Molekulární a buněčná biologie nádorů Prof. RNDr. Jana Šmardová, CSc. Ústav experimentální biologie Přírodovědecká fakulta MU Brno 2020 Bi9910 pondělí 16.00 – 18.00 A11 – č. 305 2. Mitogenní signalizace I protoonkogeny, onkogeny, signální dráhy, regulace buněčného cyklu Molekulární a buněčná biologie nádorů 2020 Bi9910 pondělí 16.00 – 18.00 A11 – č. 305 (1) Produkce vlastních proliferačních signálů (2) Necitlivost k signálům zastavujícím buněčný cyklus (3) Odolnost k programované buněčné smrti (4) Neomezený replikační potenciál (5) Indukce angiogenese (6) Aktivace invazivity a metastazování (7) Genetická nestabilita a mutace (8) Přítomnost zánětu podporující nádor (9) Přeprogramování energetického metabolismu (10) Schopnost vyhnout se destrukci imunitním systémem (11) Změny mikroprostředí nádoru Získané vlastnosti maligního nádoru Hanahan D. and Weinberg R.A., Cell 144 (2011) 646-674 Je rakovina nemoc buněčného cyklu? • ztráta regulace buněčného cyklu je kritická součást buněčné transformace • ztráta regulace buněčného cyklu není jedinou součástí kancerogeneze, většinou sama o sobě není plně transformující Průběh buněčného cyklu M - G1 - S - G2 M - kopie DNA jsou separovány; kondenzované chromozomy G1 - obsah DNA: 2N S - replikace DNA; inkorporace značených nukleotidů G2 - obsah DNA: 4N G0 - stárnoucí nebo dlouhodobě se nedělící buňky postmitotický stav - bez možnosti návratu do cyklu, spojen s terminální diferenciací Řídící centrum buněčného cyklu Název „cell cycle clock“ naznačuje, že v jádře buňky funguje nějaké molekulární zařízení, které integruje všechny možné signály přicházející zevnitř i z okolí buňky a rozhoduje o vstupu buňky do aktivního buněčného cyklu nebo naopak ustoupení do neproliferačního stavu. Weinberg RA. The Biology of Cancer. Garland Science 2007 Klíčové molekuly řízení buněčného cyklu  cyklin dependentní kinázy (Cdk, Cdc; human - 13/2009) • fosforylují své substráty • mají katalytickou a regulační podjednotku, aktivita vždy závislá na vazbě cyklinu  cykliny (human - 29/2009) • jejich hladina kolísá v závislosti na fázi buněčného cyklu • uplatňují se v příslušné fázi cyklu tím, že aktivují příslušnou CDK a směrují ji k jejím substrátům, pak jsou rychle odbourány • některé necyklují, i další funkce,…  inhibitory (CKIs) • Ink4 rodina CKIs (p16, p15, p18, p19) – cílí především na Cdk4 a Cdk6 • Cip/Kip rodina (p21, p27, p57) – promiskuitnější, často interferují s vazbou cyklinu Klíčové molekuly řízení buněčného cyklu Bod restrikce • mitogenní stimulace navozuje buněčný cyklus • antimitogenní stimulace blokuje buněčný cyklus • Buněčný cyklus je závislý na exogenní mitogenní signalizaci pouze po určitou dobu fáze G1 - tak byl objeven „rozhodovací“ moment cyklu - bod restrikce bod restrikce: klíčový regulační / rozhodovací bod buněčného cyklu pRB - spínač buněčného cyklu • pRB v málo fosforylovaném (nefosforylovaném, hypofosforylovaném) stavu blokuje průchod bodem restrikce: interaguje s TF rodiny E2F (8 genů) a blokuje jejich schopnost transaktivovat jejich cílové geny, jejichž produkty jsou nutné pro S fázi • fosforylací ztrácí pRB schopnost vázat E2F a průchod bodem restrikce je tak možný  regulace průchodu bodem restrikce = regulace fosforylace pRB Rodina faktorů E2F • 8 genů + alternativní sestřih + násobné transkripční počátky • regulace: transkripční, translační, posttranslační, degradace proteinů, vazba kofaktorů, buněčná lokalizace Kent LN a Leone G. Nat Rev Cancer 19: 326-338, 2019 Klíčové molekuly řízení buněčného cyklu  cyklin dependentní kinázy (Cdk, Cdc; human - 13/2009) • fosforylují své substráty • mají katalytickou a regulační podjednotku, aktivita vždy závislá na vazbě cyklinu  cykliny (human - 29/2009) • jejich hladina kolísá v závislosti na fázi buněčného cyklu • uplatňují se v příslušné fázi cyklu tím, že aktivují příslušnou CDK a směrují ji k jejím substrátům, pak jsou rychle odbourány • některé necyklují, i další funkce,…  inhibitory (CKIs) • Ink4 rodina CKIs (p16, p15, p18, p19) – cílí především na Cdk4 a Cdk6 • Cip/Kip rodina (p21, p27, p57) – promiskuitnější, často interferují s vazbou cyklinu  pRB  E2Fs Úroveň fosforylace pRB v průběhu buněčného cyklu Stupeň fosforylace pRB je úzce koordinován s průběhem buněčného cyklu: při přechodu M/G1 jsou všechny fosfátové zbytky odstraněny; při přechodu bodem R masivně narůstá fosforylace až k dosažení fáze M. (pRB je fosforylován na zbytcích serinů a threoninů) Weinberg RA. The Biology of Cancer. Garland Science 2007 Regulace buněčného cyklu Lundberg AS F a Weinberg RA, Eur J Cancer 35: 1886-1894, 1999 Regulace fosforylace pRB Fosforylace pRB • pozitivně ovlivněna: - komplexy cyklinů D (D1, D2 a D3) a CDK4/CDK6 - komplexy cyklinu E a CDK2 • negativně ovlivněna: - inhibitory komplexů cyklin:CDK p21WAF1 a p27KIP1 - inhibitory CDK p15INK4B a p16INK4A Mitogenní signalizace vede ke zvýšené expresi cyklinů D a snížení hladiny inhibitorů Antimitogenní signalizace vede k navýšení hladiny některého inhibitoru a snížení hladiny cyklinů D Co je poškozeno při transformaci? • nádorový supresor pRB (retinoblastom, ..) • nádorový supresor p16INK4A (melanom, ..) • protoonkogeny cykliny D – amplifikace nebo zvýšená exprese cyklinu D1 u téměř 50% nádorů prsu, HNSCC – chromozomální translokace zahrnující cyklin D1 u lymfomů z buněk plášťové zóny – MCL - mantle cell lymphoma: t(11;14) • „periferní hráči“ - součásti mitogenních a antimitogenních drah Amplifikace genu pro cyklin D1 a nádory hlavy a krku • Příklad detekce amplifikace genu CCND1 (11q13) v dlaždicobuněčném karcinomu hlavy a krku (HNSCC) metodou FISH. Zde 3 až 5 kopií na buňku. • Asi 1/3 těchto nádorů má amplifikaci CCND1 a tomu odpovídající zvýšenou expresi cyklinu D1 a tím rozvrácenou regulaci fosforylace pRB. Weinberg RA. The Biology of Cancer. Garland Science 2007 Cyklin D1 a lymfom z buněk plášťové zóny (MCL) Typickým znakem je translokace t(11;14)(q13;q32). Jejím důsledkem je fúze transkripčního zesilovače genu IGH pro těžký imunoglobulinový řetězec μ na chromozomu 14q32 a genu CCND1 kódujícího cyklin D1 na chromozomu 11q13, a následně vysoká exprese cyklinu D1. Co je poškozeno při transformaci? • nádorový supresor pRB (retinoblastom, ..) • nádorový supresor p16INK4A (melanom, ..) • protoonkogeny cykliny D – amplifikace nebo zvýšená exprese cyklinu D1 u téměř 50% nádorů prsu, HNSCC – chromozomální translokace zahrnující cyklin D1 u a lymfomů z buněk plášťové zóny – MCL - mantle cell lymphoma: t(11;14) • „periferní hráči“ - součásti mitogenních a antimitogenních drah Klasifikace protoonkogenů I I. Růstové faktory II. Receptory růstových faktorů III. Proteiny Ras IV. Nereceptorové tyrozinové proteinkinázy V. Transkripční faktory Toto rozdělení souvisí se strukturou signální dráhy: 1. Vazba růstového faktoru na receptor 2. Aktivace receptorové proteinkinázy 3. Přenos signálu do jádra kaskádou proteinkináz 4. Aktivace transkripčního faktoru Klasifikace protoonkogenů II (Mareš, Sedláček, Goetz 1996) 1. Růstové faktory 2. Receptory růstových faktorů 3. G-proteiny 4. Nereceptorové tyrozinové proteinkinázy (plazmatická membrána) 5. Cytoplazmatické serinové/threoninové proteinkinázy (cytoplazma) 6. Jaderné proteiny 7. Neklasifikované (např. BCL-2) ? klasifikace protoonkogenů není jednotná ? ? vztah protoonkogenů k regulaci buněčného dělení ? Příklady signálních drah Růstové faktory a tyrozinproteinkinázové (RTK) receptory Signalizace prostřednictvím fosforylace zbytků tyrozinů je využívána hlavně v mitogenní signalizaci. Ostatní signalizace využívají výlučně zbytky serinů a threoninů. Růstové faktory a tyrozinproteinkinázové receptory (RTK) Růstové faktory: polypeptidy, které jsou produkovány buňkami a navozují signalizaci k zahájení nebo zastavení proliferace, diferenciace, přežívání,… aktivací svých specifických receptorů na povrchu buněk • potvrzení účasti extracelulárních signálních molekul v procesu maligní transformace: faktory produkované nádorovými buňkami jsou schopny indukovat transformaci buněk in vitro Stimulace: • autokrinní - růstový faktor stimuluje produkující buňku • parakrinní - stimulace sousední buňky • endokrinní - stimulace vzdálených buněk Růstové faktory a RTK receptory RTK receptory: • transmembránové glykoproteiny složené z extracelulární, transmembránové a cytoplazmatické domény • extracelulární doména - cysteinové zbytky vytvářejí dva typy domén: Ig-like domény nebo cystein-rich domény - tvoří „kapsy“ pro vazbu růstového faktoru Weinberg RA. The Biology of Cancer. Garland Science 2007 Schéma přenosu signálu na EGFR Po vazbě svých specifických ligandů receptory dimerizují (s výjimkou IGF, který je kovalentně vázaným homodimerem) a dochází k autofosforylaci. Fosforylací se změní konformace - zpřístupní se katalytická doména a vazebná doména pro substráty. Substráty interagují především prostřednictvím svých SH2 a SH3 („Src-homology“) domén. Weinberg RA. The Biology of Cancer. Garland Science 2007 Schéma přenosu signálu na EGFR Typy mutací postihující růstové faktory a RTK receptory • produkce/nadprodukce (vlastních) růstových signálů ( autokrinní stimulace) • amplifikace receptoru: (a) koncentrace receptorových proteinů na povrchu buňky tak vysoká, že se molekuly nahodile setkávají a dimerizují i bez vazby ligandu; (b) neadekvátně efektivní „vychytávání“ extracelulárního signálu: buňky s koncentrovaným receptorem jsou pozitivně stimulovány k buněčnému cyklu, i když hladina extracelulárního signálu je nízká a za normálních okolností by mitogenní dráhu neaktivovala • změna struktury receptoru: jeho aktivace nezávislá na vazbě ligandu (bodovými mutacemi, krátkými delecemi, zkrácené formy, v důsledku fúze s jinými geny,…). v-ErbB má oproti EGFR zkrácenou extracelulární doménu  přenáší mitogenní signál konstitutivně bez vazby ligandu (1984 – odhalena strukturní podobnost EGFR a v-ErbB: „real bombshell“ - RAW) Změny postihující RTK receptory Fúze genů pro RTK receptory s jinými geny Konstitutivní dimerizace receptoru v důsledku fúze genu pro receptor s genem pro protein, který přirozeně tvoří dimery nebo oligomery (RTK receptory ve vzniklé chiméře mívají zkrácenou extracelulární doménu). Weinberg RA. The Biology of Cancer. Garland Science 2007 Struktura a hlavní třídy RTK receptorů Weinberg RA. The Biology of Cancer. Garland Science 2007 Rodina EGF rodina receptorů EGFR: erbB-1 (EGFR); erbB-2 (HER-2/neu); erbB-3 (HER-3); erbB-4 (HER-4) růstové faktory, které se váží na receptory EGFR: EGF, TGF, amphiregulin (AR), HB-EGF (heparin-binding EGF-like růstový faktor), cripto, betacellulin (BTC), epiregulin Rodina EGF EGF („epidermal growth factor“) - 53 aminokyselin - první identifikovaný a purifikovaný růstový faktor (Stanley Cohen Nobelova cena 1986) - syntetizován jako prekurzor (1217 AA) - stimuluje proliferaci a diferenciaci různých buněčných typů TGF- („transforming growth factor “) - 50 AA, 40% homologie s EGF, také mitogen - první identifikovaný autokrinní RF - syntetizován jako na membránu vázaný prekurzor, uvolňován ve dvou krocích proteolytickým štěpením - exprimován v mnoha nádorových buněčných liniích a také u mnoha nádorů, které exprimují EGFR Rodina EGFR EGFR (EGF receptor) • je kódován genem c-erbB-1 - homologní s v-erbB (přenášen retrovirem „avian erythroblastosis virus“: má deleci extracelulární domény) • někdy označovány jako erb-B receptory nebo HER („human EGF receptor“) • mohou fungovat jako homodimery a heterodimery - zvýšená exprese EGFRs byla detekována u nádorů prsu, hrtanu, jícnu, žaludku, vaječníků, endometria a děložního čípku a dalších; u nádoru prsu, jícnu a vaječníků je spojena se špatnou prognózou - bodové mutace EGFR1 u karcinomů plic: možnost cílené terapie malými inhibitory kinázové domény Rodina EGFR HER2/neu kódován genem c-erbB2; receptor homologní s EGFR, ale neváže ani EGF ani TGF- (a zřejmě ani neu)  vysoká exprese a/nebo amplifikace c-erbB2 detekována u adenokarcinomů prsu, slinných žláz, vaječníků, střeva a žaludku  u karcinomu prsu a vaječníků amplifikace a zvýšená exprese cerbB2 koreluje s horší prognózou a rezistencí k terapii  amplifikace HER2/neu je uznávaným prognostickým a prediktivním faktorem u nádoru prsu; pacientky s amplifikací HER2/neu podstupují radikálnější terapii a mohou být léčeny Herceptinem monoklonální protilátkou vázající se na protein HER2/neu Amplifikace HER2/neu u nádoru prsu • amplifikace HER2/neu poprvé nalezena u nádoru prsu v roce 1987 • amplifikace alespoň 5 kopií genu HER2/neu na buňku spojena s horší prognózou Weinberg RA. The Biology of Cancer. Garland Science 2007 Vsuvka: terapie cílená na členy EGFR Terapie nádorů zaměřená na receptory EGFR: A. Monoklonální protilátky Herceptin (Trastuzumab) – anti ErbB2 (HER2): léčba metastatických nádorů prsu, které mají vysokou expresi (a amplifikaci) HER2/neu Cetuximab (Erbitux) – anti EGFR: léčba pokročilých CRC spojených s expresí EGFR (Cetuximab váže EGFR asi 50x silněji než EGF – mechanismus účinku je pravděpodobně přímá kompetice s ligandem) Nutné vyšetření K-ras! (Proč?) Vsuvka: terapie cílená na členy EGFR B. Malé molekuly – inhibitory TPK domény Gefitinib (Iressa), Erlotinib (Tarceva) – inhibují ATP vazebné místo EGFR: léčba pokročilých nemalobuněčných nádorů plic; gefitinib je účinný pouze u subpopulace pacientů s určitými mutacemi TPK domény EGFR Lapatinib (Tyverb®) – 4-anulinochinazolin - duální inhibitor HER1 a HER2 - inhibuje intracelulární tyrozinkinázové domény HER1 a HER2 - indikován k léčbě pokročilého nebo metastazujícího ca prsu s vysokou expresí HER2 Rodina PDGF PDGF („platelet-derived growth factor“) - účinný mitogen – stimuluje mezenchymální buňky (fibroblasty, adipocyty, endoteliální buňky, buňky hladkého svalstva) (X EGF stimuluje hlavně epiteliální buňky!) - homodimer (AA, BB) nebo heterodimer (AB) dvou příbuzných řetězců A a B: B je kódován c-sis - v roce 1983 nalezena podobnost B řetězce s v-sis přenášeným virem opičího sarkomu: pozměněný B řetězec je konstitutivně exprimován a konstitutivně stimuluje k proliferaci buňky s příslušným receptorem - exprese PDGF A nebo B nebo obou často detekována u sarkomů, gliomů, karcinomů plic, prsu, jícnu, žaludku, střeva PDGF VEGF („vascular endothelial growth factor“)/VPG („vascular permeability factor“) • účinný mitogen vaskulárních endoteliálních buněk; hraje významnou roli v angiogenezi • VEGF/VPG mají 18% homologii s PDGF A a B flt kóduje receptor, který váže VEGF/VPG s vysokou afinitou a zprostředkovává jeho biologickou funkci; popsány příbuzné receptory: KDR a receptory kódované flt-3 a flt-4 Rodina FGF - velká rodina polypeptidů - FGF1 až FGF18, ale spíše se používají původní názvy (ne všechny faktory jsou mitogeny fibroblastů!!) - někdy se nazývají „heparin-binding growth factors“ - HBGFs, protože se na ně může heparin vázat a stimulovat jejich aktivitu bFGF (FGF2) a aFGF (FGF1) („basic, acidic fibroblast growth factor“) - asi 17.000 Da, mají 55% homologii, podobnou funkci, ale bFGF je mnohem aktivnější; název odvozen od rozdílného isoelektrického bodu - mitogeny buněk mezenchymálního, neuroektodermálního a epidermálního původu, uplatňují se v angiogenezi - autokrinní růstový faktor gliomů a meningiomů - zvýšená exprese často detekována u pokročilých astrocytomů - přispívají k růstu melanomů, osteosarkomů, hepatomů Rodina FGF FGF receptory - 4 geny: FGFR1 (flg nebo fms-like gen), FGFR2, FGFR3 a FGFR4 - geny ale mohou být alternativně sestřihovány a tvoří tak velmi komplexní skupinu receptorů (až 100 kombinací) s velmi různou afinitou k jednotlivým FGF faktorům K-sam - receptor z rodiny FGFR2 - je detekován hlavně u málo diferencovaných adenokarcinomů - zvýšená exprese koreluje s invazivitou a špatnou prognózou u nádorů žaludku Vsuvka: Achondroplázie • Nejčastější příčina lidského trpaslictví; autozomálně dominantní onemocnění. • Příčinou specifické mutace v genu FGFR3 (G1138A ~ 98%; G1138C ~ 1- 2%) v zárodečné linii. • Aktivace FGFR3 potlačuje v echondrální kosti proliferaci chondrocytů v růstové ploténce a pomáhá tak koordinovat růst a diferenciaci chondrocytů a diferenciaci progenitorových buněk kosti. • Mutace jsou aktivující, vedou k nepatřičné inhibici proliferace chondrocytů a diferenciace progenitorových buněk. Rodina HGF HGF („hepatocyte growth factor“; hepatopoietin A) - účinný mitogen hepatocytů, hraje roli při regeneraci jater, ale nejen hepatocytů!! - patří mezi faktory scatter (SF), které se podílejí na rozvolnění mezibuněčných interakcí některých epiteliálních a vaskulárních endoteliálních buněk c-met (MET) kóduje receptor, který specificky váže HGF - amplifikace c-met (nádory žaludku, melanomy) - mutantní onkogenní forma c-met - zkrácená, konstitutivně aktivní (bez vazby HGF) nebo bodové mutace v TPK doméně (nádory ledvin)  HGF produkovaný stromálními buňkami (zvýšená exprese) a c-met exprimovaný buňkami stromálními a nádorovými mohou kooperovat při růstu a morfogenezi některých nádorů Způsoby aktivace onkogenu MET Comoglio et al. Nat Rev Cancer 18: 341-357, 2018 Hereditární papilární karcinom ledviny • autozomálně dominantní dědičnost; vysoce penetrantní • spojeno se zárodečnými mutacemi c-met; gen lokalizován v lokusu 7q31 • papilární ca ledvin představují asi 15 % všech nádorů ledvin • predisponuje k násobným, bilaterální papilárním nádorům ledvin, naštěstí nemají tendenci brzy metastázovat • nebývá doprovázeno vývojovými vadami • většina germinálních (i somatických) mutací bodových, missense v TPK doméně c-met • aktivace c-met blokuje terminální diferenciaci renálních tubulárních buněk • protoonkogen c-met je mutován asi u 15 % sporadických papilárních nádorů ledvin RET - „orphan“ receptor - nejvíce příbuzný asi FGFR - potenciální ligandy: GDNF („glial cell line derived neutrotrophic factor“), neurturin, persephin, artemin - exprimován hlavně v neurální, neuroendokrinní a nefrogenní tkáni - popsány dva typy mutací: • „loss-of-function“ mutace (inaktivace receptoru RET) - spojeny s vývojovým onemocněním Hirschprungova nemoc (kompletně chybí některé nebo všechny gangliové buňky myenterického a submukozálního plexu tlustého střeva: střevní aganglióza narušuje peristaltiku) • „gain-of-function“ = onkogenní mutace – aktivace receptoru RET Vsuvka: Hirschprungova choroba • 1886 – Harald Hirschprung popsal příčinu úmrtí dvou nemluvňat • nedostatečná inervace způsobuje nedostatečnou peristaltiku a vede k chronické zácpě • 18,6 případů na 100 000 narozených dětí • pravděpodobnou příčinou je kombinace dvou mutací ve dvou genech: RET (CH 10) a EDNRB (CH 13) • RET kóduje protein RET, který se účastní vývoje některých částí nervového systému (pohyb neuroblastů z neurální trubice k trávicímu traktu během vývoje embrya) • protein EDNRB spojuje tyto nervové buňky s trávicím traktem – pravděpodobně více přispívá k vývoji HCH než se původně soudilo • asi 20% dětí má přidružené vývojové vady nebo syndrom; HN nejčastěji asociována s Downovým syndromem (7% pacientů), hluchotou, medulárním karcinomem štítné žlázy, MEN2, neurofibromatózou, neuroblastomem a vývojovými vadami srdce, trávicí trubice, mozku a močopohlavního ústrojí • většina případů sporadických, familiární zátěž zvyšuje riziko až 200x • multigenní onemocnění s více než 10 příčinnými geny, protoonkogen RET je nejprobádanější • mutace RET: u poloviny familiárních a 7-35% sporadických forem Vsuvka: Hirschprungova choroba Ježová M et al. Cesk Patol 55 (1): 53-59, 2019 RET • „gain-of-function“ = onkogenní mutace při onkogenní aktivaci RET se uplatňuje několik odlišných typů mutací: • Vrozené missense mutace způsobující konstitutivní aktivaci RET jsou spojeny s autozomálně dominantními vrozenými nádorovými syndromy MEN typu 2A a 2B („multiple endocrine neoplasia“ – mnohočetné endokrinní neoplazie) a FMTC („familial medullary thyroid carcinoma“ – familiální medulární karcinom