Molekulární a buněčná biologie nádorů Prof. RNDr. Jana Šmardová, CSc. Ústav experimentální biologie Přírodovědecká fakulta MU Brno 2020 Bi9910 pondělí 16.00 – 18.00 A11 – č. 305 3. Mitogenní signalizace II Molekulární a buněčná biologie nádorů 2020 Bi9910 pondělí 16.00 – 18.00 A11 – č. 305 Další typy receptorů • Tyrozin-proteinkinázové receptory • Receptory pracující s Janusovými kinázami • TGF-β receptory • „Serpentinové“ receptory - GPCRs - Frizzled (Wnt-1/β-katenin) - Patched • Notch • Integriny • NF-κB Rodina TGF- TGF- („transforming growth factor“) - alespoň 30 různých faktorů TGF u člověka - na většinu buněk působí inhibičně: inhibuje růst normálních epiteliálních, endoteliálních, neuronálních, lymfoidních a hematopoietických buněk - spíše potencuje invazivní vlastnosti již transformovaných, nádorových buněk odvozených z těchto tkání - indukuje apoptózu u některých nádorových buněk - představuje antimitogenní signalizaci, má charakter nádorového supresoru! - inaktivován somatickými mutacemi nebo delecemi genu, především u kolorektálních nádorů a nádorů žaludku TGF- receptory • TGF-βR (typu I a II) fungují jako heterodimery. • Jejich kinázová doména fosforyluje serin a threonin. Po vazbě ligandu je podjednotka TGF-βRII (s konstitutivně aktivní Ser/Thr kinázou) přivedena do blízkosti podjednotky TGF-βRI, která je fosforylována, tj. aktivována. Ta následně fosforyluje cytosolické proteiny, které migrují do jádra. Weinberg RA. The Biology of Cancer. Garland Science 2007 Signální dráha TGF- Vazba TGF- k příslušnému receptoru vede k fosforylaci SMAD2 a/nebo SMAD3, ty potom tvoří komplex se SMAD4 a tento komplex migruje do jádra, kde ve spolupráci s dalšími TF spouští transkripci TGF-cílových genů (např. p21CIP1, p15INK4B, a další). Weinberg RA. The Biology of Cancer. Garland Science 2007 Dráha TGF- a nádory Vyřazení dráhy TGF-β je pro nádorové buňky velmi významné. • U karcinomů střeva jsou časté mutace smad2. • Asi u 50% karcinomů slinivky a 25% karcinomů střeva je inaktivní Smad4. • Většina karcinomů střeva s mikrosatelitovou nestabilitou má mutaci inaktivující TGF-βII receptor. Serpentinové receptory Mají typickou strukturu se sedmi hydrofóbními membránovými doménami: prostupují 7x cytoplazmatickou membránu. Patří k nim: • receptory spřažené s G-proteiny • Frizzled • Patched Receptory spřažené s G-proteiny (GPCRs) • GPCRs tvoří vůbec největší skupinu povrchových receptorů (více než 1000 v savčím genomu – představují téměř 5% genů v lidském genomu!). • Jsou aktivovány vazbou ligandu. • Jako ligandy fungují pro GPCRs nejrůznější extrabuněčné molekuly: růstové faktory, hormony (serotonin, epinefrin, glukagon, tyrotropin,...), fosfolipidy, neurotransmitery, a další. Aktivace GPCRs Disociovaná podjednotka α-GTP aktivuje řadu cytoplazmatických enzymů: • adenylátcyklázu (ATP  cAMP) • fosfolipázu C-β (štěpí PIP2) • Src Komplexy podjednotek β+γ zřejmě stimulují PI3K, Src.  GPCRs mohou signalizovat mitogenně; mohou se podílet na vývoji nádorů. Signální dráhy GPCR Přes G proteiny je signál přenášen na dráhy, které řídí proliferaci, diferenciaci a apoptózu. Signální dráhy: Wnt/-katenin Sonic hedgehog/Gli NOTCH • hrají úlohu v rozhodování o osudu buněk, při ustavení tkáňově specifických kmenových buněk a jejich regulaci v dospělých tkáních • jsou důležité i v kontextu lidských nádorů Pro většinu buněk je kaskáda RTK  Ras dominantní při zprostředkování odpovědi na mitogenní signály. Ale není jediná. Signální dráha Wnt/-katenin -kateniny hrají v buňkách dvě odlišné role a obě tyto role se mohou podílet na kancerogenezi; nachází se ve třech různých stavech: 1. Molekuly -kateninu jsou strukturní součástí cytoskeletonu a adhezivních komplexů (zprostředkovávají vztah mezi kadheriny a aktinovými složkami cytoskeletonu). Ztráta/změna buněčné adheze se uplatňuje při metastázování nádoru. Signální dráha Wnt/-katenin 2A. Volný -katenin se nachází v cytoplazmě (životnost asi 20 minut), funguje jako signální molekula dráhy Wnt/-katenin. Může být transportován do jádra (2B.), kde je součástí transkripčního faktoru, účastnícího se regulace transkripce. Transkripce genů zprostředkovaná kateniny může zapnout geny nutné k buněčné proliferaci nebo geny s antiapoptotickou funkcí. Regulace -kateninů  Hladina volného -kateninu je udržována pomocí tzv. destrukčního komplexu. Ten je tvořen proteiny: GSK-3, Axin a APC. Axin a APC fungují jako“lešení“ destrukčního komplexu a podmiňují jeho fungování, obsahují vazebná místa pro všechny jeho součásti. GSK-3 serin/threoninová kináza, která fosforyluje -katenin (S33, S37, T47 a S45). Tato fosforylace funguje jako signál k následné ubikvitinaci a degradaci -kateninu. Regulace -kateninů  Aktivace dráhy Wnt/-katenin - tj. vazba glykoproteinu Wnt* na příslušný receptor Frizzled vede k aktivaci proteinu Dsh (disheveled), který interaguje s destrukčním komplexem a blokuje aktivitu GSK-3β. Tím je znemožněna fosforylace -kateninu, jeho „lifetime“ vzroste na 1-2 hodiny a příslušně se zvýší hladina volného -kateninu.  Ten je transportován do jádra a spolu s proteiny Tcf („T cell factor“) a Lef („lymphoid enhancer factor“) vytvoří multiproteinový TF a aktivují transkripci svých cílových genů. * Ligandy Wnt jsou v extrabuněčném prostoru, ale jsou pomocí lipidové složky pevně vázané k buněčné membráně. Nemohou volně difundovat. Regulace -kateninů  K cílovým genům -kateninu/Tcf/Lef patří např. c-myc a gen pro cyklin D1 (CCND1), což vede ke zvýšení buněčné proliferace.  Signální dráha Wnt/-katenin se uplatňuje během vývoje, při řízení buněčného cyklu (fluktuace -kateninu během cyklu). Signální dráha Wnt/-katenin Přebytek volného -kateninu je degradován, což je zprostředkováno destrukčním komplexem. Fodde R et al, Nat Rev Cancer 1: 55-66, 2001 Signální dráha Wnt/-katenin • Smyslem dráhy Wnt/β-katenin je udržování adekvátní hladiny volného β- kateninu. • Klíčová je aktivita kinázy GSK-3β. Weinberg RA. The Biology of Cancer. Garland Science 2007 Signální dráha Wnt/-katenin • Mezi substráty GSK-3β patří také cyklin D1. GSK-3β fosforyluje cyklin D1 a určuje ho k degradaci.  Dráha Wnt/β-katenin ovlivňuje hladinu cyklinu D1 na dvou úrovních: transkripčně (přes β-katenin) a posttranslačně (přes GSK-3β).  Wnt není pouze morfogenem, ale také mitogenem.  Zdá se, že dva „pooly“ β-kateninu (1. ve vazbě s E-kadherinem, 2. volný cytoplazmatický) jsou regulovány separovaně. Např. ztráta E-kadherinu nemá v buňce za následek navýšení volného β-kateninu. Signální dráha Wnt/-katenin a nádory • Zvýšená exprese Wnt-1 se podílí na vzniku nádorů prsu. • Mutace APC znemožňující vazbu APC na -katenin nebo vazbu APC na axin způsobují konstitutivní aktivaci -kateninu. • Mutace APC patří k nejčasnějším genetickým změnám při vývoji kolorektálního karcinomu (plus vrozené mutace), dávají buňkám růstovou výhodu. • Mutace axinu, které znemožňují vazbu axinu na -katenin, byly nalezeny u některých hepatocelulárních nádorů. • Mutace -kateninu buď odstraňují serin nebo mění serin na jinou aminokyselinu, což znemožňuje fosforylaci GSK-3β a odbourávání -kateninu. Např. v nádorech prostaty, jater střeva, dělohy, vaječníků, melanomů. • Mutace -kateninu se vyskytují i u kolorektálního nádoru, obvykle ne zároveň s mutacemi APC (princip exkluzivity). Regulace -kateninů Siah-1 Později popsán další nezávislý mechanismus odbourávání kateninu: zprostředkovaný proteinem Siah-1. • Tato dráha může odbourávat i onkogenní formy -kateninu, které nejsou odbourávány Wnt signalizací. • Tato dráha je také závislá na funkčním APC. • !! Většina mutací APC jsou delece té části molekuly, která odpovídá za vazbu axinu a Siah-1 !! • Tato dráha funkčně spojuje p53 a -katenin: aktivace p53 zvyšuje expresi Siah-1 (overexprese p53 způsobuje downregulaci kateninu). Dysregulace -kateninu není ale klíčový důsledek inaktivace p53. Signální dráha Hedgehog/Patched/Gli Hedgehog proteiny jsou sekretované glykoproteiny, které ovlivňují membránové receptory, které přenášejí signál na transkripční faktory Gli. SHH (Sonic hedgehog) inhibuje receptor Patched (Ptc - nádorový supresor), který normálně inhibuje receptorový komplex Smoothened (Smo - onkogen). Inhibice Ptc tedy aktivuje Smo, což vede k aktivaci TF Gli. Po většinu času je dráha SHH/Gli neaktivní, pouze ve specifickém čase na specifickém místě je dráha aktivována. U savců 3 typy Hedgehog proteinů: Sonic (SHH), Desert, Indian. Signální dráha Patched Aktivní, z vazby na Patched uvolněný Smoothened chrání Gli před proteolytickým štěpením. Kompletní Gli je transportován do jádra, kde následně funguje jako transkripční aktivátor. Gli poprvé objeveny jako proteiny vysoce exprimované u glioblastomů. Ve vysokých hladinách fungují jako onkoproteiny. Transkripční faktory Gli • Gli jsou velké (asi 1000 AA) multifunkční TF. • Lokalizovány v jádře i cytoplazmě. • V nepřítomnosti SHH jsou Gli štěpeny proteazomem a Ckarboxylová zkrácená forma je translokována do jádra, kde funguje jako transkripční dominantní represor. • V přítomnosti SHH signálu, tedy aktivního Smoothened, je tvorba represoru inhibována a protein o plné délce funguje jako aktivátor. • Gli1, 2 a 3 – liší se svým chováním; jsou částečně redundantní, částečně fungují specificky a zřejmě fungují kombinatoriálně a v závislosti na kontextu. Hedgehog/Patched/Gli a nádory Ztráta funkce (inaktivace) SHH-Gli vede k vývojovým defektům včetně holoprozencefalie. Nefyziologická aktivace dráhy může vést k vývoji nádorů, a to sporadických a také familiálních. • 40% sporadických basocelulárních karcinomů (většinou benigní nádory) má mutace PTCH nebo SMO. Mutace PTCH také u meduloblastomů, meningiomů, karcinomu prsu a jícnu. • U nádorů jícnu, žaludku, žlučovodů, pankreatu je častá vysoká hladina receptoru Patched a ligandů (Sonic Hedgehog, Indian Hedgehog). Důsledkem jsou vysoké hladiny Gli v jádrech buněk. (Anti-hedgehog protilátky tlumily u těchto nádorů proliferaci a stimulovaly apoptózu.) Vsuvka: Holoprozencefalie • SHH funguje během vývoje jako vývojový morfogen: parakrinní signály s krátkým dosahem působení, které řídí vypínání a zapínání genů a vyvolávají četné odpovědi v závislosti na hladině podél koncentračního gradientu. • Difúze proteinu SHH vytváří gradient, ve kterém různé koncentrace proteinu přimějí okolní buňky přijmout různé predestinace. • Mutace inaktivující SHH vedou k vývoji holoprozencefalie (dominantní dědičnost – stačí 50% snížení exprese genu) – porucha vývoje střední části obličeje a předního mozku, vedoucí až k rozštěpu patra, hypotelorismu a absenci struktur předního mozku. • Velmi variabilní expresivita: od velmi lehkých projevů (jediný centrální řezák) – pravděpodobně modifikátorové geny. Vsuvka: Holoprozencefalie Variabilní expresivita mutace genu SHH: matka a její dcera: A: dcera težce postižena mikrocefálií, hypotelorismem a rozštěpem patra B: matka – pouze jeden centrální řezák Signální dráha Notch • Hraje klíčovou roli ve vývoji embryonální vaskulatury a v angiogenezi. • 1919 – popsány „notches“ – vroubky/zářezy na křídlech Drosophily. • notch kóduje transmembránový protein – receptor Notch. V savčích buňkách existují 4 různé varianty kódované 4 různými geny. • Jako ligand fungují Notch L, Delta, Jagged1, Jagged2. • Signál začíná interakcí proteinů Notch L a Notch sousedních buněk (endoteliální b. – nádorová b. – stromální b.  nádor je komplexní tkáň). Signální dráha Notch • Po vazbě ligandu (Notch L, Delta, Jagged) dojde ke dvěma proteolytickým štěpením receptoru Notch: 1x v extracelulární doméně, 1x v transmembránové doméně. * • Tím je uvolněn cytoplazmatický fragment z ukotvení v membráně a migruje do jádra, kde spolu s partnerskými proteiny funguje jako transkripční faktor. Receptory Notch * receptory Notch fungují zcela jinak než např. RTK: • vždy po vazbě ligandu dojde k ireverzibilní přeměně receptoru (proteolytickým štěpěním)  každá receptorová molekula signalizuje pouze 1x • receptory Notch nemohou amplifikovat signál jako např. RTK Signální dráha NOTCH Signál začíná interakcí proteinů Notch L a Notch sousedních buněk (např. endoteliální buňka – nádorová buňka – stromální buňka).  nádor je komplexní tkáň Signální dráha Notch a nádory • U většiny karcinomů čípku a menšího podílu karcinomů střeva a dlaždicobuněčných karcinomů plic je zvýšená exprese proteinu Notch. Ta spojena s jadernou lokalizací tohoto proteinu. • Zvýšená exprese ligandu (Notch L, Jagged a Delta) detekována u karcinomů čípku a prostaty. • 10% ALL má konstitutivně aktivní Notch, a to v důsledku delece té části genu NOTCH-1, který kóduje extracelulární doménu receptoru. Integrinové receptory Integriny jsou povrchové receptory, které zprostředkovávají (1) buněčnou adhezi k extracelulární matrix a k ostatním buňkám. Zprostředkovávají ale také (2) signalizaci týkající se buněčné proliferace a přežívání. Jsou to heterodimery nekovalentně asociovaných podjednotek alfa a beta. Popsáno 18 podjednotek alfa a 8 podjednotek beta, tvoří 24 různých heterodimerů s různou specifitou. Tvořeny velkou extracelulární doménou (vazba ligandu), krátkou transmembránovou doménou a různě dlouhou cytoplazmatickou C-koncovou doménou. Co umí integriny Buňka neustále monitoruje své úspěšné přichycení na složky ECM (anoikis). Následně jsou do cytoplazmy uvolňovány signály přežití, což snižuje pravděpodobnost indukce apoptózy. • fyzicky interagovat s ECM • ovlivňovat uspořádání cytoskeletonu • signalizovat dovnitř buňky • signalizovat zevnitř buňky ven: o přichycení na jiné složky ECM • umožňují pohyb buňky postupnou tvorbou a rušením vazeb na ECM Integrinové receptory • Klíčová pro funkci integrinů je jejich schopnost aktivovat FAK „focal adhesion kinase“. • Integriny mohou tvořit klastry a tvořit tzv. fokální adheze. Ty aktivují FAK. • FAK se uplatňuje především při signalizaci související s regulací buněčné adheze, s pohybem buněk a jejich migrací. Signalizace integriny FAK (nereceptorová tyrozinkináza) je asociována s β podjednotkou integrinu. FAK je aktivována fosforylací (po vzniku fokálních adhezí) a stává se vazebným místem pro Src. Src dále fosforyluje FAK a následně jsou aktivovány další substráty včetně Ras (Erk) a PI3K. ECM  integriny  Sos  Ras  Erk Pochopení funkčního propojení těchto signálních drah pomohlo vysvětlit významný buněčně biologický efekt onkoproteinu Ras: jeho schopnost umožnit buňce přežití a růst bez jejího ukotvení. Normálně přežití buňky závisí na signalizaci integrinů směrem k Ras. Bez této signalizace buňka věří, že se jí nepodařilo ukotvení k ECM, což blokuje proliferaci nebo dokonce indukuje apoptózu (anoikis). Onkogenní aktivace Ras tak mimikuje stav, kdy buňka dostává informace o úspěšném ukotvení na ECM – i bez tohoto ukotvení. Zdá se, že právě schopnost vyhnout se anoikis stojí na počátku vývoje některých nádorů, např. nádorů prsu. Signální dráha NF-κB • První signál svědčící o významu dráhy NF-κB pro kancerogenezi: objevení onkogenu v-rel u akutně transformujících virů krůty způsobujících retikuloendoteliozu (lymfom B-buněk). • Rel patří do rodiny faktorů NF-κB, které tvoří homodimery a heterodimery v cytoplazmě. Nejčastější je dimer p65-p50. • Dimery jsou v cytoplazmě udržovány proteinem IκB. Tím je celá dráha udržována ve stavu klidu. • Jako odpověď na různé signály je IκB fosforylován a následně degradován (~ β-katenin) a NF-κB uvolněn a translokován do jádra. Tam aktivuje expresi asi 150 cílových genů. • Kináza fosforylující IκB (IKK) je stimulována např. TNF-α, interleukinem-1β, lipopolysacharidy, reaktivním kyslíkem (ROS), protinádorovými terapeutiky,… Signální dráha NF-κB Cílové geny NF-κB: • Antiapoptotické: např. bcl-2, IAP- 1, IAP-2 a další. • Pro-proliferační: např. myc, cyklin D1 a další. • Klíčová úloha NF-κB při regulaci zánětu! • Antagonista p53! Dráha NF-κB a nádory • U nádorů jsou mutace jednotlivých složek dráhy NF-κB velmi vzácné, ale častá je konstitutivní aktivace dráhy – např. u nádorů prsu. Největší význam má tato dráha u nádorů lymfocytů: • asi u 1/4 DLBCL amplifikován gen REL, což vede asi ke 4x až 35x navýšené hladině proteinu Rel • translokace zahrnující gen NFKB2 je častá u B- a Tbuněčných lymfomů a myelomů (nádory buněk produkujících protilátky) Signální sítě… Signální sítě… cytoplazmatický přenašeč transkripční faktor Protoonkoprotein Src - pp60c-src • První popsaný buněčný analog virového onkoproteinu v-Src, obsaženého ve viru Rousova sarkomu (1909 - Peyton Rous) - pp60v-src. Jeden z prvních objevených protoonkogenů, ale až v roce 1999 (tedy po více než 25 letech!) nalezeny mutantní varianty (asi u 12% pokročilých CRC) • Nereceptorová (cytoplazmatická) tyrozinová proteinkináza, přenašeč signálu. • Účastní se řízení řady buněčných procesů jako proliferace, diferenciace, pohyb, adheze. • Normálně je v inaktivním stavu, může být přechodně aktivován, např. během mitózy. • Je asociován s buněčnými membránami, především s plazmatickou membránou a endozomální membránou. • Rodina Src má mnoho členů: Fyn, Yes, Lck, Hck, Blk, Fgr, Lyn, Yrk. Objev protoonkogenu c-src • 1979: J. Michael Bishop a Harold E. Varmus objevili, že kuřata mají gen, který je strukturně blízce příbuzný onkogenu v-src • značen jako cellular – c-src • 1989: Nobelova cena Struktura c-Src • Molekula c-Src má 536 AA (pp60). • N-konec je modifikován myristylátem. • Následují domény SH3, SH2 a SH2 linker • Dvě hlavní fosforylační místa: 1. Tyr 530 (527) negativní regulační místo na C-konci 2. Tyr 419 (416) pozitivní autoregulační místo v katalytické doméně Vsuvka: myristylace • posttranslační modifikace • připojení zbytku nenasycené mastné kyseliny CH3-(CH2)12-COOH • tato modifikace umožňuje ukotvení proteinů na buněčných membránách Regulace c-Src fosforylací Hlavním regulačním místem na molekule Src je Tyr(530/527): Je-li fosforylován, interaguje s SH2 doménou Src, a tak inhibuje tyrozinproteinkinázovou aktivitu Src. Tyr(419/416) se nachází v katalytické doméně. Jeho fosforylací je umožněn přístup Src k jeho substrátům. Na molekule Src další fosforylační místa (např. Thr34, Thr46, Ser72, a další), ale mají menší význam. Aktivace c-Src V inaktivním stavu (Tyr 530/527 fosforylován) je vytvořena interakce mezi C-koncem a SH2 doménou a dále mezi SH3 doménou a SH2 linkerem, Tyr 419/416 obvykle defosforylován. 1. Defosforylace Tyr 530/527 způsobí uvolnění interakcí C-konce s doménou SH2 a Tyr 419/416 může být autofosforylován, a tím aktivován. 2. Vazba Src (doménou SH2) na fosforylovaný RTK uvolňuje interakci C-konce a umožňuje fosforylaci Tyr 419/416 a tím aktivaci Src. Dále vliv celé řady kináz a fosfatáz, které mohou fosforylovat a defosforylovat Src. Aktivace c-Src Porovnání struktury kuřecího cSrc a RSV v-Src  několik jednoaminokyselinových záměn  19 C-koncových AA c-Src je nahrazeno jinými 12 AA Regulace c-Src interakcemi s dalšími proteiny PDGF a FAK interagují s SH2 doménou, a tak Src aktivují. FAK vedle vlastní aktivace Src také reguluje jeho lokalizaci přivádí ho do fokálních adhezí, kde Src dále fosforyluje FAK, zvyšuje jeho aktivitu a následuje aktivace Ras/MEK/ERK dráhy. Popsána řada kináz, které specificky fosforylují Src a řada fosfatáz, které specificky defosforylují Src. Regulace c-Src buněčnou lokalizací Src asociuje s buněčnými membránami: částečně díky myristylátu na N-konci, a dále zprostředkováno některými sekvencemi AA na N-konci. Lokalizace ovlivňuje funkci Src: • Cytoplazmatická membrána (fokální adheze, cytoskeleton, místa mezibuněčných kontaktů,...) - mitogenní signalizace přes RTKs a GPCRs; adheze buněk, migrace, mezibuněčné kontakty. • Cytoplazma a perinukleární prostor (Golgi, endozomy, synaptické vezikuly,...) - transport proteinů, progrese buněčného cyklu. • Jádro - regulace buněčného cyklu. c-Src a nádory Hladina proteinu a ještě více aktivita Src jsou často zvýšeny v nádorových buňkách ve srovnání s normálními buňkami a tyto hladiny rostou se stupněm malignity. Aktivita kinázy Src je zvýšena 4-20x u nádorů prsu oproti normálním tkáním. Jeden z možných mechanismů tohoto zvýšení souvisí s aktivitou fosfatázy defosforylující Tyr530 . U nádoru prsu se Src nachází převážně v perinukleárním prostoru, zatímco v normálních tkáních je pravidelněji v celé cytoplazmě. U většiny kolorektálních nádorů je aktivita Src zvýšena 5-8x, je to spíše časná událost (i v premaligních stádiích) a se zvyšujícím se stádiem se zvyšuje aktivita Src (zřejmá souvislost také s lokalizací metastáz). Úloha onkoproteinu Src v kancerogenezi Protonkoprotein ABL • 1980: virový onkogen (v-abl) Abelsonovy myší leukemie • všeobecně exprimovaná nereceptorová tyrozinkináza • člověk (savci): 2 geny ABL1 a ABL2 (více izoforem): regulují překrývající se (redundantní) i jedinečné funkce v různých buněčných typech, asi 90% homologie N-konce  propojuje nejrůznější extracelulární i intracelulární signály se signálními drahami, které řídí růst, přežívání, invazi, adhezi a migraci buněk  některé specializované funkce ABL: signalizace antigen receptorů u lymfocytů, tvorba synapsí u neuronů, adheze bakterií buněk střevního epitelu,…  mnoho tkáňově-specifických a kontext-dependentních funkcí Struktura proteinu ABL N-konec: • SH3 a SH2 domény • kinázová doména C-konec: • doména vázající aktin (ABD) • 3 NLS – import do jádra (pouze ABL1; ABL2 je lokalizována v cytoplasmě) • NES – export z jádra (vazbou na exportin-1)  shuttling Greuber EK et al, Nat Rev Cancer 13: 559-71, 2013 Regulace proteinu ABL Greuber EK et al, Nat Rev Cancer 13: 559-71, 2013 Katalytická aktivita je regulována: • intermolekulárními interakcemi (např. stimulující interakce s adaptorovými proteiny RIN1, které interagují s SH3 a SH2) • intramolekulárními interakcemi (b): autoinhibice zahrnující SH2 a SH3 domény, blokující aktivitu kinázové domény • posttranslačními modifikacemi (fosforylace tyrozinových zbytků Y412 a Y245 /Y272ABL2: snižují stabilitu proteinu ABL, vedou k ubikvitinaci a degradaci) Funkce proteinu ABL ABL (B):  aktivovány mnoha různými signály externími (jako RTK) i interními (poškození DNA, oxidativní stres,..)  každý signál může aktivovat pouze frakci buněčného proteinu ABL a fosforylovat selektivní substráty Wang JYJ. Mol Cell Biol34: 1188-1197, 2014 „Klasické“ přepínače signálů (A): • RTKs: po vazbě ligandu (externího) autofosforylace a fosforylace dalších cílových intracelulárních proteinů • aktivace prostřednictvím cAMP nebo PIP3 Funkce proteinu ABL • proteiny ABL se pohybují („shuttling“ - kyvadlové spojení) mezi jádrem a cytoplasmou • široké spektrum cílových proteinů ABL, jak jaderných (regulujících transkripci a chromatin), tak cytoplasmatických (regulujících polymeraci aktinu a biologické funkce zahrnující aktin) • aktivované ABL například regulují funkci invadopodií (nádorové struktury bohaté na aktin, které remodelují ECM během nádorové invaze), polaritu epiteliálních buněk • „BCR/ABL: jediná známá mutace, která je sama o sobě dostatečná k vývoji nádorů“ (prof. M.J.) Wang JYJ. Mol Cell Biol34: 1188-1197, 2014 Onkoprotein BCR/ABL • 1986: Filadelfský chromozom, (Philadelphia chromosome): vzniká reciprokou translokací t(9;22) - protoonkogen ABL (9q34.12) fúzován s genem BCR (22q11.21). Gen BCR má velice silný promotor, fúzí vzniká aktivní onkogen: chimérický protein (p190 nebo p210) je exprimován ve velké míře, kvůli strukturální odlišnosti od původní kinázy nereaguje na regulační mechanismy (je neustále aktivní) a buňky jsou tak stimulovány k nekontrolovatelné proliferaci. • Filadelfský chromozom je přítomen u asi 95% pacientů s chronickou myeloidní leukémií CML a podílu (tzv. Ph+) ALL. • protein BCR-ABL lze inaktivovat pomocí inhibitorů tyrozinkináz, např. imatinib (Glivec), dasatinib, nilotinib; Imatinib: první a zatím nejúspěšnější terapie pomocí inhibitorů proteinkináz!! • aberace ABL také u solidních nádorů, (především amplifikace a/nebo zvýšená hladina mRNA, hlavně ABL2) ale mnohem méně časté Protoonkoprotein Myc Původně popsán jako buněčný homolog v-myc viru ptačí myelocytomatózy Do rodiny proteinů Myc patří tři odlišné proteiny, které se uplatňují v kancerogenezi: c-Myc, N-Myc a L-Myc. Myc je jaderný fosfoprotein (430 AA) s mnoha znaky transkripčního faktoru. Myc typicky tvoří homodimery a heterodimery. Na DNA - v promotorech svých cílových genů – rozpoznávají tzv. E boxy (obsahující sekvenci CACGTG). Pro biologickou funkci Myc jsou nezbytné vysoce konzervované oblasti na N-konci MBI a MBII („Myc Boxes I a II“). Struktura proteinu Myc • transaktivační doména • DNA vazebná doména • dimerizační doména MBI a II – zajišťují transaktivaci a obsahují řadu fosforylačních míst. Mutace ovlivňující fosforylační místa (především threonin 58) zvyšují transformační potenciál Myc a byly nalezeny u některých nádorů. Fosforylace T58 vede k degradaci Myc proteazomem  mutace T58 zvyšuje hladinu Myc. Myc/Max jako transaktivátor • Myc tvoří heterodimery s proteinem Max. Ty potom fungují jako TF a aktivují transkripci svých cílových genů, které posilují proliferaci. • Hladina Myc je silně potencována mitogenními signály, zatímco hladina Max je relativně konstantní. • Transaktivace cílových genů dimerem Myc/Max dále regulována proteiny, které se váží na N-konec proteinu Myc: BIN-1, TRRAP. TRRAP zprostředkovává asociaci Myc s proteiny zajišťujícími acetylaci histonů. Max/Mad • Protein Mad kompetuje s Myc o Max. Mad/Max tvoří represor, a tak negativně ovlivňuje transkripci cílových genů. • Proteiny rodiny Mad nejen nahrazují v dimeru Myc, ale přivádějí k promotorům komplex Sin3/HDAC a tak je aktivně reprimují. • S úbytkem proliferace ubývá Myc a přibývá Mad. Weinberg RA. The Biology of Cancer. Garland Science 2007 Myc jako transaktivátor Cílové geny dimeru Myc/Max se podílejí na řízení buněčné proliferace: • gen pro cyklin D2 (CCND2) • gen pro CDK4 • Cul1, který následně degraduje p27Kip1 Myc indukuje expresi E2F1, E2F2 a E2F3 Myc/Max indukuje aktivitu telomerázy transaktivací katalytické podjednotky hTERT Myc/Max indukuje expresi Bim; Bim váže a tím inaktivuje Bcl-2 ( wt Myc indukuje apoptózu) Myc jako represor K C-konci Myc se mohou vázat další proteiny ovlivňující vazbu na DNA, jako např. Miz-1. • Geny uplatňující se při zastavení buněčného cyklu p15INK4B a p21WAF1. • Zpětnovazebnou regulací Myc reprimuje vlastní expresi. • Geny uplatňující se v buněčné adhezi integriny L2 a 31. • Geny specifické pro diferenciaci mim-1, lysosyme a C/EBP. Myc reguluje progresi G1-S aktivací i represí Aktivace cyklinu D2 a CDK4 Represe p15 a p21 Vliv Myc na buněčný cyklus • Dimer Myc-Max indukuje expresi cyklinu D2 a CDK4  BC (G1) • Dimer Myc-Mac indukuje expresi Cul1, který zprostředkovává degradaci p27  BC (G1) • Dimer Myc-Max indukuje expresi E2Fs  BC (S) • Dimer Myc-Miz-1 reprimuje expresi p15, p21 a p27  BC (G1) Myc a nádory • Do rodiny proteinů Myc patří tři odlišné proteiny: c-Myc, N-Myc a L-Myc. • Jsou si podobné svou strukturou a mechanismem účinku. • Výrazně se liší expresí během vývoje a také se zdá, že ovlivňují - i ve stejném buněčném kontextu - jiné sady genů, participují - i ve stejných buněčných typech - na jiných buněčných programech. • Liší se významně také svou úlohou ve vývoji jednotlivých typů neoplastických onemocnění. c-myc a nádory Burkittův lymfom: Téměř všechny případy Burkittova lymfomu souvisí s translokací genu c-myc (na chromozomu 8) buď s těžkým řetězcem  nebo lehkým řetězcem  nebo  imunoglobulinů (na chromozomech 14, 22 a 2). Typy translokací u Burkittova lymfomu Téměř všechny případy Burkittova lymfomu souvisí s translokací genu c-myc (na chromozomu 8) buď s těžkým řetězcem  nebo lehkým řetězcem  nebo  imunoglobulinů (na chromozomech 14, 22 a 2). Vsuvka: Burkittův lymfom Vyskytuje se často u dětí východní a centrální Afriky, ve spojitosti s infekcí virem Epstein-Barrové a malarickými parazity. Možné vysvětlení Chronická malárie oslabuje imunitní systém dětí  jsou vnímavější k infekci EBV  to může vést k obrovské akumulaci populace imortalizovaných (EBV) B lymfocytů: v nich enzymatická mašinérie zajišťující přeskupení imunoglobulinů  občas dojde omylem k translokaci zahrnující onkogen c-myc. Růžová: geografická distribuce Aedes simpsoni, přenašeče malárie. Zelená: geografická distribuce dětského Burkittova lymfomu (popsáno Dennisem Burkittem) c-myc a nádory Ostatní lymfomy: • Low-grade folikulární lymfom je většinou spojen s translokací Ig/Bcl-2 - t(14;18), jen vzácně lze detekovat přestavby c-myc. Některé z nich transformují v agresivnější formu a u těch už jsou detekovány i přestavby Ig/c-myc: t(8;14), t(2;8), t(8;22) • Difúzní velkobuněčné lymfomy B-buněk jsou heterogenní a asi u 50% lze detekovat translokaci Ig buď s BCL2, BCL6 nebo c- myc. c-myc a nádory Solidní nádory: Amplifikace a/nebo zvýšená exprese c-myc se vyskytuje u významného podílu invazivních duktálních karcinomů prsu (spojeno s horší prognózou), u některých nádorů prostaty, u gastrointestinálních nádorů (souvislost c-myc:APC:-katenin: jaderný -katenin slouží jako koaktivátor TF Tcf-4, který transaktivuje c-myc), u některých melanomů a u mnohočetného myelomu (koreluje s agresivitou onemocnění). N-myc a nádory Amplifikace N-myc se vyskytuje asi u 30% (až 40% pokročilých) případů neuroblastomu (tumor periferního NS) a je spojena s horší prognózou onemocnění. Některé nádory mají 10 až 30 kopií genu Nmyc, jiné až 100-150 kopií (žlutě značená sonda FISH). Zvýšená exprese N-myc byla popsána u významného podílu případů malobuněčného nádoru plic a u menšího počtu případů medulárního tyroidního nádoru, retinoblastomu, rhabdomyosarkomu a astrocytomů. Weinberg RA. The Biology of Cancer. GS 2007 L-myc a nádory Amplifikace a zvýšená exprese L-myc (a také c-myc a N-myc) byla pozorována u některých případů malobuněčného karcinomu plic.