Rastrovací elektronová mikroskopie (SEM) a její aplikace v biologii •Vladislav Krzyžánek 1 Úvodní slovo •Tato přednáška, která byla plánována na 23. 4. 2020, se kvůli pandemii neuskuteční. Samotná prezentace bude snad dostatečně srozumitelná i bez mluveného slova. • •K prezentaci přikládám doplňující poznámky, kde můžete najít i další zajímavé odkazy či podrobnější vysvětlení dané problematiky. • 2 Obsah 1.Princip SEM 2. 2.Příprava biologických vzorků pro SEM 3. 3. Vybrané aplikace SEM 4. 4.Speciální techniky SEM 5. 5. 3 Typy elektronových mikroskopů Prozařovací elektronový mikroskop (TEM) Rastrovací elektronový mikroskop (SEM) TEM_instrument.tif E:\!UrgentVK\- Student_BiophysicalMethods\ULTRA_60_500xXu.jpg Types_of_el_microscopes_2.tif 4 Základní rozdělení typů elektronových mikroskopů: TEM a SEM Typy elektronových mikroskopů Prozařovací elektronový mikroskop (TEM) Rastrovací elektronový mikroskop (SEM) Types_of_el_microscopes_2.tif Elektronový svazek Elektronový svazek vzorek 60-100nm Projekce Povrch 5 Princip tvorby obrazu v TEM (průchod elektrony skrz velmi tenký vzorek) a SEM (rastrování po povrchu vzorku) Stručná historie elektronové mikroskopie •1897: John Joseph Thomson – našel elektron •1924: Louis de Broglie zavedl vlnovou teorii elektronů (jakákoliv pohybující se částice má vlnové vlastnosti) •1926: Hans Busch ukázal, že magnetické čočky mohou měnit směr elektronů (jako optické čočky světlo) •1931: Max Knoll a Ernst Ruska vyvinuli první elektronový mikroskop (TEM) •1934: L. Marton publikoval první obrázek biologického vzorku pomocí TEM: sundew plant tissue •1937: Manfred von Ardenne navrhl rastrovací elektronový mikroskop (SEM) •1939: (Siemens) první komerční TEM •1964: (Cambridge Instruments) první komerční SEM •1986: Ernst Ruska získal Nobelovu cenu (spolu s G. Binningem and H. Rohrerem za rastrovací tunelovací mikroskop) •1990: Harald Rose popsal hexapolní korektor sférické aberace •2003: Aberačně korigovaný HRTEM se sub-Ångstrømovým rozlišením •… 1924_Louis_de_Broglie 1926_Busch 1932_Ruska_Knoll 6 Hlavní milníky v elektronové mikroskopii: •Nejvýznamnějšími jsou nalezení elektronu (1897), zavedení dualismu – pohybující se částice lze pospat vlněním (1924) a popis jak měnit směr elektronů (1926) •Následuje první TEM (1931) a SEM (1937); a další vývoj v EM, který zde nemůže být úplný TEM vs. světelný mikroskop prozařovací elektronový mikroskop (TEM) světelný mikroskop 2010ws_ak_emi_2 zdroj systém čoček „kondenzor“ projektor objektiv vzorek výsledný obraz fosforenční stínítko elektromagnetické čočky elektromagnetické čočky elektromagnetické čočky elektronové dělo CCD kamera TEM síťka žárovka skleněné čočky sklíčko skleněné čočky skleněné čočky oko CCD kamera 7 Analogie prozařovacího elektronového mikroskopu (TEM) se světelným mikroskopem. Zatímco u světelného mikroskopu se používá pro zobrazování viditelné světlo, které je formováno pomocí skleněných čoček, u elektronového mikroskopu se pozoruje pomocí elektronů, které jsou formovány elektromagnetickými čočkami. SEM vs. konfokální rastr. laserový mikroskop rastrovací elektronový mikroskop (SEM) konfok. rastr. laser. mikroskop 2010ws_ak_emi zdroj detektor systém čoček „kondenzor“ rastrovací systém objektiv vzorek detektory elektronů, světla elektromagnetické čočky elektromagnetické čočky elektromagnetické čočky elektronové dělo fotonásobič laser skleněné čočky zrcadlo skleněné čočky fotonásobič 8 Analogie k rastrovacímu elektronovému mikroskopu (SEM) se nabízí konfokální rastrovací laserový mikroskop. Zde se výsledný obraz nezvětšuje přímo, ale rastruje se sfokusovaným svazkem elektronů bod po bodu a řádek po řádku a „jemnost“ rastrování určuje rozlišení. Jak pracuje SEM 9 •Část videa z cyklu NEZkreslená věda, na němž se podíleli kolegové z ÚPT. Plná verze zde: https://youtu.be/2vYquoVWLqQ •Nyní prosím „trpaslíky“ zaměňte za elektrony! Video s jednoduchým vysvětlením principu SEM. Přesto, že je určeno především pro žáky a studenty středních škol, je jeho poutavá forma zajímavá (obsahuje zvukovou stopu!). Plná verze videa s úvodem do nanosvěta je k dispozici zde https://youtu.be/2vYquoVWLqQ Jak elektrony interagují s látkou? ATOM jádro electron orbits Pružný rozptyl Eel = E0 Nepružný rozptyl Ein = E0 - DE DE>0 (např. SE elektron, X-ray, atd.) E0 E0 áQelñ >> áQinñ •Nerozptýlené elektrony, tj. žádná kolize (není znázorněno na obrázku) •Pružný rozptyl na jádrech atomu látky •primární elektron mění jen směr pohybu o úhel Θel •často zpětně odražené elektrony •Nepružný rozptyl •primární elektron mění mírně směr pohybu o úhel Θin a ztrácí část energie ΔE •emise záření, sekundárního elektronu, … 10 Interakce elektronů s látkou je velmi důležitá pro pochopení tvorby obrazu v SEM. Zatímco u světelných mikroskopů se využívá odrazu nebo ohybu světla průchodem prostředí s různým indexem lomu, v případě elektronů se interakce popisuje tzv. rozptylem elektronu. Urychlený elektron (tzn. elektron, kterému byla udělena nějaká rychlost a tudíž má určitou kinetickou energii) může velmi tenkým vzorkem proletět bez jakékoliv kolize (nerozptýlený elektron) nebo může dojít k nějaké kolizi na atomu elektronu studované látky: •Pružný