Správná laboratorní praxe v chemické laboratoři Příprava k analýze Ing. Branislav Vrana, PhD. vrana@recetox.muni.cz Příprava k analýze • identifikace faktorů, které je třeba zvážit při výběru metody analýzy • kde hledat vhodné metody • identifikace příčin nevyhovujících výsledků • validace analytických metod Volba postupu • Použitý postup (metoda) musí být vhodný pro svůj účel • Zdroje postupů – vlastní postupy vyvinuté jednou laboratoří pro vlastní speciální použití – postupy publikované ve veřejné vědecké literatuře – postupy poskytnuté obchodními organizacemi – postupy v knihách publikovaných odbornými organizacemi, např. The Royal Society of Chemistry (Analytical Methods Committee), Association – postupy publikované normalizačními organizacemi, např. v ČR Český normalizační institut, v Evropě CEN, celosvětový ISO, v USA ASTM, v Británii BSI, atd. – postupy, vydávané státními orgány, např. v EU The Fertilisers (Sampling and Analysis) Regulations 1991 (S.I. No. 973) H. M. S. O., EC Legislation Podrobnostvalidace Validace - studie která prokazuje, že při použití v laboratoři poskytne metoda výsledky vhodné pro očekávané použití Rozdělení metod stopové analýzy • stopová analýza - velmi nízké hladiny analytů (mg.kg-1, μg.kg-1) v složitých matricích • faktory při výběru vhodné metody – rychlost – náklady – dostupnost měřícího zařízení – falešně negativní (frequency of false negatives and false positives) – falešně pozitivní – mez detekce (limit of detection) – mez stanovitelnosti (limit of quantification) – specifičnost (specificity) – rozsah validace (extent of validation) – Nejistota stanovení (measurement uncertainty) Typy metod v stopové analýze Rutinní Státní dozor screeningové vyhledávací důkazní referenční Faktory rozhodující o výběru postupu 1. Mez detekce – limit of detection (LOD) • nejnižší množství analytu ve vzorku, které může být detekováno, ale nemusí nutně být kvantifikováno jako exaktní hodnota • nejnižší signál • nejnižší koncentrace – • Ve většině případů se mez detekce bere jako • -koresponduje s %RSD = 33% blblL 3sxx    SsSxcqLOD blLLL /3 3 x sbl nebo 3-krát poměr signál/šum. Faktory rozhodující o výběru postupu 2. Mez stanovitelnosti - limit of quantification (LOQ) • nejnižší množství analytu ve vzorku, které je možno kvantitativně stanovit s potřebnou nejistotou • nejnižší signál • nejnižší koncentrace – • Ve většině případů se mez detekce bere jako • -koresponduje s %RSD = 10% blblL 10sxx    SsSxcqLOD blLLL /10 10 x sbl nebo 10-krát poměr signál/šum Faktory rozhodující o výběru postupu 3. Přesnost měření - accuracy • Těsnost shody mezi výsledkem zkoušky a pravou hodnotou měřené veličiny • Výsledek sa vyjádřuje v pojmech nejistoty, t.j. odhad rozmezí hodnot, mezi nimiž leží na určité hladině spolehlivosti skutečná hodnota Přesnost měření (accuracy) Preciznost měření (precision) Pravdivost měření (trueness) POZOR!!! Nová jednotná národní terminologie: Eurachem ČR 2009, Metodický list 2: „Jak překládat precision, accuracy a trueness?“ Náhodná složka chyby měření Systematická složka chyby měření Složky chyby analytického výsledku ve vztahu k přesnosti metody analytický výsledek pravá hodnota chyba očekávaná hodnota (limitní průměr) nepřesnost Rozdíl mezi analytickým výsledkem a pravou hodnotou systematická chyba náhodná chyba vychýlení (bias) nepreciznost (imprecision) persistentní vychýlení Rozdíl mezi očekávanou hodnotou a pravou hodnotou reproduko -vatelnost Mezilehlá preciznost opakova- telnost „run“ efekt variace v celém analytickém systému po dlouhou dobu Efekt variace matrice Vychýlení metody Krátkodobé variace Vychýlení laboratoře vychýlení analýzy Mezilaboratorní variabilita krátkodobá variabilita za konstantních podmínek dlouhodobá variabilita v jedné laboratoři náhodné vychýlení PreciznostPravdivostIndikátor rozdílu mezi mezi očekávanou a pravou hodnotou Indikátor rozdílu mezi mezi výsledkem a očekávanou hodnotou Faktory rozhodující o výběru postupu 3. Přesnost měření - accuracy Přesnost měření (accuracy) Preciznost měření (precision) Pravdivost měření (trueness) Bias Accuracy (přesnost): Preciznost (precision) a Pravdivost (trueness) Neprecizní (problém reprodukovatelnosti) Precizní Nevychýlený Vychýlený Faktory rozhodující o výběru postupu 3. Přesnost měření - accuracy Přesnost měření (accuracy) Preciznost měření (precision) Pravdivost měření (trueness) POZOR!!! Nová jednotná národní terminologie: Eurachem ČR 2009, Metodický list 2: „Jak překládat precision, accuracy a trueness?“ Vysoká preciznost Velké vychýlení Nízká preciznost Malé vychýlení Faktory rozhodující o výběru postupu 4. Preciznost měření - precision • je těsnost souhlasu mezi nezávislými výsledky zkoušek získaných za dohodnutých podmínek • závisí pouze na rozdělení náhodných chyb a nemá žádný vztah ke správné hodnotě • Vypočítá se jako směrodatná odchylka výsledků zkoušek z opakovaných měření Faktory rozhodující o výběru postupu 4. Preciznost měření - precision Mez opakovatelnosti (r) = repeatability je hodnota, pod níž lze se zadanou pravděpodobností 95 % předpokládat, že leží absolutní rozdíl výsledků dvou jednotlivých zkoušek, získaných stejnou metodou se stejným zkoušeným materiálem za stejných podmínek a neuplatňují se jiné pravděpodobnostní vlivy. Mezilehlá preciznost vyjadřuje variabilitu uvnitř laboratoře v různých dnech, s různými analytiky, různým vybavením, atd. Běžně se odečítá z regulačních diagramů. Mez reprodukovatelnosti (R) je hodnota, pod níž lze se zadanou pravděpodobností 95 % předpokládat, že leží absolutní rozdíl výsledků dvou jednotlivých zkoušek, získaných stejnou metodou se stejným zkoušeným materiálem za rozdílných podmínek, a neuplatňují se jiné pravděpodobnostní vlivy. rSDr  83.2 x SD RSD 100 RSDR  83.2 Faktory rozhodující o výběru postupu 4. Preciznost – Horwitzova funkce Trends in Analytical Chemistry, Vol. 23, No. 8, 2004 Faktory rozhodující o výběru postupu 5. Pravdivost - trueness • Těsnost shody mezi výsledkem aritmetickým průměrem nekonečného počtu opakovaných naměřených hodnot veličiny a přijatou referenční hodnotou • představuje obecné systematické chyby nebo vychýlení (bias) bias % vychýlení Z-skóre = rozdíl mezi naměřenou hodnotou veličiny a certifikovanou referenční hodnotou Porovnání metody s jinou, referenční metodou Jestliže není CRM k dispozici: % výtažnosti (recovery) známého přidaného množství analytu Přijatelné hodnoty výtěžnosti – funkce koncentrace analytu L. Huber (Ed.), Validation and Qualification in Analytical Laboratories, Interpharm Press, East Englewood, CO, USA, 1998.