C6200-Biochemické metody 11A_NMR a EPR Petr Zbořil Nukleární magnetická rezonance •Jádra vykazující nenulový jaderný spin (závisí na počtu protonů a neutronů) mají magnetický moment a orientují se v externím magnetickém poli. •Spin může nabývat několika orientací v závislosti na své hodnotě – vyjádřeny magnetickým číslem mI •Počet možných hodnot mI: n = 2I + 1, kde I je spinové kvantové číslo (jaderný spin) o hodnotách 0, ½, 1 …. •Hodnoty magnetického čísla mI Î I, I – 2I, Î -3/2, -1, -½, 0, ½, 1, 3/2 … • NMR-energStavy Rozdělení jader •Jádra o I = ½ –Nenulový jaderný magnetický moment, snadno měřitelná –1H a další viz tab. •Citlivost - vysoké přírodní zastoupení •I > ½ –Nenulový jaderný magnetický moment, měřitelná –Kvadrupolový moment – obtíže při měření –Liché nukleonové číslo •I poločíselná (3/2, 5/2 atd.) –Sudé nukleonové a liché protonové číslo •I celočíselná (1, 2 atd.) •I = 0 –Sudý počet p i n – 12C, 16O apod. –Nulový magnetický moment, neaktivní – NMR •Jaderný magnetický moment M = g √I(I+1) h / 2π –h je Planckova konstanta –g je tzv. gyromagnetický poměr, typický pro dané jádro •g = gI.e./2m (rozlišovací faktor, náboj a hmotnost jádra) •V magnetickém poli precese n0 = g B0/2π –Výsledek interakce magnetických momentů –n0 – Larmorova precesní frekvence •Orientace Mz= M.cosθ = g mI h/2π • Nukleární magnetická rezonance Magnetický moment rotujícího jádra M M = gIh/2p g gyromagnetický poměr precess Umístění rotujícího magnetu v elektrickém poli Frekvence precesní rotace: no = g Bo Bo – indukce magnetického pole no – Larmorova frekvence Pro H – 200 MHz při 4,7 T atd. Označení přístrojů – 200, 300, atd. Nukleární magnetická rezonance •Velikost magnetického momentu M, gyromagnetický poměr g, jaderný magneton μ, Planckova konstanta (Ћ = h/2Π) a rozlišovací faktor gI a hmotnost jádra m a jeho náboj e jsou ve vztahu • M = g.Ћ.√I(I+1) g = μ.gI/ Ћ μ = e. Ћ/2m • •A ten určuje energii jednotlivých orientací v magnetickém poli intensity Bo •EI = - Mz . B0 + E0 Mz = g.Ћ.mI • •Kde magnetické kvantové číslo mI ≡ I, (I-1) ... -(I-1), -I, počet 2I+1 E stavů • • Pro I = ½, mI = ± ½ • •a energetický rozdíl mezi jednotlivými stavy (orientacemi vektoru Mz) je • • • ΔE = g.Ћ.(1/2) B0 - g.Ћ.(-1/2) B0 = g.Ћ. B0 = h.n • Nukleární magnetická rezonance nmrflip Rozdíl mezi dvěma energetickými hladinami DE = g.Ћ. B0 = h no pokud působíme elmg. polem o frekvenci n1 = n0 Dojde k rezonanci a přechodu na vyšší hladinu Bo M B1 Nukleární magnetická rezonance • Nukleární magnetická rezonance (B = 2,3 T) Jádro I no (MHz) citlivost % zastoupení 1H ½ 100 1 99,9 13C ½ 25 0,016 1 15N 1 10 0,001 0,36 19F ½ 94 0,8 100 31P ½ 40 0,067 100 17O 5/2 13 0,003 0,04 Nukleární magnetická rezonance Stínění jádra – chemické posuny espin H+ H B = B0 – sB0 s = (B - B0) / B0 (x 106 ) d = 10 – s t d chemický posun (ppm) Chemický posun Stínění a chemický posun Standart pro 1H-NMR •Tetrametylsilan •- jediná 1H linie snadno •rozpoznatelná •- singletový signál nejvíce vpravo •- přidává se přímo k vzorku •- po skončení měření ho lze mírným zahřátím ze vzorku odstranit • Nukleární magnetická rezonance Chemické posuny CH3 1 CH2 1,5 R2NH 0,5-2 RNH2 1,5 ArCH3 2,5 -C=CH 3 Ar-NH2 3,5 – 4,5 X-CH3 2,5 – 3,5 R-O-CH3 4 =C=CH2 5 ArH 7-8 RCOH 10 RCOOH 10-12 Nukleární magnetická rezonance Spin-mřížková relaxace Jádro v excitovaném stavu se zbavuje energie relaxací Relaxační čas (střední doba života jader v excitovaném stavu) – t = 10-1 – 102 s mz-t Nukleární magnetická rezonance etohnmr Multiplicita signálu – spin-spinová interakce etoh Multiplicita = n+1 (x + 1)n Nukleární magnetická rezonance etohnmr • Využití NMR •Struktura a její změny •chemický posun δ – chemické okolí jádra, typ skupiny •Multiplicity a interakční konstanty J - počet sousedních magneticky aktivních jader a geometrických uspořádání •Integrální intenzity signálů - počet ekvivalentních atomů v molekule •Korelační signály atp. • Nukleární magnetická rezonance •Způsob měření –Absorpční –Relaxační •Proměnné –n při konstantním B0 – B0 při konstantním n Nukleární magnetická rezonance Přístrojové vybavení NMRspektroskop Bo B1 VF D Nukleární magnetická rezonance magnet