jméno: obor: datum provedení: neznámý vzorek pro kvantitativní analýzu a b c d e f g h (zakroužkujte) přílohy protokolu: 3x graf: kalibrační přímka pro stanovení bílkovin fotometricky v UV oblasti, kalibrační přímka pro stanovení bílkovin biuretovou metodou, kalibrační přímka pro stanovení bílkovin Folinovou metodou. OKRUHY K PŘÍPRAVĚ Absorbující složky bílkovin. Absorpční spektrum bílkovin. Principy metod stanovení bílkovin. Lambertův-Beerův zákon. Stechiometrie neutralizačních titrací. Chemické výpočty. Návod v plném znění platí pro obory molekulární biologie, chemie, biochemie (pětihodinová a sedmihodinová cvičení). Biologické obory kromě molekulární biologie (tříhodinová cvičení): jen části C, D. Učitelské kombinace (čtyřhodinová cvičení): jen části A, C, D. PRINCIP ÚLOHY A. Spektrofotometrické stanovení bílkovin v UV oblasti Aromatická jádra aminokyselin tyrosinu a tryptofanu, které jsou obsaženy v bílkovinách, silně absorbují UV záření s absorpčním maximem v oblasti vlnových délek 275 až 290 nm, fenylalanin absorbuje slaběji s maximem v okolí vlnové délky 260 nm. (Silnou absorpci v okolí vlnové délky 260 nm vykazují nukleové kyseliny.) Celková koncentrace bílkovin ve vzorku se proto velmi často stanovuje spektrofotometricky na základě absorpce při vlnové délce 280 nm, je-li k dispozici vhodný standardní vzorek. B. Stanovení hmotnostního zlomku tyrosinu a tryptofanu v bílkovině Schopnost jednotlivých bílkovin absorbovat UV záření se velmi liší v závislosti na obsahu tyrosinu a tryptofanu, absorpční koeficient se u různých bílkovin může lišit až desetinásobně. Podíl tyrosinu a tryptofanu v bílkovině lze určit změřením absorbance vzorku se známou koncentrací bílkoviny při dvou vlnových délkách v UV oblasti (vlnová délka absorpčního maxima /280 nm/ a vlnová délka bodu, kde se absorpční spektra obou aminokyselin protínají /294 nm/) v alkalickém prostředí). Absorpci bílkovin lze měřit i při kratších vlnových délkách (např. 235 nm), kde UV světlo silně absorbují kromě tryptofanových a tyrosinových zbytků také postranné řetězce fenylalaninu, histidinu, methioninu a cysteinu a rovněž peptidové vazby. Absorpce bílkovin při velmi krátkých (kolem 200 nm) vlnových délkách je méně závislá na jejich aminokyselinovém složení, zejména při 205 nm absorbují velmi silně peptidové vazby. K dispozici je však nutné mít velmi čisté vzorky (v této oblasti spektra absorbuje mnoho různých látek včetně nečistot v destilované vodě). C. Stanovení bílkovin biuretovou metodou Při reakci biuretu (kondenzačního produktu dvou molekul močoviny) a jiných sloučenin obsahujících alespoň dvě peptidové vazby -CO-NH- s měďnatými ionty dochází v alkalickém prostředí k tvorbě barevných komplexů s centrálním atomem Cu^2+. Absorpční maximum komplexu je přibližně při vlnové délce 550 nm, jeho koncentraci lze stanovit fotometricky. Metoda je vhodná pro vzorky obsahující řádově miligramy proteinu v 1 ml. Reakci však poskytují kromě oligopeptidů (tripeptidy a vyšší) a bílkovin i některé volné aminokyseliny a sloučeniny obsahující atomová seskupení -CS-NH- nebo =CH-NH-. D. Stanovení bílkovin Folinovou metodou Metoda je založena na oxidaci postranního řetězce tyrosinu v molekulách bílkovin fosfomolybdenanem a fosfowolframanem za vzniku barevných produktů (sloučenin pětimocného molybdenu a wolframu) s absorpčním maximem při vlnové délce 745 nm, jejichž koncentraci lze stanovit fotometricky. Je citlivější než biuretová metoda a lze ji využít pro analýzu vzorků obsahujících řádově desetiny miligramu proteinu v ml. Metoda byla k různým účelům dále modifikována (podle Lowryho, podle Hartree a Lowryho), tyto modifikace se vyznačují ještě vyšší citlivostí a dodávají se komerčně v setech pro rutinní stanovení ve výzkumu i praxi. E. Stanovení bílkovin Kjeldahlovou metodou Tato metoda je referenční a současně jedinou absolutní metodou pro stanovení bílkovin. Je založena na faktu, že hmotnostní zlomek dusíku v bílkovinách je průměrně 16 % (záleží však na aminokyselinové sekvenci každé bílkoviny). Bílkovina obsažená ve vzorku se nejprve mineralizuje varem s koncentrovanou H[2]SO[4], čímž se dusík z aminoskupin a dalších funkčních skupin v bílkovinách převede na amoniak, který s přítomnou kyselinou sírovou reaguje za vzniku síranu amonného. Alkalizací mineralizovaného vzorku koncentrovaným hydroxidem sodným vzniká ze síranu amonného nestabilní hydroxid amonný NH[4]OH, který se samovolně rozkládá na NH[3] a NaOH. Uvolněný NH[3 ]se pomocí destilace s vodní parou kvantitativně předestiluje do předlohy obsahující kyselinu boritou, a to za vzniku boritanu amonného. Látkové množství této soli pak lze stanovit acidimetrickou titrací kyselinou chlorovodíkovou, kdy vzniká chlorid amonný a kyselina boritá. Dosažení bodu ekvivalence je signalizováno barevným přechodem acidobazického indikátoru Tashiro ze slabě zelené do slabě růžové. Ke standardizaci metody, při níž se snažíme eliminovat nepřesnosti při alkalizaci, destilaci a titraci, lze jednoduše použít síran amonný. Je však třeba si uvědomit, že stanovení ruší nebílkovinné látky obsahujících dusík (kromě látek s nitro-, nitroso-, azo- a hydrazoskupinami), jejichž přítomnosti ve vzorku je třeba se vyvarovat. Metoda je v této úloze přizpůsobena pro vzorky obsahující cca 0,8 - 4 mg dusíku, což odpovídá 5 - 25 mg bílkoviny. Standardní roztok síranu amonného bude v úloze podroben celé proceduře a sloužit zároveň jako slepý vzorek - kontrola na přítomnost dusíku v chemikáliích použitých při mineralizaci. PRAKTICKÁ ČÁST A. Spektrofotometrické stanovení bílkovin v UV oblasti Materiál a vybavení: 2,5 mmol.l^-1 roztok fenylalaninu (Phe), 0,25 mmol.l^-1 roztok tyrosinu (Tyr), 0,1 mmol.l^-1 roztok tryptofanu (Trp) standardní roztok bílkoviny - hovězí sérový albumin (BSA) (2,5 mg.ml^-1) neznámý vzorek pro kvantitativní analýzu (obsahuje BSA o neznámé koncentraci) hovězí krevní sérum (KS) fyziologický roztok (0,9 % chlorid sodný) zkumavky, pipety,dávkovače, odměrné baňky 10 ml a 50 ml, vortex, fotometr, UV-propustné kyvety Postup: Fotometrické stanovení bílkovin v UV oblasti. Standardní roztok BSA (2,5 mg.ml^-1) zřeďte tak, že 4 ml standardního roztoku BSA doplníte v odměrné baňce fyziologickým roztokem na objem 10 ml a dobře promícháte. Stejným způsobem zřeďte vzorek BSA o neznámé koncentraci. Vzorek krevního séra zřeďte tak, že 0,25 ml KS doplníte v odměrné baňce fyziologickým roztokem na objem 50 ml a dobře promícháte. Podle tabulky připravte jednak sadu roztoků vzorků o šesti známých koncentracích BSA k sestrojení kalibrační závislosti (zkumavky 1-6), dále 2 paralelní zkumavky se zředěným roztokem BSA o neznámé koncentraci (zkumavky 7-8) a 2 zkumavky ze zředěným roztokem KS (zkumavky 9-10). Obsah zkumavek promíchejte na vortexu. Obsah zkumavky č. 1 (fyziologický roztok - nulová koncentrace bílkoviny) použijete později jako slepý vzorek. zkumavka č. pipetovaný objem vypočtená c(BSA) [mg.ml^-1] A[280] zředěný standardní roztok BSA [ml] zředěný neznámý vzorek [ml] zředěný roztok KS [ml] fyziol. roztok [ml] 1 0,0 0,0 0,0 2,0 0,0 0,000 2 0,4 0,0 0,0 1,6 3 0,8 0,0 0,0 1,2 4 1,2 0,0 0,0 0,8 5 1,6 0,0 0,0 0,4 6 2,0 0,0 0,0 0,0 Ø A[280] 7 0,0 2,0 0,0 0,0 ? 8 0,0 2,0 0,0 0,0 ? 9 0,0 0,0 2,0 0,0 ? 10 0,0 0,0 2,0 0,0 ? Změřte absorbanci roztoků ve zkumavkách 2-10 při vlnové délce 280 nm proti slepému vzorku (zkumavka č.1). Měření provádějte v plastových kyvetách pro UV oblast. Přesahuje-li absorbance některého ze vzorků hodnotu 0,8, vzorek zřeďte v poměru 1:1 fyziologickým roztokem a naměřenou hodnotu absorbance vynásobte dvěma. Výsledky uveďte do tabulky. Studium absorpčního spektra bílkovin. Prostudujte absorpční spektra roztoků fenylalaninu, tyrosinu, tryptofanu a zředěného standardního vzorku BSA v oblasti vlnových délek 230 - 300 nm, která jsou uložena v počítači. Pro každou látku odečtěte vlnovou délku l[max] absorpčního maxima, dále hodnoty absorbance A[max] v absorpčním maximu[, ]zapište si koncentraci látky c a ze získaných dat vypočítejte hodnoty e milimolárních nebo miligramových absorpčních koeficientů (délka optické dráhy v kyvetě je vždy 1 cm). Získaná a vypočtená data uveďte do tabulky. l[max] [nm] c A[max] e (uveďte fyzikální rozměr!) Phe mmol.l^-1 Tyr mmol.l^-1 Trp mmol.l^-1 BSA mg.ml^-1 Vyhodnocení: Vypočítejte koncentrace BSA ve zkumavkách č. 2-6, výsledky doplňte do tabulky. Vypočítejte průměr absorbancí ve zkumavkách č. 7-8 a 9-10 a doplňte do tabulky. Sestrojte kalibrační graf (závislost A[280] na koncentraci BSA ve zkumavce). Z rovnice kalibrační přímky, kterou zobrazíte v grafu, pak vypočítejte koncentraci BSA ve zředěném neznámém vzorku a ve zředěném krevním séru (výpočet uveďte níže): Vypočítejte, kolikrát byl zředěn původní neznámý vzorek při přípravě zředěného neznámého vzorku a kolikrát bylo zředěno krevní sérum. Ředění neznámého vzorku: krát Ředění krevního séra : krát Tímto faktorem vynásobte koncentraci BSA ve zředěném neznámého vzorku a ve zředěném krevním séru, abyste získali koncentraci BSA v původním neznámého vzorku a v krevním séru. Výsledek: koncentrace BSA v neznámém vzorku: c = mg.ml^-1 koncentrace bílkovin v krevním séru: c = mg.ml^-1 PRAKTICKÁ ČÁST