•Zipper typ – Jun-Fos •Helix-turn-helix – H1, TALEN •Zinkový prst – genome editing, GAL4 • • • • • • •Histon, HMG-box • • b-barrel • b-hairpin/ribbon • Smíšené a/b TFIIB RNA pol II TBP Rpb4/7 TFIIA TFIIE TFIIF •Velký žlábek má velikost odpovídající rozměrům a-šroubovice a má exponované vazebné skupiny •Nejčastěji interaguje Arg (pozitivní náboj + vodíkové vazby) TBP Průběh transkripce –> enhanceosom –> skládání komplexů [USEMAP] - histony vážou DNA sekvenčně nespecificky - histonové podjednotky (H2A, H2B, H3, H4) obsahují svazky 3-4 šroubovic skládaných proti sobě (histon fold) - DNA se obtáčí kolem válcovitého oktameru (2x4 histony) - šroubovice se vážou na cukrfosfátovou kostru DNA 3AFA [USEMAP] H3-H4 dimer Histon fold Povrch/kontakt tvoří lysiny a argininy [USEMAP] - H3-H3 interakce = (H3-H4)2 tetramer [USEMAP] [USEMAP] - H3-H3 interakce = (H3-H4)2 tetramer – vazba na DNA [USEMAP] - H3-H3 interakce = (H3-H4)2 tetramer - dimery H2A-H2B (H2A – váže H3) [USEMAP] - H3-H3 interakce = (H3-H4)2 tetramer - dimery H2A-H2B (H2A – váže H3) 3AFA [USEMAP] [USEMAP] McGinty a Tan, Chem Rev, 2015 H2A/H2B váže dvě vlákna H3/H4 váže jedno vlákno, ale silněji (více objímá – větší kontaktní povrch) [USEMAP] Konce histonů - N- a C-konce histonů vybíhají z jádra nukleosomu a ovlivňují jeho vazbu - modifikace (např. acetylace) mohou oslabit interakce s DNA a rozvolnit nukleosom – mohou vázat jiné proteiny (např. bromodoména) 1KX5 [USEMAP] Konce histonů - N- a C-konce histonů vybíhají z jádra nukleosomu a ovlivňují jeho vazbu - modifikace (např. acetylace) mohou oslabit interakce s DNA a rozvolnit nukleosom – mohou vázat jiné proteiny (např. bromodoména) [USEMAP] Modifikace histonů - např. acetylace lysinů (změna náboje) oslabí interakci s DNA a rozvolní vazbu oktameru (zpřístupní DNA pro TBP) - následně se TFIID váže na Ac-H4 (K8, K16) prostřednictvím bromodomény TAF1 proteinu (reader/writer/eraser) [USEMAP] Transkripční faktory NF-Y (podjednotky B a C ) obsahují histon-fold a vážou se sekvenčně nespecificky na cukrfosfátovou kostru jako histony - DNA se v důsledku vazby ohýbá podobně jako v nukleosomech - NF-YA podjednotka rozeznává CCAAT sekvenci pomocí a-šroubovice (interkalace do MŽ) - Nardini et al., Cell, 2013 [USEMAP] Full-size image (131 K) Nardini et al., Cell, 2013 NUCPLOT NF-YA podjednotka rozeznává CCAAT sekvenci pomocí a-šroubovice (interkalace do MŽ) TAF6 TBP–associated factors = TAF (podjednotky TFIID komplexu mají histon-fold (HF), ale nevytváří oktamery) Histon-fold doména se neváže na DNA Shao et al, MCB, 2005 PDB:1TAF TAF6/TAF9 TAF9 [USEMAP] Bieniossek et al., Nature, 2013 - TAF4, 6, 9 a 12 obsahují histon-fold a jsou ve dvou kopiích (nikoli v dimerech) v „core“ části TFIID komplexu - TFIID komplex a TBP jsou klíčové pro rozpoznání promotorů a poskytují scaffold/lešení pro sestavení transkripčního