jméno: obor: datum provedení: OKRUHY K PŘÍPRAVĚ Enzymy, klasifikace enzymů. Enzymové reakce. Substrát, produkt. Amylasová, lipasová, proteasová, nitrátreduktasová a nitritreduktasová reakce. Návod v plném znění platí pro obory molekulární biologie, chemie, biochemie (pětihodinová a sedmihodinová cvičení). Biologické obory kromě molekulární biologie (tříhodinová cvičení): část A. Učitelské kombinace (čtyřhodinová cvičení): část A. ÚVOD Enzymy jsou převážně jednoduché či složené bílkoviny* s katalytickou aktivitou. Enzymy určují povahu i rychlost chemických reakcí a řídí většinu biochemických procesů. Základní složkou enzymů jsou proteiny, na něž se velmi často vážou další přídatné molekuly - kofaktory nebo prostetické skupiny, které se podílí na katalýze. Samotná enzymatická reakce probíhá obvykle v tzv. aktivním místě enzymu. Enzymy obvykle přeměňují jeden nebo několik málo substrátů, a to jedním definovaným způsobem. Aktivita enzymů, spočívající v ovlivnění rychlosti chemických reakcí snižováním jejich aktivační energie, je závislá zejména na koncentraci substrátu, teplotě, pH a přítomnosti aktivátorů a inhibitorů. V buňkách se enzymy vyskytují buď volně v cytoplazmě, nebo vázané na buněčné struktury (membrány). K svému účinku vyžadují určitou optimální teplotu a pH. Enzymy se dělí do šesti hlavních kategorií: * EC 1 – oxidoreduktázy: katalyzují oxidačně/redukční reakce * EC 2 – transferázy: přenášejí funkční skupiny * EC 3 – hydrolázy: katalyzují hydrolýzu chemických vazeb * EC 4 – lyázy: štěpí chemické vazby jiným způsobem než hydrolýzou či redoxní reakcí * EC 5 – izomerázy: katalyzují isomerizační reakce * EC 6 – ligázy: spojují dvě molekuly kovalentní vazbou *některé molekuly RNA mohou také vykazovat enzymovou aktivitu CÍL PRÁCE A) Trávicí enzymy pankreatické šťávy Slinivka břišní (pankreas) je žláza, která patří mezi orgány trávicí soustavy. V slinivce se produkuje řada enzymů, z nichž nejdůležitější jsou: * amylasy – hydrolyzují polysacharidy, nejvýznamnější je alfa-amylasa štěpící škrob na maltosu (stejné účinky má slinná amylasa) * lipasy – hydrolyzují tuky na glycerol a mastné kyseliny * proteasy (především trypsin a chymotrypsin) - hydrolyzují bílkoviny na oligopeptidy, případně až na aminokyseliny Souhrnně je nazývána směs těchto enzymů pankreatická šťáva, která je odváděna systémem vývodů ze slinivky do dvanáctníku. Zde se setkávají s tráveninou předzpracovanou v žaludku a podílejí se na jejím dalším trávení. V úloze bude používána suspenze Pancreatinu (extrakt vepřového pankreatu) nebo sliny jako zdroj trávicích enzymů a bude sledována jejich aktivita za různých podmínek. Aktivitu amylasy lze sledovat jednak jako úbytek substrátu (škrobu) – např. detekcí škrobu Lugolovým roztokem, jednak jako přírůstek produktu (maltosy), např. reakcí maltosy s Fehlingovým činidlem. Aktivitu lipasy lze sledovat nejsnáze jako přírůstek jednoho z produktů – mastných kyselin, které mění (snižují) pH reakčního prostředí. (Okyselení reakčního prostředí zaznamená vhodný acidobazický indikátor, v této úloze fenolová červeň.) Aktivita proteas bude v této úloze sledována jako úbytek substrátu (bílkoviny) pomocí biuretové reakce. B) Bakteriální enzymy denitrifikační dráhy Prokaryotní organismy syntetizují nepřeberné množství enzymů, které se u vyšších organismů nevyskytují. Patří k nim například enzymy nitrátové respirace produkované denitrifikačními bakteriemi - nitrátreduktasa, nitritreduktasa, reduktasy oxidů dusíku (konečným produktem nitrátové respirace je volný dusík). Tyto enzymy jsou obvykle syntetizovány za anaerobních podmínek kultivace bakterií. V úloze bude používána suspenze anaerobně kultivovaných