štítné žlázy). Mnohočetná endokrinní neoplazie typ2 (MEN2) • autozomálně dominantní onemocnění; spojeno s mutacemi RET • gen lokalizován v lokusu 10q11.2 • Typ A: vysoká incidence medulárního karcinomu štítné žlázy (nádor produkující kalcitonin z parafolikulárních buněk štítné žlázy), často sdruženo s feochromocytomy nebo benigními adenomy paratyreoidy nebo obojím • Typ B: navíc ztluštění nervů a vývoj benigních neurálních tumorů – tzv. neurinomů, které se tvoří na sliznici úst a rtů. • typ A je častější než typ B • medulární karcinomy štítnice se vyvíjejí v různém věku - od 1 roku, v 70 letech je penetrance asi 70 % Mnohočetná endokrinní neoplazie typ2 (MEN2) Vsuvka: feochromocytomy • nádory dřeně nadledvin (80%), asi 20% z tkání mimo nadledviny (tzv. parangliomy) • 90% benigní, asi 10% malignizuje (metastazuje) • hormonálně vysoce aktivní (noradrenalin, adrenalin), bez léčby život ohrožující, fatální onemocnění („maligní“?) • většina feochromocytomů sporadických • asi 20% familiální výskyt, pak jsou mnohočetné; vyskytují se v rámci MEN II (A, B), FMTC, VHL, NF1 Familiální medulární karcinom štítné žlázy - FMTC • toto onemocnění je méně časté než MEN, objevuje se u postižených později a je obecně méně agresivní • souvisí se specifickými mutacemi RET • mutace RET spojené s MEN2 a FMTC jsou poměrně přesně vymezené, existuje korelace mezi fenotypem a genotypem: mechanismus této korelace není znám, ale možné souvislosti: - různé mutace různou měrou ovlivňují sílu aktivace receptoru - různé mutace mají rozdílný dopad na down-regulované dráhy Mutace RET vyskytující se u MEN2 a FMTC 1. Mutace se vyskytují hlavně v extracelulární doméně v oblasti pěti cysteinů („cystein rich domain“) C609, 611, 618, 620, 634 (u MEN 2A a FMTC), kde způsobují trvalou dimerizaci (tvorbou disulfidických můstků nespárovaných cysteinů) a aktivaci receptoru bez vazby ligandu. 2. U několika FMTC rodin detekovány mutace v katalytické - kinázové doméně (kodony 768, 804). Vzácnější syndrom MEN 2B je spojen s mutacemi kodonu 910 ve druhé části kinázové domény. Mutace RET vyskytující se u MEN2 a FMTC RET „gain-of-function“ • Missense mutace • Translokace vedou k deregulaci výsledného chimerického proteinu. Tato translokace detekována při studiu lymfomů: při transfekci DNA z postižených do experimentálních buněk (RET – „REarranged during Transfection“). Translokace 3´- částí RET spolu s 5´- částí jiného genu se vyskytuje u thyroidních papilárních karcinomů. Výsledný fúzní gen obsahuje tyrozin kinázovou doménu RET a část genu, který umožňuje konstitutivní dimerizaci, a tím konstitutivní aktivaci. • Translokace 3´- částí RET spolu s 5´- částí jiného genu se vyskytuje u thyroidních papilárních karcinomů. Výsledný fúzní gen obsahuje tyrozin kinázovou doménu RET a část genu, který umožňuje konstitutivní dimerizaci, a tím konstitutivní aktivaci. • Radiation-induced human papillary thyroid cancer (PTC) is associated with chromosomal inversions that involve the genetic loci H4 and RET on chromosome 10. RET RTK receptor Kit • původně popsán jako onkoprotein kódovaný retrovirem kočičího sarkomu • jeho ligandem je SCF „stem cell factor“, dříve MGF „mast cell growth factor“; stimuluje některé krevní, ale také nehematopoietické buňky, např. melanocyty • mutantní formy Kit signalizují konstitutivně, bez vazby ligandu; typické mutace se nacházejí v juxtamembránové cytoplazmatické doméně Weinberg RA. The Biology of Cancer. Garland Science 2007 Mechanismus aktivace receptoru Kit • juxtamembránová (JM) doména hraje inhibiční roli v regulaci Kit • vazba ligandu na Kit vede nejdříve k transfosforylaci tyrozinových zbytků na JMD; tím se uvolní vazba JM domény a N-terminální domény, dojde k fosforylaci aktivační domény a následné aktivaci celého receptoru • proto mutace v JM doméně odstraňující její funkci mají za následek částečnou konstitutivní aktivaci receptoru Kit Mutace genu c-kit • GISTs se vyvíjejí z mezenchymálních buněk spodního gastrointestinálního traktu: zajišťují peristaltické kontrakce hladkého svalstva; inaktivující mutace kit v těchto buňkách má skutečně za následek jejich úplnou nefunkci (myší modely) • aktivující mutace c-kit nalezeny téměř ve všech gastrointestinálních stromálních nádorech, vyskytují se také u leukémií; často se jedná o bodové mutace JM domény, někdy o delece celé JM domény; GISTs s bodovými mutacemi mají lepší prognózu než nádory s delecí celé JM domény Familiální gastrointestinální stromální nádory (GISTs) • familiální GISTs spojeny s mutacemi c-kit v zárodečné linii • spektrum zárodečných mutací c-kit je stejné jako u somatických mutací souvisejících se sporadickými GISTs • gen lokalizován v lokusu 4q11-12 • příklad japonské rodiny s mutací kit v zárodečné linii • delece 1 AA v JM doméně • fenotypická exprese této mutace se objevovala poměrně v pozdním věku, proto se také mohla udržet po 4 generace Signální dráhy aktivované RTK Signální dráhy aktivované RTK Proteiny Ras ras/Ras - první identifikovaný onkogen/onkoprotein Proteiny Ras ras/Ras - první identifikovaný onkogen/onkoprotein Původní představa o funkci Ras: zprostředkovává vazbu Raf-1 k cytoplazmatické membráně a spoluaktivuje Raf-1 Dnešní znalosti ukazují: • Aktivace Raf-1 je komplexní mnohostupňový proces. I přímé interakce mezi Ras a Raf-1 zahrnují několik vazebných míst na molekule Ras a nejméně dvě vazebná místa na Raf-1. • Raf-1 není jediným substrátem („downstream“ efektorem) proteinů Ras. Ras aktivuje řadu různých efektorů, které přenášejí signál různými drahami. • Nadrodina Ras má nejméně 35/65 různých členů (RAW/2000). Všechny proteiny mají homologii s Ras, ale liší se signálními vlastnostmi. Proteiny Ras Přenos signálu z RTK receptoru na Ras • I samotný přenos signálu z RTK receptoru na protein Ras je komplikovanější než se původně soudilo. • Fosforylované zbytky RTK jsou vazebným místem pro proteiny s SH2-doménami (GRB2). Tyto proteiny jsou fosforylovány a signál potom přenášejí dále prostřednictvím proteinů Ras. Weinberg RA. The Biology of Cancer. Garland Science 2007 Proteiny rodiny Ras Nadrodina Ras má nejméně 35 / 65 členů: Rodiny: Ras, Rho, Rab, Ran, Rad, Arf Rodina Ras má podrodiny: Rap, Ral, R-Ras, Rheb, H-Ras, Ras  společně se nazývají malé G proteiny Proteiny H-Ras, N-Ras a K-Ras4A a K-Ras4B mají 188/189 aminokyselin (p21Ras). Jsou lokalizovány na vnitřní straně cytoplazmatické membrány, kde fungují jako přepínače při přenosu extracelulárních signálů do cytoplazmy. Proteiny Ras mají GTPázovou aktivitu: jsou inaktivní, váže-li se na ně GDP, a aktivní, váže-li se na ně GTP. Vlastní schopnost proteinů Ras vyměňovat GTP/GDP a hydrolyzovat GTP je nízká, proto účast dvou typů proteinů: • GEFs: faktory vyměňující guaninový nukleotid, které posilují tvorbu aktivního GTP vázajícího proteinu Ras (např. SOS1/2, RasGRF/mCDC25,...) • GAPs: proteiny aktivující GTPázu, které posilují tvorbu inaktivního stavu (p120 GAP, NF1/neurofibromin,...) Proteiny Ras GTPázový cyklus proteinu Ras GEF GAP GEFs posilují tvorbu aktivního Ras, který váže GTP GAPs aktivují GTPázu, posilují tvorbu inaktivního stavu Ras, který váže GDP Posttranslační modifikace: Interakce s vnitřní stranou cytoplazmatické membrány (bez této vazby je Ras neaktivní) je zajištěna posttranslačními modifikacemi CAAX motivu na C-konci: • Cys186 motivu CAAX je farnezylován • proteolyticky je odstraněna sekvence AAX • terminální Cys186 je karboxymetylován - takto vzniká protein s hydrofobnějším charakterem, s větší afinitou k cytoplazmatické membráně; stabilní vazbu k membráně zajišťuje: • vazba palmitoylové skupiny na Cys v hypervariabilní oblasti na C-konci Pro onkogenní vlastnosti Ras je klíčová farnezylace! Proteiny Ras Vsuvka: Prenylace • Prenylace – kovalentní modifikace proteinů izoprenoidy – intermediáty biosyntézy cholesterolu – na thio skupinu zbytku cysteinu na C konci proteinů v motivu CAAX (FT a GGTI) nebo CXC (GGTII) • Izopren - nenasycený uhlovodík s 5 atomy uhlíku a jedním metylovým rozvětvením Vsuvka: Prenylace farnezylace – připojení farnezylu (15 C) geranylgeranylace – připojení geranylgeranylu (20 C) • Katalyzováno 3 prenyltransferázami: farnezyltransferázou (FT), geranylgeranyltransferázou I a II (GGTI a GGTII). • V lidském proteomu je odhadem 300 proteinů s cysteinem na C konci, ale kolik je jich skutečně prenylováno, se zatím neví. • Potvrzeno - farnezylovány: H-, K- a N-Ras, jaderná lamina, CENPE (kinetochory); geranylgeranylovány: Rho A a C, Rac1, cdc-42; RhoB – farnezylován i geranylgeranylován; K-Ras – geranylgeranylován, pokud je FT inhibována Proteiny Ras Posttranslační modifikace: Interakce s vnitřní stranou cytoplazmatické membrány (bez této vazby je Ras neaktivní) je zajištěna posttranslačními modifikacemi CAAX motivu na C-konci: • Cys186 motivu CAAX je farnezylován • proteolyticky je odstraněna sekvence AAX • terminální Cys186 je karboxymetylován - takto vzniká protein s hydrofobnějším charakterem, s větší afinitou k cytoplazmatické membráně; stabilní vazbu k membráně zajišťuje: • vazba palmitoylové skupiny na Cys v hypervariabilní oblasti na C-konci Pro onkogenní vlastnosti Ras je klíčová farnezylace! Struktura proteinů Ras • Heterogenní doména: proteiny Ras jsou vysoce homologní v prvních 164 AA, 25 AA na C-konci je variabilních • Efektorová doména (AA 32-40) zajišťuje vazbu k efektorovým molekulám • Switch I (30-38) je hlavním vazebným místem pro GAPs • Switch II (60-76) zajišťuje vazbu na GEFs Onkogenní aktivace Ras Přítomnost onkogenní mutace Ras detekována téměř u 35% nádorů. • mutace H-ras hlavně u nádorů kůže a dlaždicobuněčných nádorů hlavy a krku • mutace K-ras hlavně u adenokarcinomů, kolorektálních nádorů a nádorů pankreatu • mutace N-ras jsou časté u hematopoietických malignit, hlavně u AML a MDS Onkogenní mutace posilují aktivitu Ras: • v kodonech: 12, 13, 59, 61, 63 - vzniklé proteiny mají poškozenou GTPázovou aktivitu a jsou rezistentní k působení GAP proteinů • v kodonech 16, 19, 116, 117, 119, 144, 146 - vzniklé proteiny mají usnadněnou výměnu GDP/GTP • u některých nádorů je zvýšená exprese Ras Onkogenní aktivace Ras 1982: identifikována mutace ras v kodonu 12 (simultánně ve 3 laboratořích!). Byla to první nalezená bodová mutace kauzální v neoplastickém vývoji. Weinberg RA. The Biology of Cancer. Garland Science 2007 Glycin v poloze 12 a glutamin v poloze 61 jsou klíčové pro správnou interakci proteinu Ras s GTP. To vysvětluje proč právě kodony kódující tyto aminokyseliny jsou nejčastěji u nádorů mutovány. Onkogenní aktivace Ras Weinberg RA. The Biology of Cancer. Garland Science 2007 Inhibice proteinů Ras Pro onkogenní vlastnosti Ras je klíčová farnezylace! Inhibitory farnezyl transferázy (FTIs): (např. peptidy typu CAAX - dobře pronikají do buněk, jsou specifické a účinné, málo cytotoxické) • Inhibují farnezylaci Ras a blokují tak jeho posttranslační modifikace a jeho aktivitu. • Jsou tak potenciálními protinádorovými činidly. • Nevýhodou je, že proteiny Ras mají v buňce mnohočetné funkce a FTIs blokují všechny tyto funkce (malá specifita účinku). Dále, Ras mohou být vedle farnezylace také geranylgeranylovány (a FTIs neblokují geranylgeranyltransferázy). • Proteiny Ras nejsou jediné cíle FTIs (Rho). Inhibitory FT (FTIs) V klinických testech testováno alespoň šest inhibitorů: 1. BMS-214662 (Bristol-Myers Squibb, Princeton, NJ) 2. L778123 (Merck and Co., Inc., Whitehouse Station, NJ) 3. lonafarnib (experimentální název SCH66336; Sarasar™; Schering-Plough Corporation, Kenilworth, NJ) 4. FTI-277 (Calbiochem, EMD Bio-Sciences, San Diego) 5. L744832 (Biomol International L.P., Plymouth Meeting, PA) 6. tipifarnib (experimentální název R115777; Zarnestra®; Ortho Biotech Products, L.P., Bridgewater, NJ); nejpokročilejší testování Lonafarnib: inhibitor FT • syntetický tricyklický derivát karboxamidu s protinádorovými vlastnostmi • primárně určeno pro léčbu nádorů (klinické studie) • jako součást koktejlu lonafarnibu a dalších dvou léků prokázal pozitivní účinek u pacientů s progerií Tipifarnib: inhibitor FT • klinické studie: podání Tipifarnibu pacientům s AML nad 65 let – nepovoleno FDA, neosvědčilo se (2005) • dále testováno u pacientek s karcinomem prsu, u pacientů s neurofibromatózou Inhibitory FT (FTIs) • zatím se jako protinádorová léčba příliš neosvědčily • vedlejší účinky • zpochybněno, zda jejich efekt je primárně přes inhibici Ras • … Proteiny Ras mají mnoho efektorů Ras aktivuje tři klíčové efektorové dráhy 1. Dráha Raf-1 (aktivace genů stimulujících růst, růst nezávislý na přichycení, ztráta kontaktní inhibice) 2. Dráha PI3K (antiapoptotický efekt) 3. Dráha Ral (potencující invazivitu a metastatický potenciál buněk) 1. Ras  Raf-1 Raf-1 • Raf-1: je volně v cytosolu, ale silně přitahován aktivním Ras – tak je přiváděn k membráně a aktivován. • Aktivovaný Raf-1 stimuluje MEK („MAP-kinase extracellular signalregulated kinase“) fosforylací na serinu. • Aktivovaná MEK je duální kináza: fosforyluje na tyrozinu i serinu/threoninu své cílové molekuly. Mezi nimi MAP kinázy p44 ERK1 a p42 ERK2 („extracellular signal-regulated kinases“). • ERKs mají mnoho substrátů mezi cytoplazmatickými (Rsk, SOS, MEK,...) a po translokaci do jádra také mezi jadernými (Ets, Elk-1, SAP-1,...) proteiny, včetně proteinů ovlivňujících strukturu chromatinu. Mezi cílové TFs této dráhy patří také Jun a Fos. • asi 60-70% melanomů má „namísto“ mutace ras mutaci B-raf BRAF • gen BRAF je lokalizovaný na chromozomu 7 v oblasti 7q34 • skládá se z 18 exonů, délka přepisované mRNA je 2478 bp • mutace genu BRAF asociovány s řadou nádorů: kolorektální karcinom, maligní melanom, nehodgkinské lymfomy, thyroidní papilární karcinom, nemalobuněčný karcinom plic a adenokarcinom plic • 80% mutací je způsobeno transverzí T1799A, která vede k aminokyselinové záměně V600E • Mutace V600E propůjčuje buňkám transformační aktivitu, protože simuluje fosforylaci na T599 a/nebo S602 v aktivační doméně proteinu BRAF. Díky tomu zůstává protein BRAF permanentně v aktivním stavu, bez ohledu na signalizaci RAS. Krajsová I. Dabrafenib v léčbě metastazujícího melanomu. Remedia 24 (3): 215-219, 2013 RASopatie • RAS/MAPK Syndromes • skupina neuro-kardio-facio-kutánních syndromů (NCFC) • specifická skupina vývojových vad vyvolaných zárodečnými mutacemi genů, které kódují proteiny participující v signální kaskádě RAS/MAPK • podobné příznaky - např. kožní příznaky, vady obličeje, opožděný růst, mentální retardace, srdeční vady, zvýšené riziko nádorového onemocnění • syndrom Noonanové, neurofibromatóza typu 1, Legiův syndrom, Costello syndrom a další • přestože každé z těchto onemocnění má své typické klinické příznaky, existuje zde celá řada fenotypově se překrývajících příznaků, které značně komplikují možnost správné diagnostiky a tím i účinné léčby • jako celek tvoří RASopatie jednu z největších skupin malformačních syndromů postihujících přibližně 1 z 1000 jedinců RASopatie • somatické mutace v RAS/MAPK dráze často vedou ke vzniku nádorových onemocnění, proto se předpokládalo, že i RASopatie budou spojeny s větším výskytem malignit: riziko jen asi 3,5x větší než u běžné populace; nejčastěji se jedná o hematologické malignity • přestože některé aktivační somatické mutace jsou shodné s mutacemi zárodečnými, mutace způsobující RASopatie obvykle nebývají tolik aktivující: například velmi častá onkogenní mutace v genu BRAF (V600E) se u kardio-facio-kutánního syndromu, pro který jsou mutace v BRAF typické, nenachází  předpokládá se, že silně aktivační onkogenní mutace nejsou v zárodečném stavu slučitelné se životem Svobodová E. Molekulární diagnostika syndromu Noonanové a přidružených RASopatií pomocí NGS. DP PřF, 2018 Svobodová E. Molekulární diagnostika syndromu Noonanové a přidružených RASopatií pomocí NGS. DP PřF, 2018 RASopatie: přehled syndromů Mutace protoonkogenů v zárodečné linii ?! Proč tolerováno??  exprese omezena na úzce vymezené typy tkání (RET, c-kit)  exprese daných protoonkogenů se během organogeneze objevuje natolik pozdě, že umožňuje normální vývoj embrya (c-met)  „jen mírně“ aktivující mutace (rasopatie, c-kit)  specifické typy mutací (cdk 4) 2. Ras  PI3K PI3K Fosfatidyl inozitol 3 – kináza - lipid kináza  složena ze dvou podjednotek: regulační p85 a katalytické p110  katalyzuje fosforylaci fosfatidyl-inozitolu v pozici D-3, a tak produkuje fosfolipidový sekundární „messenger“(PIP2  PIP3) nutný k aktivaci následných („downstream“) efektorů PI3K a PIP3 • Hladina PIP3 je přísně regulovaná. PIP3 vzniká účinkem PI3K a je zpět konvertován na PIP2 účinkem fosfatáz: PTEN, SHIP1, SHIP2 • PTEN = PIP3 lipid fosfatáza; nádorový supresor (v nádorech prsu a glioblastomech; Cowdenův syndrom) • PI3K může být aktivována prostřednictvím např. PDGF, NGF, IGF-1, interleukinu-3, přes integriny… • PI3K vytvoří PIP3 a na PIP3 se váže kináza Akt • tím je Akt vázána na membránu, fosforylována a tím aktivována  Dva mechanismy vedoucí k hyperaktivitě Akt: 1. aktivace PI3K 2. inaktivace PTEN AKT/PKB • Popsán virový onkogen v-akt, konstitutivně aktivovaná forma. • Jedna z nejčastěji aktivovaných proteinkináz u nádorů. • Hyperaktivace Akt je spojena s (1) rezistencí k apoptóze, (2) zvýšenou buněčnou proliferací a (3) růstem buněk, (4) se stimulací pohybu buněk. • Serin/threoninové kinázy z rodiny protein kinázy B (savčí buňky exprimují 3 vysoce homologní (80%) izoformy Akt kódované 3 odlišnými geny - AKT1, AKT2 a AKT3, někdy PKB, PKB a PKB). AKT po aktivaci • Může fosforylovat více než 9000 proteinů. • Indukuje antiapoptotické signály, zabraňuje uvolnění cytochromu C z mitochondrií, inaktivuje faktory (TF forkhead) indukující např. FasL, inaktivuje pro-apoptotický faktor Bad a prokaspázu-9 • Aktivuje buněčný cyklus: reguluje stabilizaci cyklinu D, blokuje transport p21WAF1 do jádra a transport p27KIP1 do jádra. • Stimuluje aktivitu telomerázy aktivací TERT. • Indukuje translokaci MDM2 do jádra (a tím k degradaci p53). • Inaktivuje GSK3, což vede ke zvýšení hladiny volného -kateninu. • Inaktivuje TSC2 („tuberous sclerosis complex 2“), který jinak inhibuje mTOR. mTOR je spojen s navýšeným buněčným růstem. • AKT často zásadním způsobem mění jejich subcelulární lokalizaci  reguluje kompartmentalizaci svých substrátových molekul. AKT po aktivaci AKT reguluje kompartmentalizaci svých substrátů • amplifikace a zvýšená exprese AKT2 u 10-20% nádorů vaječníků a pankreatů, zvýšená aktivita AKT2 u 40% nádorů vaječníků • amplifikace AKT1 popsána u nádorů žaludku • zvýšená aktivita AKT1 u nádorů prostaty, nádorů prsu - spojeno s horší prognózou (zvýšení aktivity AKT může být u nádorů prsu v důsledku amplifikace HER2/neu) • inaktivující mutace nebo delece PTEN (karcinomy prostaty a endometria, glioblastomy, melanomy) • amplifikace nebo zvýšená exprese katalytické podjednotky p110 PI3K • aktivující mutace ras (asi 1/3 všech epiteliálních nádorů) • zvýšená aktivita TPK receptoru, hlavně ErbB2/ErbB3 (na ErbB3 je „docking“ místo pro PI3K). AKT v kancerogenezi Změny dráhy PI3K u lidských nádorů 3. Ras  Ral • Třetí ze tří hlavních efektorových drah Ras zahrnuje Ral A a Ral B. Patří do rodiny Ras a mají 58% homologii s Ras. • Komunikace Ral a Ras je přes GEF proteinu Ral: tento Ral-GEF má vazebné místo pro aktivovaný Ras. V důsledku vazby aktivovaného Ras na Ral-GEF dojde: a) k lokalizaci Ral-GEF k vnitřní straně cytoplazmatické membrány b) ke konformační změně Ral-GEF  k aktivaci GEF aktivity  k aktivaci Ral-A a Ral-B • Aktivované Ral-A a Ral-B pak aktivují své substrátové molekuly. • Zatím ne zcela jasným mechanismem je v důsledku aktivace této dráhy stimulována invazivita a metastatický potenciál buněk. 3. Ras  Ral Efektorové dráhy Ras Popsáno alespoň 8 dalších efektorových drah kromě tří podrobněji zmíněných. Celkově je signalizace (nejenom) kolem Ras mnohem komplexnější (signální sítě spíše než dráhy).