Speciální metody Petr Zbořil Speciální metody • •Zákalové –Turbidimetrie –Nefelometrie •Reflexní fotometrie •Další – difrakce apod. – dále Rozptyl světla •Rozptyl – koloidní roztoky, suspense (Tyndallův efekt) –lom a odraz na částicích –λ se nemění, ale ovlivňuje intensitu rozptylu •Homogenní – ideální kapalina •Nehomogenity – reálné kapaliny, roztoky – fluktuace –světlo se polarizuje •Prošlé světlo se zeslabí jak absorpcí (nemusí být žádná), tak rozptylem (Σ Eo = Σ Ep + Σ Er + Σ Ea) • •Ir = f (ν4) Rayleigh • •modré se rozptyluje víc – bílé světlo mění barvu • Turbidimetrie •Turbidimetrie – měření prošlého světla • • turbidance T = log (I0/I) = k . c . l . d3 / (d4 + α. λ4) • •k – povaha částic, způsob měření, d – průměr částic, α – závisí na metodě • •Obdoba L-B zákona (parametry konstantní) –odchylka k ose c, není-li monochromatické světlo • •Měření spektrofotometry –vysoká citlivost, obtížná reprodukovatelnost • Nefelometrie •Nefelometrie – měření rozptýleného světla –jednoduché –složité provedení (určování velikosti a tvaru částic) • •Měření –nefelometrický nástavec k fotometru, světlo se sleduje pod úhlem 90° –speciální přístroje - nefelometry – automatická měření • Nefelometrie •Konvenční nefelometry –zdrojem halogenová žárovka nebo xenonová výbojku –interferenční filtr –detektor je nastaven pod úhlem 70 až 90° (stupeň směrovosti světla z konvenčního zdroje je nízký) •Laserový nefelometr –zdrojem je helium-neonový laseru –monochromatické světlo mimořádně intenzivní a má vysoký stupeň směrovosti –detektor nastaven pod úhlem 5 až 35° •Nefelometry mohou měřit také rychlost změny rozptylu světla - kinetiku, která je přímo úměrná rychlosti vzniku imunokomplexu antigen-protilátka. • • Schema přístroje •Turbidimetr a nefelometr nefelometry Reflexní fotometrie •Odraz světla od povrchu •Závisí na typu povrchu –Lesklé x matné, kovy x textil, papír –Svrchní vrstva x spodní –Charakter povrchu – dílčí plošky –Výběr dle účelu – typ odrazu –Speciální užití – fyzika kovů, papírenství, scannery –(Bio)chemie – jednoduchý odraz x vícevrstevný Reflexní fotometrie •Jednoduchý odraz první vrstvou – charakter povrchu – lesklý x matný • • Reflexní fotometrie •Rozložení intenzit • • Reflexní fotometrie •Jednoduché schema –Volba úhlu podle povrchu – ev. naopak Reflexní fotometrie •Schema přístroje s vydutým zrcadlem Reflexní fotometrie •Schema přístroje pro diferenční reflektometrii Reflexní fotometrie •Měření odraženého světla prvním povrchem •Reflektance –R = Io/Id –Závisí na n, k(absorpce), Q, polarizaci •Využití v biochemii –Semikvantitativní analýza – kalibrace –Vyhodnocení neprůhledných matric (elfo, papír) –Reakce suché chemie • Reflexní denzitometr •Přístroj na vyhodnocení proužků – analýza moči •Využití –urobilinogen –bilirubin –ketolátky –krev –bílkovina –nitrity –leukocyty –glukóza –specifická hmotnost –pH –kyselina askorbová - pouze proužky URISTIK H11 –mikroalbumin - pouze proužky URISTIK H11-MA Reflexní fotometrie •ELISA Denzitometrie - transmisní •Denzitometry –Žárovka s filtrem, LED –Vyduté zrcadlo – soustředění paprsků na detektor –Skleněná vlákna –Scanner – filmy •Využití v biochemii –Semikvantitativní analýza –Vyhodnocení průhledných matric (elfo, gely) –Reakce suché chemie • Denzitometrie - transmisní •Schema přístroje • Denzitometrie listových barviv • • •