bakterií Paracoccus denitrificans a sledováno působení enzymů nitrátreduktasy (redukuje dusičnany na dusitany) a nitritreduktasy (redukuje dusitany na oxidy dusíku – oxid dusnatý a oxid dusný). Rovněž bude sledován vliv antimycinu A na aktivitu nitritreduktasy. K nejsnáze detekovatelným meziproduktům denitrifikace patří dusitanový anion tvořící v kyselém prostředí s řadou vhodných činidel barevné kopulační produkty. V této úloze bude k detekci dusitanu používán sulfanilamid a N-(1-naftyl)-ethylendiamin dihydrochlorid (NED), v jejichž přítomnosti poskytuje dusitan výrazné fialovočervené zbarvení. PRAKTICKÁ ČÁST A) Trávicí enzymy pankreatické šťávy, slinná amylasa Materiál a vybavení: suspenze Pancreatinu (2 % vodný roztok) 60 mmol.1^-1 Tris-Cl pufr s přídavkem 30 mmol.1^-1 chloridu vápenatého, pH 8,2 1 % roztok škrobu 1 % roztok želatiny plnotučné nebo polotučné mléko Lugolův roztok Fehlingovo činidlo I (roztok síranu měďnatého) Fehlingovo činidlo II (roztok vínanu sodno-draselného v hydroxidu sodném) 0,1 % roztok fenolové červeně ve 20 % etanolu 10 % hydroxid sodný 1 % síran měďnatý 0,2 mol.1^-1 uhličitan sodný 5 mol.1^-1 kyselina chlorovodíková 5 mol.1^-1 hydroxid sodný zkumavky, pipety, dávkovače,kahan a trojnožka nebo vařič, hrnec, držák na zkumavky nebo kruhový stojan na zkumavky, ledová lázeň, kádinky, Pasteurovy pipety, vortex, termostat, stopky EXPERIMENT 1 – alfa-amylasová reakce Do zkumavek A a B pipetujte 1 ml Tris-pufru a 1 ml roztoku škrobu, promíchejte. Z obou zkumavek odeberte po 0,5 ml vzorku a přidejte k němu 10 - 20 µl Lugolova roztoku (odběr v čase 0 minut). Do tabulky zaznamenejte zbarvení vzorků po přidání Lugolova roztoku. Obě zkumavky obsahující pufr a škrob vložte do termostatu temperovaného na 37 °C, temperujte je přibližně 5 minut. Pak do zkumavky A pipetujte 1 ml vlastních slin, do zkumavky B pipetujte 1 ml destilované vody, obsah zkumavek promíchejte a zkumavky vraťte do termostatu. Po 60 minutách (zkumavky občas promíchejte a vraťte do termostatu) odeberte z obou zkumavek po 0,5 ml vzorku a přidejte k němu 10 - 20 µl Lugolova roztoku (odběr v čase 60 minut). Do tabulky zaznamenejte zbarvení vzorků po přidání Lugolova roztoku. Ze zkumavek A a B nakonec odeberte po 0.5 ml vzorku, přidejte 0,5 ml Fehlingova činidla I a 0,5 ml Fehlingova činidla II. Opatrně povařte na vodní lázni a pozorujte, ve které zkumavce je reakce pozitivní. Zaznamenejte zbarvení vzorků (pro lepší sledování vybarvení můžete vzorky nakapat na skleněnou desku položenou na filtračním papíře, kapky vzorků případně ještě zřeďte přikápnutím vody): čas (min.) 0 zbarvení vzorku po přidání Lugolova roztoku 60 zbarvení vzorku po přidání Lugolova roztoku 60 zbarvení vzorku po Fehlingově reakci zkumavka A zkumavka B Odpovězte: Pozitivní reakce (tmavé – černé, tmavomodré až tmavohnědé zbarvení) s Lugolovým roztokem dokazuje přítomnost …………………………………… Pozitivní reakce (hnědočervené zbarvení) s Fehlingovým činidlem dokazuje přítomnost …………………………………… Amylasová reakce probíhala ve zkumavce …….., důvod:……………………………………………………….. Substrátem alfa-amylasy je …………….……..……………………………………..….……….... Jedná se látku (vysokomolekulární – nízkomolekulární)………………………...……… Produktem alfa-amylasové reakce je/jsou ……………………………………………………. Jedná se látku/látky (vysokomolekulární – nízkomolekulární)……….….…………… Alfa-amylasa patří do kategorie (skupiny) enzymů………………………………….