rozptyl znamená, že dráha negativně nabitého elektronu je vychýlená kladně nabitým jádrem atomu; u tohoto rozptylu je elektron přitahován k jádru a obvykle zde dochází k větší změně dráhy elektronu a elektron si zachovává energii (není zde žádný důvod ke změně energie elektronu). •Nepružný rozptyl se obvykle odehrává v elektronové obálce atomu; tento typ rozptylu je poměrně komplikovaný a mimo jiné jej lze popsat srážkou elektronu s elektronem látky, která může vést buď k vymrštění elektronu látky (říká se mu sekundární elektron) nebo k přechodu elektronu atomu látky na jinou hladinu, čímž může dojít k vyzáření fotonu (pokud je ve viditelném spektru říkáme tomu katodoluminiscence, často je foton i v rentgenovém spektru). Nepružný rozptyl je charakteristický poměrně malou změnou směru dráhy elektronu, ale oproti pružnému rozptylu zde elektron ztrácí část energie. Obvykle dochází k násobnému rozptylu! emise SE/fotonu ztráta energie emise SE/fotonu ztráta energie emise SE/fotonu ztráta energie emise SE/fotonu ztráta energie emise SE/fotonu ztráta energie emise SE/fotonu ztráta energie nepružný rozptyl pružný rozptyl vzorek •Příklad dráhy elektronu vstupujícího do vzorku •V závislosti na materiálu vzorku a energii elektronu dochází k rozptylu •Primární elektron se může „odrazit“ zpět nad vzorek (zpětně odražený) •Sekundární elektrony (SE) mají velmi malou energii a tudíž jen ty u povrchu se dostanou ze vzorku ven •Vlivem ztráty energie během nepružných rozptylů primární elektron může být ve vzorku absorbován (tzv. elektronový dolet) Existují teoretické modely popisující jednotlivé individuální rozptyly, ale zejména v SEM bývá elektron rozptýlen vícekrát a elektronový rozptyl již nelze jednoduše popsat – existuje několik empirických vztahů nebo se častěji provádějí počítačové simulace (Monte Carlo). Obrázek vlevo znázorňuje příklad dráhy elektronu, který vstupuje do vzorku (takovému elektronu říkáme primární elektron) a vlivem násobné interakce se rozptyluje. Přitom mění dráhu a v případě nepružného rozptylu emituje sekundární elektrony nebo fotony a přitom ztrácí svoji energii. Vlivem ztráty energie může primární elektron „zaniknout“. Obrázek vpravo znázorňuje tzv. interakční objem, tj. kam až se elektrony dostanou – toto závisí na rychlosti elektronů (tj. jejich energii) a materiálu. Jak interakce elektronů s látkou vytvářejí obraz? E:\!UrgentVK\Meetings\20130405_PASSEB_TematMetodWorkshop\figure_1x.tif vzorek 12 Vlivem interakce dopadajících (primárních) elektronů vzniká několik typů signálů, které jsou detekovány různými detektory v SEM: •Zpětně odražené elektrony (BSE) – primární elektrony, jejich dráha se vlivem rozptylu otočí a letí zpět ze vzorku. •Sekundární elektrony (SE) – elektrony vznikající srážkou primárního elektronu s elektrony ve valenčním nebo vodivém pásu; jejich energie je velmi malá, typicky < 50 eV (proto se ze vzorku dostanou jen ty SE, které vznikly u povrchu vzorku). •Katodoluminiscence (CL) – vzniká přechodem elektronu z valenčního pásu přes zakázaný do vodivého. Po tomto přechodu vyvolaném srážkou vznikne ve valenčním pásu díra. Následnou rekombinací elektronu dojde k vyzáření jeho přebytečné energie ve formě fotonu. •Rentgenovo záření (X-ray) – viz další slajdy. •Další méně běžné signály: teplota vzorku (vlivem nepružného rozptylu se vzorek lokálně zahřívá); elektrický proud na vzorku; … Využití různých signálů •Imunoznačení povrchových proteinů (kaučukové nanočástice izolované z Taraxacu) E:\!UrgentVK\Meetings\20121214_UPT_\rubber\Tb_antiSRPP_02_SB_UK_SE.jpg E:\!UrgentVK\Meetings\20121214_UPT_\rubber\Tb_antiSRPP_02_SB_UK_BSE.jpg SE BSE PLoS ONE 7 (2012) e41874, DOI SE= sekundární e., informace o povrchu vzorku BSE= zpětně odražené e., díky cílenému imunoznačení (nanočástice zlata vázané na imunoglobulin) možnost identifikace specifických částí vzorků-> Au poskytuje jiný signál než C 13 Příklad využití dvou základních signálů v SEM: sekundární elektrony (SE) vznikají na povrchu vzorku a tudíž poskytují informaci o topografii vzorku, zpětně odražené elektrony (BSE) závisí víc na materiálovém složení (dávají materiálový kontrast) a tudíž zřetelněji ukazují například zlaté nanočástice (bílé tečky). Na snímcích jsou kaučukové nanočástice izolované z pampelišek produkujících přírodní pryž, kde se studoval výskyt povrchových proteinů pomocí imunoznačení zlatými nanočásticemi (jejich průměr je 10 nm). 14 EDX: Energiově disperzní rentgenová spektroskopie Charakteristické rentgenové záření Vodivostní pás Valenční pás Vakuum EL3 EL2 EL1 EK L3 L2 L1 E0 E = E0 -∆E E = ∆E-Ex Ex = EK-EL3 Hodnoty pro jednotlivé prvky jsou známé Energie je charakteristická pro daný prvek Při ozáření atomu elektronovým svazkem dochází k vyražení elektronů ze svých orbitalů a vzniklé vakance se zaplňují elektrony z vyšších hladin. Rozdíl energií mezi jednotlivými hladinami je vyzářen ve formě fotonu o této energii. Energie fotonu tedy nese informaci o rozdílu energií orbitalů ze kterých vznikl – tato energie je neměnná a charakteristická pro jednotlivé prvky a s její pomocí je možné je identifikovat. Podle dvojice hladin, které se podílí na vyzáření fotonu; rozlišujeme jednotlivé energetické čáry (Kα; Kβ; Lα; Lβ). 