magnet1 c-mag-2 Supravodivý magnet 7 T Nukleární magnetická rezonance vzorek1 Vzorek – homogenizace pole vzorek2 vozrek3c vozrek3 vzorek3a vozrek1b vozrek1a vzorek2b vzorek2c Nukleární magnetická rezonance 400mhz Volba přístroje 100mhz Nukleární magnetická rezonance Magnetické pole Magnetické pole Metoda continuous wave (CW) – konstantní frekvence – mění se Bo Nukleární magnetická rezonance Magnetické pole Frekvence Metoda continuous wave (CW) – konstantní Bo – mění se frekvence Nukleární magnetická rezonance fourrier Fourrierova transformace Fourrier-Puls Nukleární magnetická rezonance Rozpouštědla – Deuterovaná Acetone CD3COCD3 Chloroform CDCl3 Methylnitrile CD3CN Water D2O Diethylether (DEE) (CD3CD2)2O Dimethyl Sulfoxide (DMSO) CD3SOCD3 Ethanol CD3CD2OD Atd. Nukleární magnetická rezonance signal1 signal Signal-to noise ratio Nízká a vysoká koncentrace Nukleární magnetická rezonance sweepen • Nukleární magnetická rezonance tolue-dc et-bz-dc aceto-dc 1proh-dc Nukleární magnetická rezonance mek-clf 2proh-dc tbute-dc 2buoh-dc Nukleární magnetická rezonance- 13C Carbon-13Chemical Shifts Carbon-13* Environment Chemical Shift Range (ppm) CH3CH2 0-50 -C=C- 60-100 =C-X 70-170 C6H6 65 CHCl CHCl (cis) 71 Ar 120-150 CCl4 97 COOR 170 COH 210 RCOR 220 bond-2 Nukleární magnetická rezonance-15N Nitrogen-14 Chemical Shifts Nitrogen-14* Environment Chemical Shift Range (ppm) NO2Na -355 NO3- (aqueous) -115 N2 (liquid) -101 pyridine -93 bare nucleus 0 CH3CN 25 CH3CONH2 (aqueous) 152 NH4+ (aqueous) 245 NH3 (liquid) 266 ref Nukleární magnetická rezonance- 31P Phosphorous-31 Chemical Shifts Phosphorous-31 Environment Chemical Shift Range (ppm) PBr3 -228 (C2H5O)3 P -137 PF3 -97 85% phosphoric acid 0 PCl5 80 PH3 238 P4 450 ref Nukleární magnetická rezonance- 31P priklad Nukleární magnetická rezonance- 31P hypoxie Nukleární magnetická rezonance- 31P pH Měření intracelulárního pH Pomocí posunu signálu 31P Nukleární magnetická rezonance- 31P Měření koncentrace nukleotidů Pomocí 31P ATP Nukleární magnetická rezonance- 13C glykjogen1 glycogen Nukleární magnetická rezonance – 15N NMR-dusík Asimilace amoniaku sledovaná pomocí 15N Hlíva ústřičná Extrakt mycelia narostlého na 15NH4Cl Mycelium 1 hod. po přidání 15NH4Cl EPR - ESR • •Zde výtah pro základní pochopení • •Pro zájemce o bližší seznámení • •http://cheminfo.chemi.muni.cz/ianua/epr/index.htm EPR – elektronová spinová rezonance B=0 E B DE Rezonanční pole ms = -1/2, paralelní s polem ms = +1/2, antiparalelní Nepárový elektron – nenulový spin – /S/ = 1/2 Orientace – + - , energetické stavy EPR – elektronová spinová rezonance • EPR – elektronová spinová rezonance DE = hn = gmBo DE rozdíl energií h – Planckova konstanta n– frekvence mikrovln n g – Landéův faktor spin-orbitální interakce m – Bohrův magneton Bo – magnetická indukce Počet jader v jednotlivých orientacích Intenzita signálu N1/N2 = e -DE/kT Bo = 0,1 – 0,5 T; n = 10 -100 GHz EPR – elektronová spinová rezonance •Absorpce fotonů – MW oblast • n = f (B0) • změna n nebo B0 – častější • spektrum základní • derivace – standartně • EPR – elektronová spinová rezonance I Bo dI/dB Bo EPR – elektronová spinová rezonance Interakce s protony – štěpení píků 1 proton I = ½ multiplicita = n (protonů ev. 2nI jádra) + 1, intenzita píků (x + 1)n platí pro ekvivalentní jádra (jinak složitější) n = 1 – 1:1 n = 2 – 1:2:1 n = 3 – 1:3:3:1 EPR – elektronová spinová rezonance Využití v biochemii - Studium radikálů (peroxidy) - Studium konformace – spinové značky – stabilní radikály - Studium hemu EPR - schema • EPR - měření • EPR – elektronová spinová rezonance radikal radikal1 EPR – elektronová spinová rezonance EPR-rad EPR spektrum NADH-UQ reduktasy signál UQ Signál 2Fe2S potlačen, Signál FMN radikálu interferuje EPR – elektronová spinová rezonance EPR-ferredox EPR spektrum ferredoxinu z mořské řasy (3Fe-4S)1+/0 Typický signál EPR – elektronová spinová rezonance EPRspektrum EPR spektrum cyt bc1 – mutant M183K, M183H Fe3+ hem (3,78 = cyt bL 3,44, cyt bH, 2,94 bis-His cyt b nebo c1) EPR – elektronová spinová rezonance EPR-LP EPR spektrum oxidace radikálů LDL vyvolaných H2O2 Spektrum radikálu tokoferolu (A)