systému „core“ spekulativní (viz Louder et al, Nature, 2016) [USEMAP] Motivy DNA vazebných domén •Zipper typ –Leucinový zip –Helix-loop-helix •Helix-otáčka-helix –Winged helix •Zinkový prst – bba zinc-finger –Hormon-receptor –Loop-sheet-helix –Gal4 •Histon, HMG-box • b-hairpin/ribbon • b- barrel • b-listy a-šroubovice [USEMAP] - pouze b-list nebo hairpin (vlásenka) - represory, chromosomální proteiny (lešení pro strukturu DNA) - vážou velký nebo malý žlábek - - b-hairpins lokalizovány podél malého žlábku - Inzerce Pro mezi baze a ohyb DNA [USEMAP] Motivy DNA vazebných domén b-listy a-šroubovice •Zipper typ –Leucinový zip –Helix-loop-helix •Helix-otáčka-helix –Winged helix •Zinkový prst – bba zinc-finger –Hormon-receptor –Loop-sheet-helix –Gal4 •Histon, HMG-box • b-hairpin/ribbon • b- barrel [USEMAP] OB-fold (oligonucleotide/oligosacharide binding) -4-5 anti-paralelních b-listů (b-barel) zakončeno a-šroubovicí (kompaktní) -vytváří úzkou jamku pro jednořetězcovou ssDNA (RNA, oligosacharidy) -váže 2-5 nukleotidů (báze, cukry i fosfáty) -SSB/RP-A a TRF proteiny (replikace, HR, telomery ... Dr. Šebesta) - Liljas, kniha (2SNS) [USEMAP] OB-fold (oligonucleotide/oligosacharide binding, 1JMC) Více OB – RPA70 (A+B) vytváří prodlouženou lineární kapsu [USEMAP] - protein-proteinové interakce (integrita komplexu + interakce s dalšími proteiny/komplexy) (cdc13 v kvasinkách) CST komplex (RPA-like) – regulace telomer (obsahují ssDNA) Flynn a Zou, CR in BMB, 2010 - oprava DNA - část komplexu SHELTERIN – chrání telomery (aby nebyly považovány za DSB, reguluje přístup telomerásy) nespecifická vazba TTAGGGTTAG-specifická vazba [USEMAP] RPA komplex ssDNA: 4GNX - protein-proteinové interakce (integrita komplexu) - celý komplex ~30nt [USEMAP] figure 6-16 part 1 TATA-box vážící protein (TBP) – klíčový pro sestavení preiniciačního komplexu (PIC) -10 anti-paralelních b-listů pokrývá MŽ -Interkalují se postranní řetězce Phe (hydrofobní v.) -vytvaří ohyb (kink) a rozplétá dsDNA -Konsensní sekvence: TATA(A/T)A(A/T)(A/G) 1YTB [USEMAP] TBP a TFIIA (b-barrel TFIIA – neovlivní DNA strukturu) PDB: 1NH2 [USEMAP] -Aktivace – specifické TF -Iniciace – základní TF figure 6-16 part 1 Transkripce TAF1 - aktivace (viz enhanceosom) – modulace chromatinu – iniciace (sestavení PIC) [USEMAP] Liljas a spol. PDB: 1NH2 TBP TFIIA - TBP (v rámci TFIID) nastavuje začátek transkripce na molekule DNA (zajišťuje správnou pozici TFIID) [USEMAP] Bieniossek et al., Nature, 2013 - jádro komplexu (symetrické) tvoří TAF4, 5, 6, 9 a 12 - po připojení všech podjednotek TFIID komplexu včetně TBP vzniká funkční (asymetrický) holokomplex (PIC) cryoEM figure 6-16 part 1 - TFIID (1MDa, TAFs) komplex a TBP jsou klíčové pro rozpoznání promotorů a poskytují scaffold/lešení pro sestavení transkripčního systému (nukleace PIC) [USEMAP] Cianfrocco et al, Cell, 2013 - footprint analýza ukázala jak se TFIIA-TFIID/TBP komplex společně váže na DNA (TFIIA pomáhá vázat TATA box) | Louder et al, Nature, 2016 [USEMAP] pro další postup transkripce je klíčový TFIIB – propojuje TFIID-TFIIA s RNApol II - TFIIB (C-konec = CTD1 a CTD2) váže TBP a 6-7bp up- a downstream od ohybu DNA přes cukrfosfátovou kostru (blízko TATA boxu) figure 6-16 part 1 TFIIA [USEMAP] figure 6-16 - TFIIB (N-konec) váže RNA polymerasu II a orientuje ji vůči TFIID/TBP-DNA komplexu - umístí DNA do aktivního centra/cleft RNA polymerásy - vazba Zn-ribbon na Dock, B-finger/reader do RNA tunelu RNApol II [USEMAP] - TFIIB (N-konec) váže RNA polymerasu II a orientuje ji vůči TFIID/TBP-DNA komplexu - umístí DNA do aktivního centra/cleft RNA polymerásy - vazba Zn-ribbon na Dock, B-finger/reader do RNA tunelu [USEMAP] figure 6-16 Rekonstrukce celého PIC He et al, Nature, 2013 - biotin-DNA navázána na streptavidinové kuličky – na DNA nachytány in vitro sestavené komplexy – odštěpeno SalI a cryoEM - postupně rekonstituován celý PIC TBP(bez TFIID) + TFIIA + TFIIB + RNApol II + TFIIF + TFIIE + TFIIH [USEMAP] He et al, Nature, 2013 TFIIB TBP TFIIA TFIIF - TFIIF (navázaný na pol II) stabilizuje DNA v prohlubni/cleft pol II a pomáhá TFIIB s nastavením startu (WHD z RAP30 podjednotky váže přímo DNA: BREdownstream) - váže TFIIE a pomáhá tak stabilizaci komplexu RNA pol II Dimerizace WHD Vanini & Cramer, Mol Cell, 2012 [USEMAP] - TFIIF (navázaný na pol II) stabilzuje DNA v prohlubni/cleft pol II a pomáhá TFIIB s nastavením startu (WHD z RAP30 podjednotky váže přímo BREdownstream) - změna natočení TFIIA-TFIIB-TBP-pol II - TFIIF váže TFIIE a pomáhá tak stabilizaci komplexu - tandem 4x WHD uzamyká DNA v RNApol II prohlubni TFIIE He et al, Nature, 2013 cleft DNA DNA Vanini & Cramer, Mol Cell, 2012 [USEMAP] - TFIIH (10 podjednotek, 450KDa), podkomplex CDK7-cyclin H-MAT1 fosforyluje pol II (Rpb1) - XPB v kontaktu s DNA rozvíjí dvoušroubovici lidský PIC komplex He et al, Nature, 2013 helikása lešení/scaffold - XPB a XPD regulují transkripci vs opravu DNA (NER) [USEMAP] - XPB a XPD regulují transkripci vs opravu DNA (NER) figure 6-16 Kompletní PIC i s částí TFIID Louder et al, Nature, 2016 [USEMAP] https://www.mpibpc.mpg.de/15370105/initiation.mp4 TBP(bez TFIID) + TFIIA + TFIIB + RNApol II + TFIIF + TFIIE Plaschke et al, Nature, 2016 [USEMAP] Thomas et al., CRiBMB, 2006 začátek transkripce - faktory figure 6-16 Dr. Šebesta Dr. Blažek RPB1 CTD (heptapeptide YSPTSPS repeat) fosforylace [USEMAP] TBP TFIIB Rpb4/7 TFIIA RNA pol II TFIIE TFIIH Gibbons et al, PNAS, 2012 TFIIF mediator figure 6-19 - mechanismus aktivace transkripce zahrnuje vazbu transkripčních aktivátorů, mediátoru (vytvoření transkripční smyčky) … uvolnění chromatinové struktury … figure 6-23 Příště Dr. Blažek: Úloha Cdk kinás v regulaci transkripce a buněčného cyklu [USEMAP]