15 EDX: Energiově disperzní rentgenová spektroskopie Si Fe C Spektrum zaznamenané z oblasti nebo bodu = všechny prvky v jednom místě Barevná reprezentace vybraných prvků ve vzorku = jeden prvek na všech místech Více v aplikacích EDX – energiově disperzní rentgenová spektroskopie umožňuje paralelní snímání spektra z vybrané oblasti/bodu – výsledkem je spektrum (množství zaznamenaných fotonů vůči jejich energii) a tabulka se zastoupením jednotlivých prvků ve vzorku nebo plošnou distribuci vybraných prvků ve vzorku – výsledkem je barevná mapa ukazující plošnou distribuci vybraných prvků. •Povrch vzorku •Sekundární elektrony •Složení vzorku •Zpětně odražené elektrony •Augerovy elektrony •Katodoluminiscence •Charakteristické rentgenové záření Informace poskytující jednotlivé druhy signálu 16 Monte Carlo simulace C:\!UrgentVK\Meetings\20151005_prednaska_u_Marove_FCH_VUT\MOCASIM_RR_EncyklopediaOfMicroscopyB.tif Interakční objem Atomové číslo 17 Monte Carlo simulace elektronového rozptylu ve dvou látkách: v amorfním uhlíku a zlatě. Simulace jsou prováděny pro dvě energie primárních elektronů: 5 keV (typicky používané v SEM) a 30 keV (největší energie elektronů v SEM). Všimněte si různých měřítek u simulací. Zjednodušeně lze říct, že •s rostoucím atomovým číslem vzorku se zmenšuje interakční objem •s rostoucí energií primárních elektronů se zvětšuje interakční objem Penetrační hloubka •Rozsivky (jednobuněčné fotosyntetizující organismy s dvojdílnou křemičitou schránkou, hnědé řasy) Měřítko: 1 µm 5 kV 20 kV 18 Tento efekt je vidět zde: elektrony s vyšší energií penetrují do větší hloubky vzorku a tím mohou informace na povrchu „rozmazávat“. Hloubka ostrosti v SEM RR_Science_of_Microscopy_deep_of_focus.png Depth_of_focus_Example Zvětšení Hloubka ostrosti Světelný mikroskop SEM 10 60 µm 1000 µm 100 8 µm 100 µm 1,000 0.2 µm 10 µm 10,000 --- 1 µm Světelný mikroskop SEM Mřížovci 25µm 19 Oproti běžným optickým mikroskopům může SEM poskytovat mnohem větší hloubku ostrosti díky menší objektivové apertuře. Na snímku je příklad mřížovce a orientační hodnoty hloubky ostrosti. Obsah 1.Princip SEM 2. 2.Příprava biologických vzorků pro SEM 3. 3. Vybrané aplikace SEM 4. 4.Speciální techniky SEM 5. 5. 20 Biologické vzorky Čerstvý vzorek Vzorek vysušený na vzduchu houby_zavarene houby_mrazene „Chemická“ příprava „Kryo“ příprava 21 Biologické vzorky zpravidla obsahují velké množství vody, což není kompatibilní s jejich pozorováním v SEM, kde je vysoké vakuum. Vzorky se při pokojové teplotě pozorují vysušené. Je jasné, že většina biologických vzorků po vysušení změní tvar. Proto se v biologické elektronové mikroskopii vzorky připravují v podstatě dvěma způsoby: chemicky nebo fyzikálně (kryogenní techniky). Biologické vzorky Dva hlavní problémy biologických vzorků pro jejich pozorování v SEM: •jsou nevodivé (nedostatečně odvádí náboj) •Řešení: pokovení vzorku, použití nižší energie primárních elektronů, vyššího tlaku v komoře vzorku • •obsahují vodu (vložením vzorku do vakua dochází k intenzivnímu odpařování těkavých složek) •malý obsah těkavých složek (změny vzorku nemusí být pozorovány) •velký obsah těkavých složek (změny objemu, reliéfu povrchu, zborcení původní povrchové struktury) •Řešení: speciální příprava vzorku, zmrazení vzorku, 100% vlhkost v komoře mikroskopu 22 Příprava biologických vzorků pro SEM 23 Typické schéma přípravy vzorku. V případě chemické přípravy protokoly obvykle začínají fixací vzorku, následuje dehydratace (tj. odvodnění vzorku postupnou etanolovou nebo acetonovou řadou) a sušení vzorku (aby mohl být vložen do vakua SEM). V minulosti se vzorky pro SEM obvykle pokovovaly, nanášela se povrch preparátu několika nanometrová vrstva kovu – obvykle zlata, ale také se používá platina, chrom, wolfram a další; cílem bylo dosažení vyšší vodivosti vzorku, aby nedocházelo k hromadění náboje z primárních elektronů a získání lepšího kontrastu. V současných SEM to již není nutné, protože je možné pozorovat vzorky nepokovené pomocí elektronů s nižší energií a menší dávkou. Z chemické přípravy je užitečné zaměřit se více na fixaci a sušení. Chemická fixace •Aldehydy: Glutaraldehyd (1-4%) • • •obsahuje dvě aldehydické skupiny, díky kterým je schopen se zároveň vázat ke dvěma funkčním skupinám a tak vytvářet můstky, např. mezi dvěma bílkovinnými molekulami •reaguje převážně s peptidy a bílkovinami • • •Oxid osmičelý (1%) • • •reaguje s a-aminokyselinami, s dvojnými vazbami olefinových uhlovodíků a mastných kyselin •fixuje lipidy, membrány •zpravidla se používá jako sekundární fixační činidlo • • 24 Zatímco ve světelné mikroskopii se pro chemickou fixaci zpravidla používají fixační činidla typu paraformadehyd nebo jen etanol pro jejich velkou rychlost v penetraci do vzorku, obvykle nebývají vhodné pro elektronovou mikroskopii, protože nefixují dostatečně pro vysoké rozlišení. Pro EM se obvykle používá jako fixační činidlo glutaraldehyd (fixuje převážně peptidy a bílkoviny). V případě zájmu o lipidy a membrány se často volí post-fixace oxidem osmičelým. Příprava biologických vzorků pro SEM 25 Následuje dehydratace a velmi šetrné sušení vzorku