/flash/spectralimaging/fretbiosensors/index.html Spectral Imaging with Fluorescent Protein FRET Biosensors FRET Dynamic Range 530 nm 47$ nm Cameleon YC3.60 NO FRET 44Q nm ECFP W r* EYFP 4 SO 500 £50 Wave length (nm) 603 (c) Ca Ml 1 J Mli 460 470 460 490 500 510 * (d> Lv 520 4r ^P 540 550 560 570 BÍS920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 04 / 19.3. Podmínky pro mikroskopii živých buněk Variable Optimum Range Comment! Conltol wild Specimen Chamber Heateis Temperature 28-37*0 Use Inline Perfusion Heateis Objective Lens Healers Environmental Control Boxes Oxygenation Variable Perfuse oi Change Meiliii Regularly Use Large Chamber Volume Closed (Sealedf Chamber Humidity 97-100 Percent H u m i d ifi e d E nvi i o n m e ilia 1 Ch amber AutoFill System for Open Cluiiiheis Use HEPES Buffered Media pH 7,0-7.7 Perfuse oi Change Media Regularly No Phenol Red Indicator Avoid Evaporation Osmolality ■vi, ri Closed jSealedf Chamber Humidified Enviionmeutal Chamber Atmosphere Ail or 5-7 Percent Carbon Dioxide Use HEPES Buffeted Media foi All Closed (Sealed) Chamber Atmosphere Controlled Chamber Media Buffet Bicarbonate or Synthetic Biological Buffeis Rewire of Phototoxicity Closed and Open Chambeis Atmosphere Controlled Chamber BÍS920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 04 / 19.3. Mikroskopie živých buněk Microscope Configuration for Live-Cell Imaging Mikroskopie živých buněk Microscope Slide Imaging and Culture Chambers Inkubační (perfúzní) komůrka Advanced Live-Cell Imaging Chambers Heater Contacts Chamber Top Housing Condenser Aperture Cover Glass Chamber Access Port Perfusion Exhaust Port I Culture Dish Viewing Weight Aperture Specimen Chamber Translation Rod Water Reservior Tokai Hit INU Stage Top Incubator Carbon Dioxide Gas Input Controller Interface Heating Stage Adapter Plate Figure 11 Bioptectis FCS-2 Live Cell Imaging Chamber Chamber Top Upper Gasket Flow Control Slide Lower Gasket —- Coverslip Stage Adapter Base BÍ8920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 04 /19.3. Live imaging http://www.youtube.conn/watchPf eature=endscreen&NR=l&v=Nrw uOYhGxSo BÍS920 Pokročilé mikroskopické metody - jaro 2020 - 04 / 19.3.