……… EXPERIMENT 2 – lipasová reakce Ke 20 ml mléka přidejte 10 kapek roztoku fenolové červeně a mléko opatrně zneutralizujte 0,2 mol.1^-1 uhličitanem sodným (asi 1 ml – nepředávkovat!) do růžového zbarvení. Do dvou zkumavek A a B napipetujte po 5 ml neutralizovaného mléka. (Tyto zkumavky budou sloužit jako referenční vzorky pro sledování pro změny zbarvení vzorku, v němž bude probíhat enzymová reakce.) Do zkumavky B přidejte 0,2 ml 5 mol.1^-1 kyseliny chlorovodíkové, promíchejte (vzniká žluté zbarvení). Do zkumavek C, D a E pipetujte 2 ml neutralizovaného mléka. Zkumavku C inkubujte cca 5 minut v termostatu temperovaném na 37 ^oC. Zkumavku D vložte na cca 5 minut do ledové lázně. Zkumavku E vložte do horké vody (která prošla varem – cca 80 ^oC). Do zkumavek C, D, a E přidejte 1 ml suspenze Pancreatinu, obsah zkumavek promíchejte a vraťte je do termostatu, resp. ledové nebo horké lázně. Pozorujte změnu zbarvení (mléko občas promíchejte a srovnávejte jeho zbarvení s referenčními vzorky) cca 30 – 60 minut. Odpovězte: Změna zbarvení neutralizovaného mléka (růžová → žlutá) dokazuje přítomnost ……………………………….. Ve zkumavce C se zbarvení změnilo – nezměnilo …………………. důvod: ………………….…………… Ve zkumavce D se zbarvení změnilo – nezměnilo …………………. důvod: ………………….…………… Ve zkumavce E se zbarvení změnilo – nezměnilo …………………. důvod: ……………………..………… Substrátem lipasy je …………………..……………………….……………………………………... Jedná se látku (vysokomolekulární – nízkomolekulární)…………………….………… Produktem lipasové reakce je/jsou ………………………………………………………………. Jedná se látku/látky (vysokomolekulární – nízkomolekulární)……….……………… Lipasa patří do kategorie (skupiny) enzymů………………………….…………………..…… EXPERIMENT 3 – proteasová reakce Do každé ze čtyř zkumavek A až D napipetujte 2,5 ml Tris-pufru a 2 ml roztoku želatiny. Do zkumavky A přidejte 0,5 ml destilované vody, do zkumavky B 0,5 ml 5 mol.1^-1 kyseliny chlorovodíkové, do zkumavky C 0,5 ml 5 mol.1^-1 hydroxidu sodného. Do těchto tří zkumavek A až C zkumavek přidejte 1 ml suspenze Pancreatinu, obsah zkumavek promíchejte a inkubujte je cca 60 minut v termostatu temperovaném na 37 ^oC. Do zkumavky D pipetujte 1,5 ml destilované vody, rovněž ji inkubujte cca 60 minut při teplotě 37 ^oC. Biuretová reakce: Po uplynutí cca 60 minut odeberte z každé zkumavky 1 ml vzorku do čistých zkumavek A´ až D´, ke vzorkům přidejte 1 ml roztoku 10 % NaOH, přidejte několik kapek roztoku síranu měďnatého (jeho nadbytek vadí, neboť vzniklý hydroxid měďnatý překrývá svým zbarvením zbarvení měďnatého komplexu bílkoviny) a promíchejte. Pozorujte rozdíly ve zbarvení jednotlivých vzorků zejména proti kontrolnímu vzorku ve zkumavce D´. Rozdíly zbarvení vyniknou při pohledu do zkumavek shora, proti bílému pozadí (filtrační papír). Jestliže nejsou rozdíly ve zbarvení pozorovatelné, temperujte původní zkumavky A až D obsahující reakční směs dalších cca 60 minut a znovu proveďte biuretovou reakci. Odpovězte: Pozitivní biuretová reakce (fialové zbarvení) dokazuje přítomnost ……………………………….. Zbarvení vzorku ve zkumavce A´…………………. důvod: ………………….…………… Zbarvení vzorku ve zkumavce B´…………………. důvod: ………………….…………… Zbarvení vzorku ve zkumavce C´…………………. důvod: ……………………..………… Zbarvení vzorku ve zkumavce D´…………………. důvod: ……………………..………… Substrátem proteas je …………………..……………………….………………………..…….... Jedná se látku (vysokomolekulární – nízkomolekulární)…………………..………… Produktem proteasové reakce je/jsou ………………………………………………………. Jedná se látku/látky (vysokomolekulární – nízkomolekulární)………….………… Proteasy patří do kategorie (skupiny) enzymů………………………….