B. Stanovení hmotnostního zlomku tyrosinu a tryptofanu v bílkovině Materiál a vybavení: standardní roztok bílkoviny - hovězí sérový albumin (BSA) (2,5 mg.ml^-1) 0,2 mol.l^-1 hydroxid sodný 0,1 mol.l^-1 hydroxid sodný zkumavky, pipety, dávkovače, vortex, fotometr, UV-propustné kyvety Postup: K 1 ml standardního roztoku BSA přidejte 1 ml 0,2 mol.l^-1 roztoku NaOH a dále 3 ml roztoku 0,1 mol.l^-1 NaOH. Změřte absorbanci vzorku při vlnových délkách 280 a 294 nm proti vodě a zapište do tabulky. Měření provádějte v plastových kyvetách pro UV oblast. A[280, BSA ]: A[294, BSA]: Vyhodnocení: Pro stanovení hmotnostního zlomku Tyr a Trp v BSA si nejprve vypočítejte miligramové absorpční koeficienty (na základě tabulkových molárních absorpčních koeficientů a známé relativní molekulové hmotnosti látek)[ ], vypočtené hodnoty doplňte do tabulky. l [nm] e [mol^-1.l.cm^-1]* M[r] e [mg^-1.ml.cm^-1]* Tyr 280 1576 181,2 294 2375 Trp 280 5225 204,2 294 2375 *absorpční koeficient pro Tyr nebo Trp rozpuštěný v 0,1 mol.l^-1 NaOH Přijměte zjednodušení, že roztok BSA je směsí aminokyselin (zanedbáváme vliv uspořádaných struktur v bílkovině na absorpci UV záření aromatickými jádry aminokyselin obsažených v BSA) a vypočtěte hmotnostní koncentraci Tyr a Trp v roztoku BSA řešením soustavy 2 rovnic o 2 neznámých: A[280,BSA]= c[Tyr] . ε[280,Tyr ]+ c[Trp] . ε[280,Trp] A[294,BSA]= c[Tyr] . ε[294,Tyr ]+ c[Trp] . ε[294,Trp] Výpočet: c[Tyr ]= mg.ml^-1 c[Trp ]= mg.ml^-1 Vypočítejte koncentraci BSA ve vzorku (po zředění) a hmotnostní zlomek tyrosinu a tryptofanu v BSA: c[BSA ]= mg.ml^-1 w[Tyr ] = % w[Trp ]= % : Odpovězte na následující otázky: Kolik druhů aminokyselin obsahují (běžně) bílkoviny? Jaký je přibližný hmotnostní zlomek každé aminokyseliny v bílkovinách? (předpokládejte rovnoměrné zastoupení všech aminokyselin a jejich přibližně stejnou molekulovou hmotnost) Které aminokyseliny se nejvíce podílí na absorpci bílkovin v oblasti kolem 280 nm? Kolik % těchto aminokyselin obsahuje BSA (viz předchozí měření)? Jaký je absorpční koeficient (při 280 nm) BSA (viz část A úlohy)? Miligramový absorpční koeficient (při 280 nm) většiny bílkovin se pohybuje v rozmezí 1–5 mg^-1.ml.cm^-1 . Srovnejte s nimi miligramový absorpční koeficient BSA a rozdíl vysvětlete. PRAKTICKÁ ČÁST C. Stanovení bílkovin biuretovou metodou Materiál a vybavení: standardní roztok bílkoviny - hovězí sérový albumin (BSA) (2,5 mg.ml^-1) neznámý vzorek pro kvantitativní analýzu (obsahuje BSA o neznámé koncentraci) hovězí krevní sérum fyziologický roztok (0,9 % chlorid sodný) biuretové činidlo (roztok síranu měďnatého a vínanu sodno-draselného v hydroxidu sodném) zkumavky, pipety,dávkovače, odměrná baňka 25 ml, vortex, fotometr, kyvety Postup: Vzorek krevního séra zřeďte tak, že 0,25 ml KS doplníte v odměrné baňce fyziologickým roztokem na objem 25 ml a dobře promícháte. Podle tabulky připravte jednak sadu roztoků vzorků o šesti známých koncentracích BSA k sestrojení kalibrační závislosti (zkumavky 1-6), dále 2 paralelní zkumavky s roztokem BSA o neznámé koncentraci (zkumavky 7-8) a 2 zkumavky ze zředěným roztokem KS (zkumavky 9-10). Obsah zkumavek promíchejte na vortexu. Obsah zkumavky č. 1 (fyziologický roztok - nulová koncentrace bílkoviny) použijete později jako slepý vzorek. zkumavka č. pipetovaný objem vypočtená c(BSA) [mg.ml^-1] A[550] standardní roztok BSA [ml] neznámý vzorek [ml] zředěný roztok KS [ml] fyziol. roztok [ml] 1 0,0 0,0 0,0 2,0 0,0 0,000 2 0,4 0,0 0,0 1,6 3 0,8 0,0 0,0 1,2 4 1,2 0,0 0,0 0,8 5 1,6 0,0 0,0 0,4 6 2,0 0,0 0,0 0,0 Ø A[550] 7 0,0 2,0 0,0 0,0 ? 8 0,0 2,0 0,0 0,0 ? 9 0,0 0,0 2,0 0,0 ? 10 0,0 0,0 2,0 0,0 ? Do všech zkumavek 1-10 pipetujte vždy 0,2 ml biuretového činidla, promíchejte na vortexu a ponechejte stát 20 minut při laboratorní teplotě. Následně změřte absorbanci vzorků při vlnové délce 550 nm proti slepému vzorku (zkumavka č.1). Měření provádějte v běžných plastových kyvetách. Přesahuje-li absorbance některého ze vzorků hodnotu 0,8, vzorek zřeďte v poměru 1:1 fyziologickým roztokem a naměřenou hodnotu absorbance vynásobte dvěma. Výsledky uveďte do tabulky. Vyhodnocení: Vypočítejte koncentrace BSA ve zkumavkách č. 2-6, výsledky doplňte do tabulky. Vypočítejte průměr absorbancí ve zkumavkách č. 7-8 a 9-10 a doplňte do tabulky. Sestrojte kalibrační graf (závislost A[550] na koncentraci BSA ve zkumavce). Z rovnice kalibrační přímky, kterou zobrazíte v grafu, pak vypočítejte koncentraci BSA v neznámém vzorku a ve zředěném krevním séru (výpočet uveďte níže): Vypočítejte, kolikrát bylo zředěno krevní sérum. Ředění krevního séra : krát Tímto faktorem vynásobte koncentraci BSA ve zředěném krevním séru, abyste získali koncentraci BSA v krevním séru. Výsledek: koncentrace BSA v neznámém vzorku: c = mg.ml^-1 koncentrace bílkovin v krevním séru: c = mg.ml^-1 PRAKTICKÁ ČÁST D. Stanovení bílkovin Folinovou metodou Materiál a vybavení: standardní roztok bílkoviny - hovězí sérový albumin (BSA) (2,5 mg.ml^-1) neznámý vzorek pro kvantitativní analýzu (obsahuje BSA o neznámé koncentraci) hovězí krevní sérum (KS) fyziologický roztok (0,9 % chlorid sodný) 5 mol.l^-1 hydroxid sodný Folinovo činidlo (roztok fosfomolybdenanu a fosfowolframanu) zkumavky, pipety, dávkovače, odměrné baňky 10 ml, vortex, fotometr, kyvety Postup: Standardní roztok BSA (2,5 mg.ml^-1) zřeďte tak, že 1 ml standardního roztoku BSA doplníte v odměrné baňce fyziologickým roztokem na objem 10 ml a dobře promícháte. Stejným způsobem zřeďte neznámý vzorek BSA. Vzorek krevního séra zřeďte tak, že 0,2 ml KS doplníte v odměrné baňce fyziologickým roztokem na objem 10 ml, dobře promícháte, a z takto naředěného roztoku odeberete 1 ml, který v další odměrné baňce doplníte fyziologickým roztokem na objem 10 ml a promícháte. Podle tabulky připravte jednak sadu roztoků vzorků o šesti známých koncentracích BSA k sestrojení kalibrační závislosti (zkumavky 1-6), dále 2 paralelní zkumavky s roztokem BSA o neznámé koncentraci (zkumavky 7-8) a 2 zkumavky ze zředěným roztokem KS (zkumavky 9-10). Obsah zkumavek promíchejte na vortexu. Obsah zkumavky č. 1 (fyziologický roztok - nulová koncentrace bílkoviny) použijete později jako slepý vzorek. zkumavka č. pipetovaný objem vypočtená c(BSA) [mg.ml^-1] A[745] zředěný standardní roztok BSA [ml] zředěný neznámý vzorek [ml] zředěný roztok KS [ml] fyziol. roztok [ml] 1 0,0 0,0 0,0 2,0 0,0 0,000 2 0,4 0,0 0,0 1,6 3 0,8 0,0 0,0 1,2 4 1,2 0,0 0,0 0,8 5 1,6 0,0 0,0 0,4 6 2,0 0,0 0,0 0,0 Ø A[745] 7 0,0 2,0 0,0 0,0 ? 