tak, aby nedošlo k jeho deformaci. Jen malá část vzorků může být vysušena jednoduše na vzduchu. Existuje několik technik sušení: •Metoda kritického bodu (další slajd). •Jako alternativu se někdy používá sušení v kapalinách s co nejmenším povrchovým napětím typu Hexamethyldisilazane (HMDS), který je mísitelný s acetonem. Příprava biologických vzorků pro SEM Sušení vzorku metodou kritického bodu •V KB mizí fázové rozhraní =>struktura vzorku není při sušení poškozena povrchovým napětím kapaliny •Nutnost dehydratace etanolovou nebo acetonovou řadou •Nahrazení organického rozpouštědla kapalným CO2 •Postupné zvyšování teploty v komoře až do kritického bodu=>Nulové povrchové napětí •Převedení CO2 na plyn=> vysušený vzorek • Tkritická pkritický voda 374°C 218 bar oxid uhličitý 31.5°C 73 bar E:\!UrgentVK\Meetings\20131206_PASSEB_Exkurze\fazovy_diagram_CPD.tif 26 Metoda sušení pomocí kritického bodu je jedna z nejpoužívanějších technik z chemické přípravy preparátů a často vede k dobrým výsledkům. Kritický bod kapaliny je oblast, kde vlastnosti kapaliny a plynu splývají. Jelikož kritický bod vody má extrémní parametry, využívá se tekutý oxid uhličitý, jehož kritický bod je snadněji dosažitelný a zpravidla potřebná teplota a tlak nepoškodí vzorek. Kapalný CO2 není mísitelný s vodou, ale je mísitelný s dehydratačními činidly - etanolem a acetonem, což je také důvodem dehydratace vzorku. Srovnání chemické přípravy na „biofilmech“ 2a 2012_01_16_vz3_9 3_x005 sušení na vzduchu sušení pomocí kritického bodu sušení v HMDS (hexamethyldisilazane), kapalině s nízkým povrchovým napětím 27 Příklad sušení vzorků biofilmu bakterie (horní řádek) a kvasinky (dolní řádek): zatímco sušení na vzduchu značně poškozuje celý vzorek, sušení kritickým bodem odplavuje část biofilmu a sušení pomocí HMDS se jeví v tomto případě šetrnější díky menšímu počtu promývání. Příprava biologických vzorků pro SEM 28 Druhým směrem přípravy vzorků je fyzikální nebo často zvaná kryogenní či mrazová příprava. Zde je fixace vzorku provedena velmi rychlým zamražením a po něm může následovat několik různých kroků: •Pokud vzorek chceme pozorovat ve vysušené formě, celý vzorek vysušíme sublimací (mrazové sušení, angl. freeze-drying). Tato technika se využívá výjimečně a jen pro velmi malé vzorky především z časových důvodů, rychlost sublimace je velmi pomalá – je nutné nastavit tlak a teplotu tak, aby nedocházelo k rekrystalizaci ledu uvnitř vzorku. •V SEM vybaveném cryo-stolkem (tzv. cryo-SEM) se obvykle pozoruje zlomený vzorek (bude znázorněno na dalších slajdech). Obdobně jako u chemické přípravy se vzorek před pozorováním může pokovit. •Pro TEM a některé speciální techniky SEM se zamražené vzorky připravují tzv. mrazovou substitucí, kde se zamražená voda (led) nahrazuje pryskyřicí, která se následně vytvrdí. Takto připravený vzorek zalitý do bločku z pryskyřice se již zpracovává při pokojové teplotě – mohou se krájet ultratenké řezy pro TEM nebo se pozorovat jinými metodami v SEM. Kryogenní příprava biologických vzorků Mrazové metody (cryo) •Problém krystalizace ledu ! … krystalický led má nižší hustotu, větší objem než kapalná voda • • • • •Vitrifikace (z lat. vitreum) transformace látky ve sklo … vitrifikovaný led: §má zhruba stejnou hustotu jako voda §bez segregace rozpouštědla a rozpuštěných látek E:\!UrgentVK\Meetings\20131206_PASSEB_Exkurze\fazovy_diagram_CPD.tif E:\!UrgentVK\Meetings\20131206_PASSEB_Exkurze\fazovy_diagram_FD.tif 29 U zamrazení vzorku je důležité, aby voda (kapalina) během mražení nekrystalizovala. „Běžný“ krystalický led má nižší hustotu a tudíž během zamrazování se vzorek může poškodit vlivem zvětšování objemu vody, která mrzne do krystalického ledu. Proto se používají takové techniky mražení, kde v ideálním případě led nestihne zkrystalizovat – dochází k vitrifikaci – kapalná voda přejde v tzv. skleněnou vodu (amorfní led). Amorfní led může rekrystalizovat při teplotě nad -145°C, s obsahem dalších minerálů apod. je teplota mírně vyšší a proto se vitrifikovaný vzorek nemůže při atmosférickém tlaku zahřát na vyšší teplotu než je teplota rekrystalizace! Pro mražení a samotné uskladnění zamražených vzorků se používá nejčastěji poměrně levný tekutý dusík, jehož teplota je -196°C. Tekutý dusík se běžně používá pro skladování zamražených vzorků, ale pro samotné zamražení jednoduchým ponořením je spíše nevhodný kvůli Leidenfrostovému jevu (=při kontaktu s výrazně teplejším povrchem dochází k tvorbě par kapaliny, které jednotlivé kapky kapaliny tepelně izolují od teplejšího povrchu). Efektivnější kryogeny jsou tekutý etan či propan. Fázový diagram napravo znázorňuje zamražení vzorku (vodorovná čára směřující doleva) a sublimaci (svislá čára). 1 K/s HPFFreezingA Problematika mražení HPFFreezingB HPFFreezingC RobardsFreezing1a RobardsFreezing2a 1000 K/s 10 K/s 1 K/s 10 K/s 1000 K/s 30 Problematika zamražení vzorků na příkladu buňky. •Při pomalém mražení s rychlostí 1°C/s dochází k tvorbě krystalů ledu, které roztrhají celou buňku. •Při rychlejším mražení (cca 10°C/s) dochází k tvorbě menších krystalů ledu, které nemusí roztrhat celou buňku, ale krystaly uvnitř buňky mohou narušit strukturu organel. •Dobře zamražená buňka musí být zamražená rychle, aby se v ideálním případě zamezilo tvorbě krystalů, příp. aby se tvořily jen malé krystaly nenarušující strukturu vzorku. Problematika mražení 200 nm 200 nm Cílem je zamrazit vzorek tak, aby nedošlo ke krystalizaci ledu, která vede k destrukci ultrastruktury vzorku http://www1.lsbu.ac.uk/water/water_phase_diagram.html#intr2 31 Pohled na fázový diagram vody. Vodorovná osa je teplota, svislá osa je tlak. Zelená oblast označuje tekutinu a modrá část led. Je patrno, že existuje až 11 typů ledu, z nichž většina je krystalická. •Plná čára znázorňuje rychlé ponoření vzorku do kryogenu. Zde je důležitá rychlost, použitý kryogen a samotný vzorek. •Čárkovaná čára znázorňuje rychle mražení vzorku za vysokého tlaku (high-pressure-freezing; HPF). Efektivní mražení jako mrazová fixace vzorku Cryo-fixace: Rychlé ponoření do tekutého dusíku (propanu, etanu) •Rychlé, levné, vhodné pro tenké vzorky – Leidenfrostův efekt High pressure freezing (HPF): •Rychlé, efektivní, vhodné pro většinu vzorků, velmi drahé • • msotw9_temp0 > https://www.leica-microsystems.com/typo3temp/_processed_/csm_Leica_EM_ICE_w-gal_02_870463064b.jpg 32 Typické přístroje pro mrazovou fixaci: •Plunger se používá pro rychlé ponoření vzorku do tekutého kryogenu; vzhledem k Leidenfrostovému jevu není moc vhodný tekutý dusík, ale častěji se používá tekutý propan nebo tekutý etan; tato technika je vhodná jen pro velmi tenké vzorky na velmi tenké podložce (typická mrazicí technika pro kryogenní elektronovou tomografii, kde tenký vzorek typu viru je v suspenzi nanesen na velmi tenkou síťku (na obrázku vlevo)). •Vysokotlaké mražení (HPF) se provádí speciálním přístrojem, kde se na vzorek stříká tekutý dusík při velmi vysokém tlaku 2045 barů; vzorek je umístěn ve speciálních karierech, aby nedošlo k deformaci vzorku v důsledku krystalizace ledu (viz video na pozdějším slajdu). Příprava biologických vzorků pro SEM 33 https://www.leica-microsystems.com/fileadmin/_processed_/1/4/csm_Figure-1_16_86aff683e0.png Dalším krokem v cryo-SEM obvykle bývá mrazový lom (freeze-fracturing). Mrazový lom zamraženého vzorku se provádí v přípravné cryo-komoře za velmi nízkých teplot a velmi nízkého tlaku. Zlomení vzorku dovoluje odhalit vnitřní povrchy buněčných organel. Lom se ve zmrazeném materiálu šíří cestou nejmenšího odporu, nejčastěji podél membrán. Velkou výhodou mrazového lámání je fakt, že při něm nedochází k poškození odhalovaného povrchu tlakem žiletky či jiným řezným nástrojem. Obvykle následuje sublimace (mrazové leptání, angl. freeze-etching), při které se zvýrazní 3D struktura lomové plochy (např. prohlubně a vakuoly). Přístrojové vybavení pro cryo-SEM na ÚPT E:\!UrgentVK\Meetings\201610-11_Workshop_cryo-SEM\!VK_prednaska\Foto_Magellan_cryo\dsc_1438.jpg Magellan (Brno) E:\!UrgentVK\Meetings\20131213_UPT_Vanocni_seminar\cryo\2013-12-11-609.jpg E:\!UrgentVK\Meetings\20131213_UPT_Vanocni_seminar\cryo\2013-12-11-610.jpg E:\!UrgentVK\Meetings\20131213_UPT_Vanocni_seminar\cryo\2013-12-11-608.jpg Loading station SEM Magellan 400L (FEI) vybavený pro cryo-SEM Cryo-vakuová komora ACE600 & VCT100 pohled do komory SEM vybaveného cryo-stolkem Tento slajd ukazuje typické přístrojové vybavení potřebné pro pozorování pomocí cryo-SEM: zamrazený vzorek se upevní v tekutém dusíku na cryo-držák v loading station a pomocí cryo-vakuového transferu (tj. „tyčkou“ vlevo na většině snímků) se přenese do cryo-vakuové komory; od této chvíle je vzorek nejen při kryogenní teplotě, ale zároveň ve vysokém vakuu. V cryo-vakuové komoře lze vzorek mrazově lámat (metoda freeze-fracturing), sublimovat (v případě velmi dlouhé sublimace až do úplného vysušení se tomu říká freeze-drying). Dále se vzorek na cryo-držáku přenáší pomocí cryo-vakuového transferu z cryo-vakuové komory vzorek do SEM vybaveného cryo-stolkem (cryo-SEM znázorněn na obrázku dole vlevo). Cryo-SEM (kvasinky, mrazový lom) 35 Smyslem mražení je nakápnout poměrně hustý vzorek do tenké měděné trubičky tak, aby na jednom konci vyčnívala kapka, a rychle ji zamrazit. Tato vyčnívající kapka bude následně mrazově zlomená a pozorována pomocí cryo-SEM. Zamrazené vzorky v tyčinkách lze buď uchovat v Dewarově nádobě pro pozdější pozorování nebo nainstalovat na vhodný cryo-držák. Zde je cryo-držák pro dvě tyčinky. Zamrazený vzorek již nemůže opustit kryogenní teploty, po instalaci je cryo-držák se vzorky přesunut do loading station. Pomocí připraveného cryo-vakuového transferu se cryo-držák se vzorky přenese do cryo-vakuové komory pro další zpracování. V cryo-vakuové komoře se zmrazené kapičky vzorku lámou, v tomto případě pomocí vychlazeného ultramikrotomového nože. Po lomu zpravidla následuje krátká sublimace, která více poodhaluje strukturu vzorku. Po sublimaci se vzorek přesune ve vakuu a za kryogení teploty do komory cryo-SEM pro následné pozorování. Video znázorňující mražení vzorků jednoduchým ponořením do tekutého dusíku včetně přípravy pro cryo-SEM; jedná se o vzorek husté suspenze mikrobů, které snesou tento typ mražení. Titulky – pokud se nezobrazují správně [začátek m:s]: •[0:0] Smyslem mražení je nakápnout poměrně hustý vzorek do tenké měděné trubičky tak, aby na jednom konci vyčnívala kapka, a rychle ji zamrazit. Tato vyčnívající kapka bude následně mrazově zlomená a pozorována pomocí cryo-SEM. •[0:28] Zamrazené vzorky v tyčinkách lze buď uchovat v Dewarově nádobě pro pozdější pozorování nebo nainstalovat na vhodný cryo-držák. Zde je cryo-držák pro dvě tyčinky. Zamrazený vzorek již nemůže opustit kryogenní teploty, po instalaci je cryo-držák se vzorky přesunut do loading station. •[0:37] Pomocí připraveného cryo-vakuového transferu se cryo-držák se vzorky přenese do cryo-vakuové komory pro další zpracování. •[1:09] V cryo-vakuové komoře se zmrazené kapičky vzorku lámou, v tomto případě pomocí vychlazeného ultramikrotomového nože. Po lomu zpravidla následuje krátká sublimace, která více poodhaluje strukturu vzorku. •[1:21] Po sublimaci se vzorek přesune ve vakuu a za kryogení teploty do komory cryo-SEM pro následné pozorování. Sporobolomyces shibatanus C:\!UrgentVK\Meetings\20151005_prednaska_u_Marove_FCH_VUT\20150518_krasavice_kryo\sshk_1_95_4\1_001 .tif C:\!UrgentVK\Meetings\20151005_prednaska_u_Marove_FCH_VUT\20150518_krasavice_kryo\sshk_1_95_4\1_004 .tif C:\!UrgentVK\Meetings\20151005_prednaska_u_Marove_FCH_VUT\20150518_krasavice_kryo\sshk_1_95_4\1_007 .tif C:\!UrgentVK\Meetings\20151005_prednaska_u_Marove_FCH_VUT\20150518_krasavice_kryo\sshl_2_95_4\1_013 .tif C:\!UrgentVK\Meetings\20151005_prednaska_u_Marove_FCH_VUT\20150518_krasavice_kryo\sshl_2_95_4\1_025 .tif C:\!UrgentVK\Meetings\20151005_prednaska_u_Marove_FCH_VUT\20150518_krasavice_kryo\sshl_2_95_4\1_028 .tif Kontrola Vzorek s tukovými váčky 36 Příklad vzorku zamraženého dle předchozího videa. Srovnání typu mražení u biofilmu Kultivace mikrobiální kultury Fixace plungingem do tekutého kryogenu Fixace pomocí HPF 37 37 10.1016/j.micron.2018.04.006 10.3390/s18124089 Srovnání rychlého ponoření do tekutého propanu a HPF v případě vzorku mikrobiálního biofilmu, který byl nakultivován na safírové sklíčko. Po zamrazení bylo sklíčko příčně zlomeno metodou mrazového lomu. Vpravo jsou cryo-SEM snímky lomu, kde sklíčko je nalevo, uprostřed je biofilm a napravo je vakuum, příp. pohled na povrch biofilmu. Je vidět, že zatímco struktura zamrazená plungingem má zřetelnou krystalickou strukturu (houbovitá struktura), struktura vzorku zamrazeného HPF je velmi jemná. Cryo-SEM (HPF, bakterie, mrazový lom) 38 Přístroj pro vysokotlaké mražení (HPF) zamrazuje vzorky v malých nosičích (carrierech) o průměru 3 mm nebo 6 mm, které jsou uloženy mezi dva half-cylindry (na videu světlé) a middle-plate (na videu tmavá). Nosiče (zde hliníkové disky) mají důlek pro vzorek. V tomto případě se jedná o nosiče o průměru 6 mm a hloubkou důlku 0.2 mm. Do nosiče se pipetuje vzorek, uzavře se druhým nosičem, nadbytek vzorku se odsaje a zaklapnutím druhého half-cylindru dojde k automatickému zamrazení vzorku. HPF systém nakonec vyhodnotí kvalitu zamrazení. Po zamrazení jsou vzorky spolu s middle-plate a half-cylindry automaticky vhozeny do tekutého dusíku. Nosiče obsahující vzorek se uloží do popsaných kontejnerů, které se mohou skladovat v Dewarově nádobě dlouhou dobu. Zamrazené vzorky již nemohou opustit teplotu tekutého dusíku! Pro pozorování v cryo-SEM se vzorky z Dewarovy nádoby namontují na speciální cryo-držák; v tomto případě lze na cryo-držák nainstalovat 2 různé nosiče (každý obsahuje uvnitř zamrazený vzorek). Poté se držák přesune do loading station, odkud se přesune cryo-vakuovým transferem do cryo-vakuové komory (cryo-přípravny). V cryo-vakuové komoře se vzorek mrazově láme. Komora na videu obsahuje vymrazený mikrotomový nůž i vymrazený skalpel s manipulátorem – lze například odstranit vrchní část nosiče nebo vzorek poškrábat. Poté probíhá řízená sublimace (v některých případech doprovázena pokovením) a přesun cryo-držáku s připravenými vzorky do cryo-SEM pro pozorování. Video znázorňující mražení vzorků pomocí HPF (suspenze bakterií). Titulky – pokud se nezobrazují správně [začátek m:s]: •[0:0] Přístroj pro vysokotlaké mražení (HPF) zamrazuje vzorky v malých nosičích (carrierech) o průměru 3 mm nebo 6 mm, které jsou uloženy mezi dva half-cylindry (na videu světlé) a middle-plate (na videu tmavá). •[0:30] Nosiče (zde hliníkové disky) mají důlek pro vzorek. V tomto případě se jedná o nosiče o průměru 6 mm a hloubkou důlku 0.2 mm. Do nosiče se pipetuje vzorek, uzavře se druhým nosičem, nadbytek vzorku se odsaje a zaklapnutím druhého half-cylindru dojde k automatickému zamrazení vzorku. HPF systém nakonec vyhodnotí kvalitu zamrazení. •[1:45] Po zamrazení jsou vzorky spolu s middle-plate a half-cylindry automaticky vhozeny do tekutého dusíku. Nosiče obsahující vzorek se uloží do popsaných kontejnerů, které se mohou skladovat v Dewarově nádobě dlouhou dobu. Zamrazené vzorky již nemohou opustit teplotu tekutého dusíku! •[3:05] Pro pozorování v cryo-SEM se vzorky z Dewarovy nádoby namontují na speciální cryo-držák; v tomto případě lze na cryo-držák nainstalovat 2 různé nosiče (každý obsahuje uvnitř zamrazený vzorek). Poté se držák přesune do loading station, odkud se přesune cryo-vakuovým transferem do cryo-vakuové komory (cryo-přípravny). •[6:00] V cryo-vakuové komoře se vzorek mrazově láme. Komora na videu obsahuje vymrazený mikrotomový nůž i vymrazený skalpel s manipulátorem – lze například odstranit vrchní část nosiče nebo vzorek poškrábat. Poté probíhá řízená sublimace (v některých případech doprovázena pokovením) a přesun cryo-držáku s připravenými vzorky do cryo-SEM pro pozorování. Cryo-SEM mikrobiálních biofilmů •Vysokotlaké mražení (HPF) a sublimační experimenty • Hrubanová et al: Microsc. Microanal. 20, S3 (2014) 1950 Obr. 1a, b: Cryo-SEM biofilmů C. albicans a S. epidermidis po minutové sublimaci při -96˚C. Obr. 2a, b: Cryo-SEM biofilmů C. albicans a S. epidermidis po 7 minutách sublimace při -96˚C; Porovnání oblastí blízkého okolí mikrobů a kultivačního média (červené boxy). 2b 1a 2a 1b 39 Sublimační experimenty odhalují místa s vyšší a nižší koncentraci volné vody, resp. ledu, který v průběhu sublimace opouští vzorek. Tímto způsobem lze mapovat složení vzorku s proměnlivým zastoupením vody, v případě biofilmu je možné pozorovat hustotu extracelulární matrice. Obsah 1.Princip SEM 2. 2.Příprava biologických vzorků pro SEM 3. 3. Vybrané aplikace SEM 4. 4.Speciální techniky SEM 5. 5. 40 Analýza historického zubního kamene Si Fe C Inside Outside Soil Wt % Atomic % Error % Wt % Atomic % Error % Wt % Atomic % Error % Si 0,00 0,00 5,21 3,22 2,28 5,53 43,94 32,82 4,45 Al 0,00 0,00 6,66 1,23 0,91 7,98 2,92 2,27 6,99 Mn 5,62 2,38 2,84 0,42 0,15 12,08 0,00 0,00 0,00 Fe 2,26 0,94 4,17 1,10 0,39 5,02 3,24 1,22 3,32 Ca 36,61 21,29 1,42 24,25 12,05 1,51 1,04 0,54 8,02 •Kosterní pozůstatky vojáka z období napoleonských válek – prokázáno antropologicky •Hypotéza o poškození zubů v důsledku otevírání papírových kartuší s nábojem do pušky •Kontaminace je jasně rozlišitelná v případě Si, Fe •Uhlík ukazuje na místa s vyšší koncentrací organického materiálu Spolupráce: Laboratoří biologické a molekulární antropologie Ústavu experimentální biologie PřF MU (D. Fialová) Analýza historického zubního kamene: Prvková analýza pomocí EDX může přinést zajímavé informace a potvrdit domněnky vzniklé z antropologického ohledání. Raritní obrus zubů byl přisuzován opakovanému obrušování oblasti patronami do pušky. Tato hypotéza byla potvrzena nálezem olova a síry v zubním kameni – oboje je součástí kulky/střelného prachu. Korelativní mikroskopie: STEM + CL + EDX + BSE Picture 14 description STEM CL EDX BSE Picture 14 description Ti_K O_K filtrováno BF+CL Chlazení vzorku na kryo teploty – omezení kontaminace povrchu spolu s vyšší odolností vůči elek. svazku BF DF1 HAADF Korelativní mikroskopie: Jednotlivé techniky je možné kombinovat za účelem získání požadované informace. Vzorek plicní tkáně myši ve formě ultratenkých řezů (okolo 60 nm) je pozorován v prošlých elektronech (obraz ve vysokém rozlišení), viditelném světle/katodoluminiscence (shluky TiO2 svítí) i pomocí rentgenových fotonů (potvrzení že jde o Ti). Výsledkem je znalost distribuce TiO2 nanočástic v závislosti na době expozice a důkaz že jde o hledané částice. Cryo-SEM mikrostruktury sýrů Burdikova et al: Microsc. Microanal. 20, S3 (2014) 1336 Struktura sýru byla studována různými mikroskopickými technikami ve spolupráci s Teagasc Food Research Centre, Irsko. Cíl: klasifikace jednotlivých parametrů (podíl proteinů, tuku, bakterií, procesu výroby a zrání) s cílem optimalizace výroby a dosažení co nejlepší kvality sýrů. Obr. 1: Cryo-SEM obraz ukazující krystalickou inkluzi v mikrostruktuře sýru, měřítko je 10 μm. Obr. 2: 3D rekonstrukce z CLSM, měřítko 50 μm. 1 2 43 Korelace světelné mikroskopie a SEM (CLSEM) Studium průběhu infekce buněk bakterií Salmonella enterica. Zeleně (eGFP) značené buňky byly vystaveny bakteriální infekci (červená-mCherry). Pomocí korelace pak byla konkrétní místa infekce blíže studována pomocí SEM. d Konfokální mikroskop Skenovací elektronový mikroskop Korelace CLSEM 10.1038/s41598-019-53085-6 44 Fluorescenční nanodiamanty pro značení CLEM Nanodiamanty (FND), jako fluorescenční značky, byly enkapsulovány lipidy a použity pro značení HeLa buněk vazbou na CD44. Enkapsulace umožnila specifické vazby fluorescenčních značek a zabránila koagulaci jednotlivých částic. Fixované HeLa buňky byly vystaveny biotinilovaným anti-CD44 protilátkám a na ty se dále vázaly FND. a) SEM HeLa buněk b, c) Zoom vybraných částí SEM d, e) bright-field světelné mikroskopie f, g) fluorescenční snímky h, i) CLEM snímky vybraných míst z a) značených bílými obdélníky j) Zvětšení h) k) Profily intenzit bílé přerušované čáry z j) d 10.1021/acs.analchem.7b04549 45 Obsah 1.Princip SEM 2. 2.Příprava biologických vzorků pro SEM 3. 3. Vybrané aplikace SEM 4. 4.Speciální techniky SEM 5. 5. 46 SEM pro 3D rekonstrukce FIB SEM Focused Ion Beam SEM •Využití fokusovaného svazku iontů k opracování povrchu vzorku a odhalení vnitřních struktur SBF SEM Serial Block-Face SEM •Využití ultramikrotomu umístěného v komoře mikroskopu pro odkrojení ultratenkých řezů z povrchu vzorku 10.1016/j.tice.2018.09.006 47 FIB SEM: Focused Ion Beam SEM S:\KíťaKubi\__Prezentace\LYRA3.png Milling (etching) •Mechanické odstranění svrchní vrstvy vzorku pro zobrazení vnitřních struktur -> 3D rekonstrukce •Využití např. iontů galia Využití dvou různých svazků •Ionty pro opracování vzorku (milling) •Elektrony pro pozorování povrchu 48 C. albicans, S. epidermidis – FIB-SEM Biofilm Candida albicans + Staphylococcus epidermidis po 2 dnech kultivace 10μm 49 Studium mezibuněčného spojení pomocí septal junctions Rekonstrukce septal junctions (SJ), „nanopórů“ umožňujících molekulární výměnu mezi buňkami pomocí difuze, u mnohobuněčných sinic Anabaena sp. PCC 7120 pomocí cryo elektronové tomografie. Vzorek nanesený na síťku byl zmražen pomocí metody plunge freezing a lamely byly připraveny pomocí cryo FIB milling. 10μm SJ značeny šipkami, CM, cytoplazmatická membrána; OM, vnější membrána; PB, fykobilisomy; PG, septal peptidoglykan; TM, thylakoidní membrány 50 Studium mezibuněčného spojení pomocí septal junctions Rekonstrukce septal junctions (SJ), „nanopórů“ umožňujících molekulární výměnu mezi buňkami pomocí difuze, u mnohobuněčných sinic Anabaena sp. PCC 7120 pomocí cryo elektronové tomografie. Vzorek nanesený na síťku byl zmražen pomocí metody plunge freezing a lamely byly připraveny pomocí cryo FIB milling. 10μm Cryotomogram oblasti sept cyanobakterie Anabaena Septal junctions: světle zelená; Thylakoidní membrány: tmavě zelená; Peptidoglykan: šedá; Vnější a cytoplazmatická membrána: hnědá; Granule: žlutá; Měřítko 100 nm 10.1016/j.cell.2019.05.055 51 Studium chloroplastů při vystavení buněk solnému stresu Listy rýže byly vystaveny vysoké koncentraci soli a následně pomocí FIB-SEM byly zrekonstruovány tvary chloroplastů. 10μm Kontrolní vzorky obsahují (zeleně značené) chloroplasty tvaru čočky umístěné v blízkém kontaktu se sousedními chloroplasty. 10.1093/aob/mcz192 52 Studium chloroplastů při vystavení buněk solnému stresu Listy rýže byly vystaveny vysoké koncentraci soli a následně pomocí FIB-SEM byly zrekonstruovány tvary chloroplastů. 10μm Vzorky vystavené působení NaCl obsahovaly chloroplasty oválného tvaru bez kontaktu s dalšími chloroplasty. Celkový objem chloroplastů ale zůstal nezměněn. 10.1093/aob/mcz192 53 Studium chloroplastů při vystavení buněk solnému stresu Listy rýže byly vystaveny vysoké koncentraci soli a následně pomocí FIB-SEM byly zrekonstruovány tvary chloroplastů. 10μm 3D rekonstrukce jednotlivých chloroplastů u kontrolního vzorků bez vystavení stresu (C1-C3) a u vzorků s působením vysoké koncentrace NaCl (N1-N3) 10.1093/aob/mcz192 54 Imunoznačení v kombinaci s FIB-SEM Využití imunoznačení pro studium proteinů tvořících jaderné póry (NPC). Buňky byly značeny pomocí zlatých nanočástic vázaných na sekundární protilátky a fluorescenčního barviva pro korelaci se světelnou mikroskopií. a)Snímky z konfokálního fluorescenčního mikroskopu zobrazující myoblasty a myotubuly značené zeleně pro NPC, modře pro DNA a červeně pro aktin b)Vybrané snímky z FIB-SEM zobrazující imunoznačené NPC c)3D rekonstrukce jádra se zeleně značenými NPC 10.1002/adma.201900488 55 Korelace CLEM s FIB-SEM / studium jednotlivých organel Pro studium organel pomocí světelné mikroskopie a FIB-SEM byly HeLa buňky značeny pomocí fluorescenčního LAMP1-GFP (zelená) a konjugátu dextranu s barvivy Alexa568/647 (fialová). Po lokalizaci konkrétních endosomů pomocí fluorescenčních barviv byly tyto organely následně pomocí FIB-SEM identifikovány jako: 6) Časný endosom 7) (Auto)lysosom 8) Lysosom 9) Pozdní endosom 10) Pozdní endosom 10.1111/tra.12557 56 Analýza kostí pomocí SBF-SEM Byl stanoven specifický protokol pro přípravu vzorků kostí pro analýzu SBF-SEM. Na obrázku je možné porovnat snímky z TEM a SBF kostí myši po perfuzní fixaci a dekalcifikaci a lidských kostí po imerzní fxaci a dekalcifikaci a) Osteocyt myši s neponičenými membránami a bez změny objemu buňky b) Snímek z SBF ukazuje dostatečné rozlišení a kontrast pro zobrazení ultrastruktury c) Detail jádra d) Lidský osteocyt s neporušenými membránami, ale zvětšeným pericellulárním prostorem naznačující smrštění buňky e, f) vyplněné a nevyplněné lakuny a canaliculi osteocytů zobrazené v SBF-SEM 10.1016/j.bone.2019.115107 3D rekonstrukce myšího osteocytu NM=jaderná membrána CM=buněčná membrána m=mitochondrie Cy=cytoplazma N=jádro 57 Závěr •Brno je světové centrum elektronové mikroskopie – –tři firmy vyvíjející a produkující elektronové mikroskopy (z Brna pochází asi 35 % světové produkce elektronových mikroskopů) – – – – – –několik významných vědeckých institucí ÚPT AVČR, CEITEC-MU, CEITEC-VUT, VUVEL, … – • •V Brně se organizují pravidelné akce – –každý březen: Dny elektronové mikroskopie (firmy a instituce organizují zajímavé přednášky pro veřejnost a exkurze) – –každý listopad: v rámci Týdne vědy AV ČR bývají dny otevřených dveří pro veřejnost 58 https://www.lv-em.com/web/image/1551 http://taborulet.cz/wp-content/uploads/2016/05/TESCAN-logo.jpg Studujete v Brně, světovém centru elektronové mikroskopie! Využijte toho a navštivte alespoň nějakou akci pro veřejnost, případně můžete využít některé z odborných pracovišť pro svou výzkumnou práci. Děkuji za pozornost •Vladislav Krzyžánek •krzyzanek@isibrno.cz 59 Děkuji, že jste došli až na poslední slajd, v případě jakýchkoliv dotazů mně kontaktujte na e-mail krzyzanek@isibrno.cz Zároveň děkuji svým kolegům za pomoc s přípravou přednášky.