………………… A) Bakteriální enzymy denitrifikační dráhy Materiál a vybavení: suspenze anaerobně kultivovaných buněk P. denitrificans 0,2 mol.1^-1 fosfátový pufr, pH 7 0,2 mol.1^-1 jantaran sodný (pH 7) 100 mmol.1^-1 dusičnan sodný 10 mmol.1^-1 dusitan sodný 1 % sulfanilamidd v HCl 0,1 % NED (N-(1-naftyl)-ethylendiamin dihydrochlorid) antimycin A, roztok 1 mg/ml ethanolu zkumavky, pipety, dávkovače, odměrné zkumavky – objem 10 ml, stopky EXPERIMENT 4 – nitrátreduktasová a nitritreduktasová reakce Ve zkumavkách A, B, C a D s objemem 5 ml smíchejte vždy 2,55 ml fosfátového pufru, 1,25 ml roztoku jantaranu a 1,125 ml vody. Přidejte 0,125 ml suspenze bakterií P. denitrificans, obsah zkumavek promíchejte obrácením na zátku (tak, aby se zbytečně neprokysličoval). Zkumavky nechejte stát 20 – 30 minut při laboratorní teplotě. Nachystejte si čtyři sady po 13 zkumavkách obsahujících 0,1 ml roztoku sulfanilamidu. Do zkumavky A přidejte 0,2 ml 10 mmol.1^-1 roztoku dusitanu sodného a obsah zkumavky opatrně promíchejte převrácením na zátku. Do zkumavky B přidejte 0,2 ml 10 mmol.1^-1 roztoku dusitanu sodného, 10 µl roztoku antimycinu A a obsah zkumavky opatrně promíchejte převrácením na zátku. Do zkumavky C přidejte 0,2 ml 100 mmol.1^-1 roztoku dusičnanu sodného a obsah zkumavky opatrně promíchejte převrácením na zátku. Do zkumavky D přidejte 0,2 ml 100 mmol.1^-1 roztoku dusičnanu sodného, 10 µl roztoku antimycinu A a obsah zkumavky opatrně promíchejte převrácením na zátku. Z každé zkumavky A, B, C a D ihned po promíchání (je nutná spolupráce dvou osob) odeberte 0,2 ml vzorku a přeneste jej do zkumavek obsahujících roztok sulfonamidu (odběr v čase 0). (Optimální je pracovat se čtyřmi dávkovači - pokud nejsou k dispozici, vyměňujte na jednom dávkovači čtyři označené špičky.) Po cca 4 minutách přidejte ke vzorkům po 0,1 ml roztoku NED. Další vzorky ze zkumavek A až D odebírejte v intervalu 5 minut (viz tabulka). Po cca 4 minutách (tedy chvíli před dalším odběrem vzorků ze zkumavek A až D) přidejte ke dříve odebraným vzorkům obsahujícím sulfanilamid po 0,1 ml roztoku NED. Pozorujte vznik červenofialového zbarvení (zbarvení se vyvíjí cca 5 - 10 minut). Zaznamenejte zbarvení vzorků cca 5 - 10 minut po přidání NED: čas 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 zkumavka A zkumavka B zkumavka C zkumavka D Odpovězte: Pozitivní reakce (červené zbarvení) dokazuje přítomnost ……………………………….. Sledování aktivity nitritreduktasy: popište děj ve zkumavce A*: ……………………………………………………………………………………. popište děj ve zkumavce B*: ……………………………………………………………………………………. Zdůvodněte rozdíl (popište vliv antimycinu A na aktivitu nitritreduktasy): ……………………………………………………………………………………………………………………………….. Sledování společného průběhu nitrátreduktasové a nitritreduktasové reakce: popište děj ve zkumavce C*: ……………………………………………………………………………………. popište děj ve zkumavce D*: ……………………………………………………………………………………. Zdůvodněte rozdíl (popište vliv antimycinu A – pro interpretaci výsledků dějů ve zkumavkách C a D využijte poznatek získaný sledováním dějů ve zkumavkách A a B): ……………………………………………………………………………………………………………………………….. *Popisujte skutečně děje v inkubačních zkumavkách A,B,C,D (nikoliv změny zbarvení v detekčních zkumavkách), buďto slovně nebo pomocí chemických rovnic. Napište společné schéma nitrátreduktasové a nitrireduktasové reakce, vyznačte místo působení antimycinu A: ………………………………… Substrátem nitrátreduktasy je …………………..……………………….…………………………….... Jedná se látku (vysokomolekulární – nízkomolekulární)………………………… Produktem nitrátreduktasové reakce je/jsou ………………………………………………………………. Jedná se látku/látky (vysokomolekulární – nízkomolekulární)……….……………… Nitrátreduktasa patří do kategorie (skupiny) enzymů………………………….…… Substrátem nitritreduktasy je …………………..……………………….…………………………….... Jedná se látku (vysokomolekulární – nízkomolekulární)………………………… Produktem nitritreduktasové reakce je/jsou ………………………………………………………………. Jedná se látku/látky (vysokomolekulární – nízkomolekulární)……….……………… Nitritreduktasa patří do kategorie (skupiny) enzymů………………………….………