8 0,0 2,0 0,0 0,0 ? 9 0,0 0,0 2,0 0,0 ? 10 0,0 0,0 2,0 0,0 ? Poté do všech zkumavek 1-10 pipetujte vždy 0,2 ml 5 mol.l^-1 NaOH, promíchejte na vortexu, připipetujte 0,3 ml Folinova činidla a opět promíchejte. Po 5 minutách stání při laboratorní teplotě změřte absorbanci při vlnové délce 745 nm proti slepému vzorku (zkumavka č.1). Měření provádějte v běžných plastových kyvetách. Přesahuje-li absorbance některého ze vzorků hodnotu 0,8, vzorek zřeďte v poměru 1:1 fyziologickým roztokem a naměřenou hodnotu absorbance vynásobte dvěma. Výsledky uveďte do tabulky. Vyhodnocení: Vypočítejte koncentrace BSA ve zkumavkách č. 2-6, výsledky doplňte do tabulky. Vypočítejte průměr absorbancí ve zkumavkách č. 7-8 a 9-10 a doplňte do tabulky. Sestrojte kalibrační graf (závislost A[745] na koncentraci BSA ve zkumavce). Z rovnice kalibrační přímky, kterou zobrazíte v grafu, pak vypočítejte koncentraci BSA ve zředěném neznámém vzorku a ve zředěném krevním séru (výpočet uveďte níže): Vypočítejte, kolikrát byl zředěn původní neznámý vzorek při přípravě zředěného neznámého vzorku a kolikrát bylo zředěno krevní sérum. Ředění neznámého vzorku: krát Ředění krevního séra : krát Tímto faktorem vynásobte koncentraci BSA ve zředěném neznámého vzorku a ve zředěném krevním séru, abyste získali koncentraci BSA v původním neznámého vzorku a v krevním séru. Výsledek: koncentrace BSA v neznámém vzorku: c = mg.ml^-1 koncentrace bílkovin v krevním séru: c = mg.ml^-1 Souhrn výsledků: koncentrace bílkoviny ve vzorku BSA o neznámé koncentraci zjištěná fotometricky při l=280 nm: c = mg.ml^-1 zjištěná biuretovou metodou c = mg.ml^-1 zjištěná Folinovou metodou c = mg.ml^-1 Souhrn výsledků: koncentrace bílkoviny v krevním séru zjištěná fotometricky při l=280 nm: c = mg.ml^-1 zjištěná biuretovou metodou c = mg.ml^-1 zjištěná Folinovou metodou c = mg.ml^-1 Pokuste se o vysvětlení rozdílů mezi výsledky stanovení koncentrací bílkoviny v tomtéž vzorku různými metodami. Kromě případných experimentálních chyb hledejte příčiny v chemických principech jednotlivých metod. Kterou z použitých metod považujete za nejpřesnější? PRAKTICKÁ ČÁST E. Stanovení bílkovin Kjeldahlovou metodou Tato část cvičení bude provedena demonstračně. KONTROLNÍ LIST jméno: obor: datum provedení: neznámý vzorek pro kvantitativní analýzu a b c d e f g h (zakroužkujte) ÚLOHA 3A ÚLOHA 3C ÚLOHA 3D zkumavka č. A[280] A[550] A[745] 1 0,000 0,000 0,000 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Podpis vedoucího cvičení: ÚLOHA 3A l[max] [nm] c A[max] Phe mmol.l^-1 Tyr mmol.l^-1 Trp mmol.l^-1 BSA mg.ml^-1 Podpis vedoucího cvičení: ÚLOHA 3B A[280, BSA ]: A[294, BSA]: Podpis vedoucího cvičení: