jména: obor: datum provedení: neznámý vzorek pro kvalitativní analýzu A B C D E F G H (zakroužkujte) neznámý vzorek pro kvantitativní analýzu a b c d e f g h (zakroužkujte) přílohy protokolu: chromatogram, graf (kalibrační přímka pro stanovení redukujících sacharidů Somogyiho metodou) OKRUHY K PŘÍPRAVĚ Struktura sacharidů (monosacharidy vs. disacharidy vs. trisacharidy vs. polysacharidy. Struktura monosacharidů (pentosy vs. hexosy, aldosy vs. ketosy). Struktura disacharidů a trisacharidů (monosacharidové podjednotky, způsoby jejich spojení). Redukující vs. neredukující oligosacharidy. Barevné reakce sacharidů. Princip rozdělovací chromatografie. Retenční faktor. Lambertův-Beerův zákon. Glukosaoxidasová reakce, princip stanovení koncentrace glukosy enzymovou elektrodou. Chemické výpočty. Návod v plném znění platí pro obory molekulární biologie, chemie, biochemie (pětihodinová a sedmihodinová cvičení). Biologické obory kromě molekulární biologie (tříhodinová cvičení): jen části A, B. Učitelské kombinace (čtyřhodinová cvičení): jen části A, B, D. PRINCIP ÚLOHY A. Barevné reakce sacharidů Chemické reakce sacharidů jsou založeny na jejich schopnosti tvořit dehydratací minerálními kyselinami furan-2-aldehyd nebo jeho deriváty a dále na reaktivitě hydroxylových a karbonylových skupin sacharidů. Některé polysacharidy tvoří barevné klathráty s jódem. Volbou vhodné kombinace kvalitativních reakcí lze určit základní charakteristiky neznámého vzorku. Barevné reakce sacharidů lze dále využít např. pro jejich kvantitativní fotometrické stanovení, pro jejich chromatografickou detekci, případně pro identifikaci cukerných složek biopolymerů. 1. Reakce založené na tvorbě furan-2-aldehydu a jeho derivátů Monosacharidy jsou účinkem kyseliny dehydratovány na furan-2-aldehyd (označovaný také jako furfural - týká se pentos) nebo 5-hydroxymethylfuran-2-aldehyd (týká se hexos).Furan-2-aldehyd nebo 5-hydroxymethylfuran-2-aldehyd kondenzuje s fenoly nebo aromatickými aminy (thymol, 1-naftol, orcin, resorcin, difenylamin a jiné) za vzniku barevných derivátů, které jsou obdobou trifenylmethanových barviv. Různé sacharidy poskytují v různých reakčních prostředích různě zbarvené produkty. Volbou reakčních prostředí proto získáváme reakce s různou specifitou. Pro kvalitativní určení sacharidu v neznámém vzorku v této úloze využijete: - thymolové reakce, která poskytuje barevný produkt se všemi sacharidy, - Selivanovy a Rothenfusserovy reakce, poskytující specifické zbarvení pro všechny ketosy, - Bialovy reakce, poskytující specifické zbarvení pro všechny pentosy. Reakce mohou poskytovat i oligosacharidy, polysacharidy nebo glykosidy, pokud při podmínkách stanovení dochází k jejich hydrolýze. 2. Redoxní reakce Redoxní reakce sacharidů jsou založeny na oxidaci volné karbonylové funkční skupiny sousedící s hydroxylovou skupinou (α-ketol). Aldehydická skupina aldos se přitom oxiduje na karboxylovou, u ketos dochází k oxidaci ketoskupiny spojené se štěpením molekuly sacharidu. Ty z oligosacharidů, které nemají volnou karbonylovou skupinu (resp. volný hemiacetalový hydroxyl), reakci neposkytují. K nejpoužívanějším oxidačním činidlům patří oxid měďnatý (používaný ve Fehlingově a Somogyiho reakci), soli stříbra, antimonu nebo bismutu a kyselina pikrová.. 3. Reakce s jódem Pokud má polysacharid šroubovicové uspořádání, pronikají molekuly I[2] do dutin vytvořených šroubovicí a vzniklý klathrát jeví změněné fyzikální vlastnosti (změna zbarvení). Řetězce tvořené 30 - 35 monosacharidovými podjednotkami poskytují modré zbarvení, řetězce tvořené 8 - 12 monosacharidovými podjednotkami poskytují červené zbarvení, kratší řetězce zbarvení neposkytují. B. Rozdělovací chromatografie sacharidů Základem všech chromatografických metod je distribuce analyzovaných látek mezi stacionární a mobilní fází na základě rozdílné interakce analyzovaných látek se stacionární a s mobilní fází. Při rozdělovací chromatografii se jako stacionární a mobilní fáze používají dvě navzájem nemísitelná nebo omezeně mísitelná rozpouštědla. Aby bylo možno docílit vzájemného pohybu dvou nemísitelných fází, je nutno jednu z nich zakotvit (stacionární fáze). Stacionární fází bývá obvykle voda, zakotvená na hydrofilním nosiči (silikagel /oxid křemičitý . x H[2]O/, škrob, celulosa apod.) (pokud nejde o tzv. chromatografii s reverzní fází, při které se naopak ukotvuje nepolární rozpouštědlo na hydrofobní nosič). Mobilní fází je méně polární organické rozpouštědlo, zpravidla směs rozpouštědel s určitým rovnovážným obsahem vody, která je nutná k tomu, aby při eluci nedocházelo k vymývání stacionární vody z nosiče. Při rozdělovací chromatografii v plošném uspořádání se látky nanesou na plochu nosiče s ukotvenou stacionární fází, přes kterou protéká mobilní fáze. Látky více rozpustné ve stacionární fázi se pohybují pomaleji, látky rozpustnější v mobilní fázi se pohybují rychleji. Rychlost pohybu látek je charakterizována retenčním faktorem (R[f]), který je definován jako podíl vzdálenosti analytu od startu a vzdálenosti čela rozpouštědla od startu. (Teoreticky může R[f] dosahovat hodnot od 0 /látka se při chromatografii nepohybuje, zůstává na startu/ do 1 /látka putuje současně s čelem mobilní fáze/. Optimálně mají být R[f][ ] v rozmezí od 0,15 do 0,8.) Jakmile dojde čelo rozpouštědla k okraji plochy nosiče, proces se ukončí, chromatogram se vysuší a jednotlivé látky (pokud nejsou barevné) se detekují (nejčastěji vybarvením skvrn látek pomocí chemických činidel, někdy je možné pozorovat skvrny v ultrafialovém světle, radioaktivní látky lze lokalizovat měřením radioaktivity apod.). V této úloze bude k identifikaci neznámého vzorku sacharidu použita rozdělovací chromatografie v plošném uspořádání na tenké vrstvě silikagelu (Silufol). Stacionární fáze je polární a tvoří ji voda vázaná v silikagelu, mobilní fáze je méně polární a tvoří ji směs ethylacetátu, isopropanolu a vody. Pohyblivost sacharidů je při rozdělovací chromatografii ovlivněna především velikostí molekuly (počet monosacharidových podjednotek – monosacharidy vs. oligosacharidy) a počtem uhlíků v molekule (pentosy vs. hexosy), dále prostorovým uspořádáním hydroxylových skupin (rozlišení epimerů) a jejich počtem (sacharid vs. deoxysacharid). Vliv na pohyblivost sacharidů má dále charakter cyklické struktury (furanosy jsou pohyblivější než pyranosy), u oligosacharidů se uplatňuje i způsob spojení podjednotek (1,4-disacharidy jsou pohyblivější než 1,6-disacharidy). Detekce sacharidů na chromatogramu bude provedena jejich reakcí s hydrogenftalátem anilinu. Aldopentosy poskytují s touto látkou po zahřátí v kyselém prostředí intenzivní zbarvení odlišného odstínu než aldohexosy, ketosy se barví slaběji. Redukující oligosacharidy rovněž poskytují zbarvení, neredukující oligosacharidy zbarvení neposkytují a nelze je touto metodou identifikovat. C. Stanovení koncentrace redukujících sacharidů Somogyiho metodou Sacharidy obsahující volnou hemiacetalovou hydroxylovou skupinu redukují v alkalickém prostředí za zvýšené teploty (100 ^oC) komplexní měďnatou sůl (vytvořenou při smíchání Somogyiho-Nelsonova činidla I a II) za vzniku měďných iontů, které dále redukují arsenomolybdenan (součást Somogyiho-Nelsonova činidla III) na molybdenovou modř. Ta je barevným reakčním produktem s absorpčním maximem při vlnové délce 740 nm, jehož koncentraci lze stanovit fotometricky. Intenzita modrého zbarvení je tedy přímo úměrná koncentraci redukujících sacharidů. Při nízkých koncentracích redukujících sacharidů ve vzorku je výsledné zbarvení modrozelené nebo trávově zelené. Metoda je velmi citlivá: je vhodná pro vzorky obsahující velmi malá látková množství redukujících sacharidů (řádově 0,1 μmol), na druhé straně však jakékoliv nečistoty redukujících látek ve zkumavkách a pipetách falešně pozitivně ovlivňují získané výsledky. D. Stanovení koncentrace glukosy pomocí elektrody s imobilizovaným enzymem Glukosaoxidasa (systematický název: β-D-glukopyranosa : O[2]-1-oxidoreduktasa) katalyzuje oxidaci β-D-glukopyranosy (glukosy) na kyselinu glukonovou (přes glukonolakton) a peroxid vodíku: H[2]O β-D-glukopyranosa + O[2] ―> kyselina glukonová + H[2]O[2] Množství peroxidu vodíku vznikajícího glukosaoxidasovou reakcí je úměrné množství spotřebované glukosy a lze jej stanovit amperometricky při konstantním potenciálu +650 mV jeho oxidací H[2]O[2 ]―> O[2]+ 2H^+ + 2e^- na pracovní platinové elektrodě (referentní elektrodou je argentchloridová elektroda). Velikost proudu je tedy přímo úměrná koncentraci glukosy ve vzorku. K měření bude využit počítačem řízený elektrochemický detektor; nastavení pracovních parametrů, vlastní měření i vyhodnocování naměřených údajů se provádí pomocí počítačového programu LabTools pod operačním systémem Windows. Glukosa je v klinické praxi nejčastěji stanovovaným sacharidem. Zvýšená hladina glukosy v krevním séru a v moči indikuje poruchu cukerného metabolismu - nejčastěji cukrovku (diabetes mellitus). U zdravého jedince je koncentrace glukosy v krevním séru velmi stabilní (rozmezí normálních hodnot je 3,3 - 5,6 mmol.l^-1), v moči maximálně 0,72 mmol.l^-1. Stanovení glukosy pomocí glukosaoxidasy je (na rozdíl od např. Somogyiho metody) vysoce specifické (glukosaoxidasa se používá také k fotometrickému stanovení glukosy nebo k jejímu orientačnímu stanovení pomocí diagnostických papírků). Výhodou imobilizace enzymu je možnost jeho opakovaného použití, čímž se podstatně snižují náklady na stanovení. V případě enzymových elektrod (jde o nejběžnější typ biosensoru) je enzym imobilizován navázáním na membránu elektrody zpravidla pomocí glutaraldehydu (zesíťování enzymu) v přítomnosti albuminu. PRAKTICKÁ ČÁST A. Barevné reakce sacharidů Materiál a vybavení: 1 % roztoky sacharidů (standardní vzorky) (arabinosa /ara/, ribosa /rib/, glukosa /glc/, galaktosa /gal/, fruktosa /fru/, sacharosa /sac/, trehalosa /tre/, maltosa /mal/, škrob /škr/, glykogen /gly/) neznámý vzorek pro kvalitativní analýzu (obsahuje jeden z výše uvedených sacharidů) (?) koncentrovaná kyselina chlorovodíková 3 % roztok thymolu v ethanolu Selivanovo činidlo (roztok resorcinu v kyselině chlorovodíkové) Rothenfusserovo činidlo (roztok difenylaminu v ethanolu, kyselině octové a chlorovodíkové) Bialovo činidlo (roztok orcinu a chloridu železitého v kyselině chlorovodíkové) Fehlingovo činidlo I (roztok síranu měďnatého) Fehlingovo činidlo II (roztok vínanu sodno-draselného v hydroxidu sodném) Somogyiho-Nelsonovo činidlo I (roztok uhličitanu sodného, síranu sodného a vínanu sodno- draselného) Somogyiho-Nelsonovo činidlo II (roztok síranu měďnatého a síranu sodného) Somogyiho-Nelsonovo činidlo III (roztok molybdenanu amonného a arseničnanu sodného v kyselině sírové) Lugolův roztok (roztok jódu a jodidu draselného) zkumavky, Pasteurovy pipety, kahan a trojnožka nebo vařič, držák na zkumavky, hrnec, kruhový stojan na zkumavky Postup: Reakce proveďte s roztoky známých sacharidů a s neznámým vzorkem podle rozpisu v tabulce na následující straně. Vyšrafované reakce vynechejte. Vznik barevných produktů, případně sraženin, zapište do tabulky v řádku „popis“. Je-li zbarvení vzorku příliš intenzivní, tak, že nelze rozeznat jeho odstín, zřeďte vzorek vodou. Na základě znalosti specifity reakce, struktury a chemických vlastností sacharidu rozhodněte, zda je výsledek reakce pro daný sacharid pozitivní (+) nebo negativní (-). Totéž rozhodněte v případě neznámého vzorku, a to na základě podobnosti zbarvení. Výsledky zapište do tabulky. Roztoky činidel nepipetujte ani nepoužívejte dávkovače – odměřujte pomocí plastových Pasteurových pipet („kapátek“)! Thymolová reakce (reakce na přítomnost sacharidu). Smíchejte 0,5 ml roztoku sacharidu, 3 kapky roztoku thymolu a 3 ml koncentrované kyseliny chlorovodíkové. Opatrně povařte 1 - 5 minut. Selivanova reakce (reakce na přítomnost ketosy). Smíchejte 0,5 ml roztoku sacharidu a 2 ml Selivanova činidla. Zahřívejte 1 minutu na vroucí vodní lázni. Rothenfusserova reakce (reakce na přítomnost ketosy). Smíchejte 0,5 ml roztoku sacharidu a 2 ml Rothenfusserova činidla. Zahřívejte 10 minut na vroucí vodní lázni. Bialova reakce (reakce na přítomnost pentosy). Smíchejte 0,5 ml roztoku sacharidu a 2 ml Bialova činidla. Zahřívejte 5 minut na vroucí vodní lázni. Fehlingova reakce (reakce na přítomnost redukujícího sacharidu). Smíchejte 0,5 ml roztoku sacharidu, 0,5 ml Fehlingova činidla I a 0,5 ml Fehlingova činidla II. Opatrně povařte. Somogyiho reakce (reakce na přítomnost redukujícího sacharidu). Smíchejte 0,5 ml roztoku sacharidu, 0,5 ml Somogyi-Nelsonova činidla I a 0,5 ml Somogyi-Nelsonova činidla II. Zahřívejte 10 minut na vroucí vodní lázni. Po zchladnutí přidejte 2 ml Somogyi-Nelsonova činidla III. Reakce s jódem (reakce na přítomnost polysacharidu). 0,5 ml roztoku sacharidu smíchejte s kapkou Lugolova roztoku. ara rib glc gal fru sac mal tre gly* škr ? reakce na přítomnost sacharidu thymolová popis +/- reakce na přítomnost ketosy Selivanova popis +/- Rothenfusserova popis +/- reakce na přítomnost pentosy Bialova popis +/- reakce na přítomnost redukujícího sacharidu Fehlingova popis +/- Somogyiho popis +/- reakce na přítomnost polysacharidu s jódem popis +/- *glykogen – jen pokud je k dispozici Vyhodnocení: Na základě informací, které jste získali o struktuře a chemických vlastnostech neznámého sacharidu rozhodněte, přítomnost kterého sacharidu v neznámém vzorku připadá v úvahu: Průběžný výsledek: sacharid v neznámém vzorku: PRAKTICKÁ ČÁST B. Rozdělovací chromatografie sacharidů Materiál a vybavení: 2 % roztoky sacharidů v 30 % isopropanolu (standardní vzorky) (ribosa /rib/, 2´-deoxyribosa /drib/, glukosa /glc/, galaktosa /gal/, mannosa /man/, fruktosa /fru/, maltosa /mal/, laktosa /lac/, cellobiosa /cel/) neznámý vzorek pro kvalitativní analýzu (?) směs ethylacetát - isopropanol - voda (3:2:1) hydrogenftalátanilinové činidlo (roztok hydrogenftalátu anilinu v butanolu) Silufol, pravítko, tužka, chromatografická komůrka, kapiláry nebo dávkovače, infralampa, rozprašovač Postup: Na desce Silufolu označte tužkou startovací linii asi 1 cm od okraje. Vzorky (standardy a neznámý vzorek) nanášejte čistými kapilárami na start tak, aby maximální velikost skvrny byla 2-3 mm (v pořadí podle tabulky). Zkratkou označte druh nanášeného sacharidu. Silufol krátce vysušte pod infralampou a umístěte do chromatografické komůrky s vyvíjecí směsí (mobilní fáze). Jakmile čelo mobilní fáze dosáhne vzdálenosti asi 1 cm od horního okraje, označte je tužkou a chromatogram vysušte 5 minut pod infralampou. Suchý chromatogram postříkejte hydrogenftalátanilinovým činidlem a umístěte na 30 minut pod infralampu k vysušení. Dále pokračujte až poté, co jste předložili vedoucímu cvičení výsledek úlohy 1A ke kontrole. Tužkou si označte středy skvrn na chromatogramu. Výsledky a vyhodnocení: Vlastní chromatogram odevzdáte připevněný k protokolu. Uveďte vzdálenost start – čelo rozpouštědla: cm Určete R[f] vzorků obsahujících známé sacharidy a R[f] neznámého vzorku (viz tabulka). sacharid vzdálenost středu skvrny od startu [cm] R[f] ribosa (rib) 2´-deoxyribosa (drib) glukosa (glc) galaktosa (gal) mannosa (man) fruktosa (fru) maltosa (mal) laktosa (lac) cellobiosa (cel) ? Přiřaďte k sobě hodnotu R[f] neznámého vzorku a nejbližší hodnotu R[f] mezi známými sacharidy. O jaký sacharid se jedná? Zakroužkujte jej v tabulce. (V případě blízkých hodnot R[f] můžete použít zbarvení skvrn jako pomocný parametr.) Srovnejte výsledek s výsledkem úlohy 1A a proveďte definitivní závěr, který sacharid je obsažen v neznámém vzorku: Souhrnný výsledek úloh 1A a 1B: sacharid v neznámém vzorku: PRAKTICKÁ ČÁST C. Stanovení koncentrace redukujících sacharidů Somogyiho metodou Materiál a vybavení: standardní roztok glukosy (0,2 mmol.l^-1) neznámý vzorek pro kvantitativní analýzu (obsahuje glukosu o neznámé koncentraci) Somogyiho-Nelsonovo činidlo I (roztok uhličitanu sodného, vínanu sodno-draselného a síranu sodného) Somogyiho-Nelsonovo činidlo II (roztok síranu měďnatého a síranu sodného) Somogyiho-Nelsonovo činidlo III (roztok molybdenanu amonného a hydrogenarseničnanu sodného v kyselině sírové) zkumavky, pipety, dávkovače, pumpičkvé dávkovače, odměrné baňky 50 ml a 100 ml, kahan a trojnožka nebo vařič, hrnec, kruhový stojan na zkumavky, vortex, fotometr, kyvety Postup: Nejprve si zřeďte část neznámého vzorku pro kvantitativní analýzu následujícím způsobem: pipetujte 1 ml vzorku do 50 ml odměrné baňky a doplňte destilovanou vodou po rysku. Po důkladném promíchání pipetujte z takto zředěného roztoku 10 ml do 100 ml odměrné baňky, doplňte opět destilovanou vodou po rysku a důkladně promíchejte (tuto odměrnou baňku označte písmenem N). Nachystejte si sadu 8 zkumavek, které důkladně vypláchnete destilovanou vodou. Používejte pouze dokonale čisté zkumavky a pipety. Stanovení je velmi citlivé, jakákoliv stopa redukujících látek hrubě zkresluje jeho výsledek. Podle tabulky připravte nejprve sadu šesti roztoků o celkovém objemu 0,5 ml a známé koncentraci glukosy k sestrojení kalibrační přímky (zkumavky 1-6). Pipetujte podle rozpisu pipetami, které jste vypláchli destilovanou vodou. Zkumavka č. 1 neobsahuje glukosu vůbec, proto se použije jako slepý vzorek. Do zkumavek č. 7 a 8 pipetujte zředěný neznámý vzorek z odměrné baňky označené písmenem N. zkumavka č. pipetovaný objem vypočtená c(glc) [mmol.l^-1] A[740] 0,2 mmol.l^-1 roztok glc [ml] zředěný neznámý vzorek (z odměrné baňky N) [ml] destil. voda [ml] 1 0,0 0,0 0,5 0,00 2 0,1 0,0 0,4 3 0,2 0,0 0,3 4 0,3 0,0 0,2 5 0,4 0,0 0,1 6 0,5 0,0 0,0 Ø A[740] 7 0,0 0,5 0,0 ? 8 0,0 0,5 0,0 ? V úloze pracujete s toxickými činidly (zejména Somogyiho-Nelsonovo činidlo III) - pracujte se zvýšenou opatrností! Do všech zkumavek dávkujte (pumpičkovým dávkovačem) 0,5 ml Somogyiho-Nelsonova činidla I, vzorky promíchejte a zahřívejte asi 5 minut na vroucí vodní lázni. Potom přidejte (pumpičkovým dávkovačem) do všech vzorků 0,5 ml Somogyiho-Nelsonova činidla II a zahřívejte na vroucí vodní lázni dalších 10 minut. Po ochlazení na laboratorní teplotu (lze chladit pomocí studené vody) přidejte pumpičkovým dávkovačem do všech vzorků 2 ml Somogyiho-Nelsonova činidla III, vzorky promíchejte a po 5 minutách stání při laboratorní teplotě (zbarvení je stálé po dobu několika hodin) opět promíchejte (vypuzení oxidu uhličitého ze vzorku). Změřte absorbanci roztoků 2-8 při vlnové délce 740 nm proti slepému vzorku č.1 (roztoky po měření vracejte do zkumavek), výsledky zapište do tabulky. V případě výskytu bublinek (CO[2]) v kyvetách zaťukejte kyvetou jemně o stůl, čímž CO[2] vypudíte. Přesáhne-li absorbance některého z roztoků hodnotu 0,8 (nad touto hodnotou již není závislost absorbance na koncentraci lineární – neplatí Lambert-Beerův zákon), zřeďte celou sadu roztoků 1-8 v poměru 1:1 destilovanou vodou; naměřenou hodnotu absorbance musíte v tomto případě vynásobit dvěma. Vzhledem k tomu, že kalibrační graf pro stanovení redukujících sacharidů budete používat v dalších úlohách (úloha č. 6), je nezbytně nutné získat správné výsledky. Nesprávnou závislost ihned konzultujte s vyučujícím. Vyhodnocení: Vypočítejte koncentrace glukosy ve zkumavkách č. 2-6, výsledky doplňte do tabulky. Vypočítejte průměr absorbancí ve zkumavkách 7-8 a doplňte do tabulky. Sestrojte kalibrační graf (závislost A[740] na koncentraci glukosy ve zkumavce). Z rovnice kalibrační přímky, kterou zobrazíte v grafu, pak vypočítejte koncentraci glukosy ve zředěném neznámém vzorku (výpočet uveďte níže): Vypočítejte, kolikrát byl zředěn původní neznámý vzorek při přípravě zředěného neznámého vzorku (odměrná baňka N). Ředění neznámého vzorku: krát Tímto faktorem vynásobte koncentraci glukosy ve zředěném neznámého vzorku, abyste získali koncentraci glukosy v původním neznámého vzorku. Výsledek: koncentrace glukosy v neznámém vzorku zjištěná Somogyiho metodou: c = mmol.l^-1 PRAKTICKÁ ČÁST D. Stanovení koncentrace glukosy pomocí elektrody s imobilizovaným enzymem Tato část cvičení bude provedena demonstračně. KONTROLNÍ LIST jména: obor: datum provedení: neznámý vzorek pro kvalitativní analýzu A B C D E F G H (zakroužkujte) neznámý vzorek pro kvantitativní analýzu a b c d e f g h (zakroužkujte) ÚLOHA 1A Průběžný výsledek: možné sacharidy v neznámém vzorku: Podpis vedoucího cvičení: ÚLOHA 1B Souhrnný výsledek úloh 1A a 1B: sacharid v neznámém vzorku: Podpis vedoucího cvičení: ÚLOHA 1C zkumavka č. A[740] 1 0,000 2 3 4 5 6 7 8 Podpis vedoucího cvičení: