1 PROTEINOVÉ KOMPLEXY V REPLIKACI DNA CG030 Struktura a funkce proteinových komplexů Edita Balkóová 4.4.2019 2 Replikacia DNA polymeráza I - E.coli (Kornberg, 1957) Semikonzervatívna (Meselson a Stáhl, 1958) Replikačná vidlica - E.coli (Cairns, 1963) Okazakiho fragmenty (1968) Semikonzervatívna Obojsmerná Smer syntézy DNA: 5' 3' Presnosť: 1/106 Rýchlosť: E. co//-50 000 b/min S. cerevisiae-3 600 b/min Myš - 2 200 b/min Človek - 50 b/min Načasovanie: Baktérie nemajú špecifickú fázu Eukaryota v S fázi Take a sample prior to adding to 'N medium (Generation 0) CsCI CO C CD Q Three postulated methods of DNA Replication Semi-Conservative Conservative' w [KMMMKD Dispersive* n Newly, synthesized strand ■ Original template strand * not found to he biologically significant All DNA is initially 1 labeled Add "N labeled cells to 'N medium and grow for lour generations 4 Generation "-oč-;, •0054 25% 1254 20 40 60 80 Time (min.) f íffí . . . . i . . li tí ŕ íííi nii'n 1 Dl IIII I 9 1 li 1 3 Replikácia DNA polymeráza I - E.coli (Kornberg, 1957) Semikonzervatívna (Meselson a Stahl, 1958) Replikačná vidlica - E.coli (Cairns, 1963) • Okazakiho fragmenty (1968) Semikonzervatívna Obojsmerná Smer syntézy DNA: 5' -> 3' • Presnosť: 1/106 Rýchlosť: E. co//-50 000 b/min S. cerevisiae-3 600 b/min Myš - 2 200 b/min Človek - 50b/min Načasovanie: Baktérie nemajú špecifickú fázu Eukaryota v S fázi Replikacia Semikonzervatívna Obojsmerná Smer syntézy DNA: 5' -» 3' • Vedúci reťazec Oneskorujúci sa (opžďujúci se) Paramecium Parlor ©AmoebaSisters 3 fáze replikácie: • Iniciácia Začiatok už v M/G1 (licensing), rozpletenie dvojšróbovice DNA, vznik replikačnej vidlice a naviazanie enzymatického komplexu • Elongácia • pridávanie nukleotidov a postup replikačnej vidlice Topologickéhý stres, tažko replikovatelné lokusy, proteiny na DNA, transkripcia, poškodená DNA • Terminácia • ukončenie replikácie Proteinové komplexy v replikacii Prereplikačný komplex CMG helikáza RPA Primáza DNA polymerázy PCNA DNA ligáza Topoizomerázy I a II Histon remodelačné komplexy Lagging strand Leading strand 6 Iniciácia Origin - post mitotic • Bakterie majú len 1 replikačný počiatok • Eukaryota - väčší zložitejší génom - viac počiatkov replikácie • Zostavenie prereplikačného komplexu v G1 • ..replication licencing" • Fosforylácia MCM helikázy pomocou CDK a DDK kináz • Aktivácia replikačnej helikázy (CMG helikáza) v S • K MCM helikáze sa pripoja ďalšie proteiny 1. ORC komplex 2. MCM helikáza -> preRC 3. MCM dvojitý hexamer 4. MCM dvojitý hexamer -> CMG helikáza Pre-replicatton complex DDK ♦ CDK mediated call cycle ngnalmg Activation of Pre initiation complex ORC • Origin of recognition complex • Objavené u S. cerevisiae • Podjednotky Ord, Orc2, Orc3, Orc4, Orc5, Orc6 (+CDC6) • Asociované s chromatinom - väzba na ARS • Autonomously replicating sequences Väzba k DNA závislá na ATP • Funkcia: zostavenie prereplikačného komplexu (preRC) v G1 • Transkripčné umlčenie, heterochromatinizácia, kondenzácia a kohézia chromosómov, cytokinéza • preRC: Cdc6, Cdt1, Mcm2-7, ORC • MCM helikázový komplex sa aktivuje až v S fázi (pomocou kináz) • Nie všetky replikačné počiatky sa aktivujú • Meier-Grolinov syndróm (AR-ORC, Cdc6), E B V, nádory OORC1 • ORC2 • ORC3 • CDC6 J O MCM2-7 • Cdt1 OORC4 O0RC5 00RC6 CDC6 binds ORC 0RC-CDC6 recruits MCM2-7-CDT1 Bell (2017) 8 ARS • Autonomously replicating sequences • Sem sa viaže preRC • ORC sa viaže na DNA pomocou WH domén a AT hookov Konsezus sekvencia u S. cerevisiae: • ORC naviazaný počas celého bunečného cyklu • A-element vysoko konzervovaný 5'- T/A T T T A Y R T T T T/A -3 100 bpdlhé ■ Aktívne (replikácia z 1 ARS každý druhý bunečný cyklus) B3 20bp B2 BI Origin recognition sequence Okrem S. cerevisiae a jej blízko príbuzných kvasiniek sa u žiadneho ďalšieho organizmu nepodarilo nájsť uniformnú konsenzuálnu sekvenciu pre väzbu ORC • AT-bohatá sekvence u S. pombe • ORC sa viaže v M/G1, uvoľní sa v S • Replikačné počiatky viac podobné mnohobuněčným jako S. cerevisiae • 1000 bpdlhé • Málo aktívne (replikácia z 1 ARS každý desiaty bunečný cyklus) http://glossomics.blogspot.cz/ 9 ARS Autonomously replicating sequences Sem sa viaže preRC ORC sa viaže na DNA pomocou WH domén a AT hookov Vyššie eukaryota: • Asymetrické AT bohaté sekvencie, rozhoduje epigenetika • G-kvadruplexy, počiatky transkripcie, Dnáza hypersenzitivné oblasti • Early replicating regions: • H3K4me1/2/3, H3K9ac, H3K18ac, H3K36me3, a H3K27ac • Euchromatin • Late replicating regions: • H3 a H4 hypoacetylácia, a H3K9 a H3K27 metylácia • Často tkáňovo specifické • V ľudských buňkách Ord sa počas S fáze uvoľní z komplexu a spát sa naviaže na konci mitózy • ARS: Kvasinky po 40kb, savci každých 200-300kb • Ľudská buňka asi 50 000 ARS 10 Podjednotky ORC ORC1 : • Interakcia so Sir1 (S.c), HP1 (D.m.) • transkripčná represia • BAH doména sa viaže na H4K20me2 • esenciálna interakcia pre asociáciu s chormatinom ORC2: • Lokalizácia aj pri centromerách • delécia -> mitotické defekty • AT hook: väzba k DNA ORC4: or* • Asociácia s membránami neurónov, úloha v dendritickom rastu Orc4 ORC6: • Štruktúrne odlišná od ostatných ORC podjednotiek 0ícs • Medzidruhovo velmi málo konzervovaná • Lokalizácia u kinetochóroch, úloha v cytokynéze {H.s., D.m.) WH doména a AT hook - väzba k DNA AAA+ doména - ATPázová doména BAH doména - protein-proteinové interakcie AAA- Orcl Oic2 | BA h ORC/Cdc6 WA WB S1 S2 AAA + H I QRCŕCdcs AT hoolt AAA+ WA WB S1 S2 ORCí'Cdce 620 6"6 WA WB Si 92 ._AAA-+ ORC/Cdc6 :2: WA WB S1 S2 AAA- I I I I Wh WH ORCJCdc6 479 WA WB 51 S2 AAA+ BAH domain Disordered region O RC/Cdc6 domain Motifs Cdc6 ORC/Cdc6 :"3 WA WB S1 S2 WH (Dunckeret. al., 2009) Štruktúra ORC ORC core Ord • Orc2 Orc3 Orc4 Orc5 Orc6 4-( aaa+~ WH - -( AAA+ - like )-(Insertion)-( WH > -(. AAA+ KWH> aaa+ k~wh> ADP+Pi .5- Exchange binding partners Pol5 Synthesis of lagging strand FEN1 DNA ligasel Ligation of lagging-strand DNA (Masai and Foiani, 2017) PCNA • Homotrimer • Každá podjednotka má IDCL (Inter-domain connecting loop) • Potrebný pre väzbu interakčných partnerov (Polo, p21, DNAligáza...) IDCĽ inálna časť: interakcia s Pols, Rf-C, ... Vnútorná časť: pozitívne nabité šroubovice - kontakt s DNA ' box (PCNA interacting peptide): • Q-X-X-^-X-X-0-0 • Motív interagujúci s PCNA IDCL • Obsahujú ho proteny interagujúce s PCNA • DNA polymerázy, Dnmtl, p21, Fen1, DNA ligáza... • APIM (AlkB homologue 2 PCNA interacting motif) • Proteiny zúčatňujúce sa opravy DNA • PCNA kód • Posttranslačné modifikácie PCNA určujúce vazebných partnerov a funkciu PCNA DNA polymerázy £ a 5 Aktivita: • 5-3' DNA polymerázová • 3-5'exonukleázová Mutácie v exonukleázovej doméne polymeráz nájdené v nádorových bunkách Po DNA putuje pomocou PCNA Výmena polymerázy a za 5 alebo z po syntéze primem Póla má afinitu k A-helixu RNA/DNA a z B-helixu DNA/DNA disociuje Rf-C loaduje PCNA na koniec primeru a na PCNAsa naviaže Pol ó" alebo e Polč syntetizuje opožďujúci sa reťazec Pols syntetizuje vedúci reťazec Polo a Polč nemajú 5'- 3'exonukleázovú aktivitu, ktorou by vedeli vyštiepiť primery. Túto úlohu vykonáva RNAza H1 a FEN-1. Polymerázy po tom medzery zaplnia • DNA ligáza zliguje nespojené konce Polo X J Katalytická podjednotka polymeráz: tvar ľudskej ruky „Dlaň" je vysoko konzervovaná - polymerázová aktivil „Palec" drží DNA na mieste a zvyšuje procesivitu N-terminálna doména: • OB fold ssDNA väzobná oblasť RNA väzobná oblasť Velký (3-hairpin motív Premiestňuje DNA z polymerázovej časti do exonukleázovej Exonukleázová doména: 3'-5'proofreading • Oprava chýb pri replikácii • Maturácia Okazakiho fragmentov Syntetizuje DNA na opožd'ujúcom sa reťazci až po ďalší primer (vytvorený DNA Pola) Thumb Katalytická podjednotka Polo 3'-5' Exonuclease terminal P-Hairpin motif (Doublié and Zahn 2014, Waisertreiger et. Al., 2012) Pol5 • Syntetizuje DNA na opožďujúcom sa reťazci až po ďalší primer (vytvorený DNA Pola) • Po strete s ďalším primerom dosyntetizuje ešte pár nukleotidov a vytesní kus RNA primeru • Vyčnievajúci 5'koniec RNA primeru je po tom rozpoznaný Fen1 nukleázou, ktorá vyštiepi RNA primer • DNA ligáza spojí Okazakiho fragmenty 5'-3" - PCNA RPA 3' 5' I 5'-3" Fenl D| 5' 5*-3'' 3' 5' 3' 5' 5'" 3" 5'' V' DNA ligase I I 3' 5' 3' S' PoIe ~p»r" Objavená v 1990 ako tretia DNA polymeráza esenciálna pre replikáciu S. cerevisiae Dvojnásobná veľkosť oproti Polo Najväčšsia podjednotka (p261) obsahuje • Katalytickú N-koncovú časť • C-koncovú časť bez katalytickej aktivity pre protein-proteinové interakcie Pre svoju aktivitu nepotrebuje PCNA • „Dlaň" Pols(380aa) je omnoho väčšia ako u Pola(175aa) alebo Poló(203aa) P-doména: zvyšuje procesivitu 3'- p hairpin je príliš malý - nedokáže kontaktovať DNA ako u Polo a prenášať ju na exonukleázovú časť • Jeho úlohu zastáva P-doména??? Katalytická podjednotka Pols (Doublié and Zahn 2014, Waisertreiger et. Al., 2012) 38 Terminácia • Keď sa 2 replikačné vidlice stretnú • Na konci S-fáze, ale v skutočnosti sa replikony terminujú v priebehu S-fáze • Veľkosť replikonu: 31 kbp, rýchlosť replikačnej vidlice: 1,5 kbp/min -> za 10 minút od začiatku replikácie sa dva replikačné vidlice stretnú a dojde k terminácii replikácie • RFB(replication fork barrier): • Špecifické miesta genomu, ktoré dokážu zastaviť replikačnú vidlicu • Pri replikácii rDNA • ORC sa na konci S-fáze disociuje z komplexu (okrem S.cerevisiae) • Odstránenie CMG: • Mcm7 je polyubikvitylovaný na K48. • Cdc48 rozpozná polyubikvitinylovaný CMG komplex a oddelí ho od chromatinu • PCNAje z chromozómu odstránený na začiatku G2 fáze pomocou ELGI-Rf-C Ďakujem za pozornosť