http://www.recetox.muni.cz/
E2221 Environmentální analytická chemie – cvičení
Kontakt: Jan Kuta (RECETOX PřF MU) jan.kuta@recetox.muni.cz
Stanovení esenciálních a toxických prvků ve vlasech metodou ICP-MS
I. Teoretický úvod
Lidé a obecně živočichové potřebují ke správné funkci těla kromě kyslíku, vody, bílkovin, vitamínů
apod. také dostatečný přísun stopových prvků. Řada esenciálních prvků (např. Fe, Zn, Cu) je
klíčovou součástí metaloenzymů nebo jsou spojené s rozhodujícími biologickými funkcemi, jako
transport kyslíku nebo hormonální aktivita. Na druhé straně v prostředí existuje mnoho prvků,
které nejsou pro lidský organismus esenciální a při určité expozici mohou vykazovat toxické účinky
(např. Pb, Cd, Hg, As). Sledováním hladin toxických a esenciálních prvků v populacích ve vztahu k
lidskému zdraví se zaobírá vědní disciplína zvaná humánní biomonitoring. V rámci humánního
biomonitoringu se stanovují v populacích koncentrace tzv. biomarkerů (např. Cd v moči, Zn v
krevním séru, Hg ve vlasech). Volba vhodného biomarkeru je vždy odvislá od rychlosti a způsobu
metabolismu různých forem (specií) daného prvku (tzv. toxodynamika a toxokinetika). Ideálním
biomarkerem by byl obsah prvku v cílovém orgánu. Nicméně to by znamenalo biopsii orgánů, jako
jsou játra, ledviny či mozek, což je z etického i praktického hlediska neproveditelné. V praxi se pro
posouzení expozice toxickým prvkům či nedostatku esenciálních prvků využívá analýzy vzorků plné
krve, krevní plasmy/séra a moči. Dále se studují možnosti využití alternativních biomarkerů/matric.
Takovým typem matrice by mohli být vzorky vlasů, které lze snadno a neinvazivně odebrat. Odběr
je levný, vzorek snadno uskladnitelný a transportovatelný do laboratoře k analýze. Zajímavá je i
možnost analyzovat vzorky po částech a tím rekonstruovat expozici daného jedince v čase zpět
(rychlost růstu vlasů je přibližně 1 – 1,25 cm za měsíc). Tyto vlastnosti dělají vlasy atraktivním
materiálem pro biomonitoring, nicméně použití vlasů v rutinním biomonitoringu má prozatím své
limitace a to např. nejasný vztah mezi expozicí a obsahem prvků ve vlasech a neexistence
referenčních mezí pro většinu prvků.
Z analytického hlediska se pro analýzu vlasů využívá především metod atomové spektrometrie, a to
konkrétně atomové absorpční spektrometrie s atomizací prvků v plameni (FAAS) či elektricky
vyhřívané kyvetě (ETAAS), optické emisní spektrometrie s indukčně vázaným plazmatem (ICP-OES)
a hmotnostní spektrometrie s indukčně vázaným plazmatem (ICP-MS). Všechny tyto techniky
vyžadují převedení vzorků do roztoku (mineralizaci vzorků). Vlasy je tedy potřeba před analýzou
rozložit v prostředí silných kyselin a oxidačních činidel. Mineralizace může být dle povahy analytů
(těkavost, riziko kontaminace z vnějšího prostředí) provedena v otevřeném sytému (např. v kádince
na plotně) či lépe v uzavřeném systému (autoklávy, mikrovlnná rozkladná zařízení).
II. Stanovení obsahu Zn a Cd ve vlasech metodou ICP-MS
1. Úvod
Pro úlohu byly vybrány 2 prvky, které reprezentují jak esenciální (Zn), tak i toxické prvky (Cd).
Vzorek vlasů jako matrice byl vybrán z důvodu snadného odběru, manipulace a také pro svou
potenciální neinfekčnost. Pracovat byste měli se svým vzorkem vlasů. Pokud z jakéhokoliv důvodu
nechcete či nemůžete vzorek poskytnout, poskytne Vám ho vedoucí cvičení.
http://www.recetox.muni.cz/
Vzorek vlasů před vlastním stanovením je třeba zbavit exogenní kontaminace (proplach vzorku) a
převést do roztoku. Vzorek se rozkládá v mikrovlnném rozkladném zařízení za použití
koncentrované kyseliny dusičné a peroxidu vodíku. Prvky v roztoku se stanoví hmotnostní
spektrometrií s indukčně vázaným plazmatem (ICP-MS).
2. Chemikálie, pomůcky a přístroje
• Aceton, p.a.
• Demineralizovaná vysoce čistá voda (vodivost 0,054 μS/cm)
• Kyselina dusičná konc., p.a.
• Peroxid vodíku konc., p. a.
• Kalibrační standardy Astasol o koncentraci Zn a Cd 1 g/L
• Roztok porovnávacích prvků (Ge, Rh) o koncentraci 100 mg/L
• Odměrné baňky o objemu 25ml
• PE zkumavky o objemu 15 ml
• Nůžky a filtrační papír
• Automatické pipety s nastavitelným objemem v rozsahu 0,01 – 5 ml
• Mikrovlnné rozkladné zařízení MARS-6 vč. PFA rozkladných nádobek o objemu 20 ml
• Hmotnostní spektrometr s indukčně vázaným plazmatem Agilent 7700x ICP-MS
3. Postup pro odběr a promývání vzorků vlasů
Úzký svazek vlasů se odebere nůžkami z temenní části hlavy, pokud možno co nejblíže kůži.
K odstranění exogenní kontaminace a prachu z povrchu vlasů se požije jako promývací medium
aceton a demineralizovaná voda v pořadí aceton, demineralizovaná voda, aceton. V každém
rozpouštědle se nechají vlasy louhovat 5 minut za občasného promíchání. Následně se nechají
vlasy vysušit na filtračním papíře za laboratorní teploty mimo dosah veškerých chemikálií (mimo
pracovní plochu v digestoři).
4. Postup pro rozklad vzorků vlasů
Vzorek se rozloží v prostředí kyseliny dusičné a peroxidu vodíku při teplotě 180 °C pomocí
mikrovlnného rozkladného zařízení MARS-6 v uzavřených nádobkách z PFA (chemicky rezistentní
fluoropolymer). Ohřev vzorku je zabezpečen pomocí mikrovln a teplota v nádobkách je
kontrolována infračervenými čidly. Nádobky jsou uzavřeny PTFE inserty a PFA víčky, které umožňují
pracovat se vzorky za vysokých tlaků a tím i teplot. Při rozkladu dochází k oxidaci organické hmoty
až na oxid uhličitý, případně jiné vodou rozpustné organické sloučeniny. Vysoká teplota urychluje
rozklad organické matrice.
Postup pro rozklad vzorků je následující:
• Vzorek umytých a vysušených vlasů vložíme do 20 ml PFA nádobky a zvážíme
• Přidáme 2 ml kyseliny dusičné a 1 ml peroxidu vodíku
• Nádobku uzavřeme PTFE insertem a přišroubujeme PFA víčko. Stejným způsobem připravíme i
tzv. slepé pokusy/blanky (nádobky s kyselinou a peroxidem, ale bez vzorku vlasů)
• Sešroubované nádobky umístíme do karuselu mineralizačního zařízení a spustíme mineralizační
program
• Po skončení programu nádobky vyjmeme, rozšroubujeme a mineralizát kvantitativně
převedeme pomocí deionizované vody do 25 ml odměrných baněk
http://www.recetox.muni.cz/
5. Stanovení kovů metodou ICP-MS
5.1 Úvod do ICP-MS
Hmotnostní spektrometrie s indukčně vázaným plazmatem (ICP-MS) je moderní metoda prvkové
analýzy s uplatněním v různých oblastech analytické chemie. V klasickém uspořádání se přístroj
skládá ze zmlžovacího systému, iontového zdroje, kónusů, iontové optiky, hmotnostního
analyzátoru a detektoru. Jedinečný je především způsob ionizace analytů, který je pro oblast
hmotnostní spektrometrie velmi netypický. Indukčně vázané plazma (ICP) je velmi silný ionizační
zdroj, kde dochází k rozrušení všech původních vazeb ve vzorku a tím i ztrátě informací o struktuře
sloučenin. Zdrojem iontů v ICP-MS je argonové plazma o teplotě 6000 - 10000 °C, které je
udržováno pomocí střídavého vysokofrekvenčního magnetického pole tzv. indukční vazbou.
Zjednodušeně lze princip stanovení popsat následujícím způsobem. Kapalný vzorek je čerpán
peristaltickým čerpadlem ke zmlžovači, který z kapalného vzorku vytváří aerosol. Aerosol dále
prochází skrz mlžnou komoru, kde dochází k odstranění větších částic (aerosol by měl obsahovat
maximum částic s velkostí pod 1 μm). Aerosol následně vstupuje do indukčně vázaného plazmatu
(ICP), kde velmi rychle dochází k odpaření vody, atomizaci molekul a ionizaci atomů především do
stavu M+
. Ionty z ICP procházejí přes 2-3 vzorkovací kónusy do vakuové oblasti hmotnostního
spektrometru a pomocí iontové optiky jsou vedeny do hmotnostního analyzátoru. V hmotnostním
analyzátoru (obvykle jednoduchý kvadrupól) jsou jednotlivé ionty rozděleny dle poměru
hmotnost/náboj (m/z) a detekovány elektronásobičem.
Z hlediska analytických vlastností se ICP-MS vyznačuje především možností stanovení naprosté
většiny prvků periodické tabulky a to včetně i pro atomovou spektrometrii netypických prvků, jako
jsou halogeny (vyjma fluoru), sira či fosfor. Další důležitou vlastností je možnost stanovení více
prvků vedle sebe v jednom analytickém kroku, který netrvá obvykle déle, než několik minut. Spolu
s atomovou absorpční spektrometrií s elektrotermickou atomizací (ETAAS) se jedná o nejcitlivější
metodu prvkové analýzy s mezemi detekce v oblasti ≤ ng/L. Nicméně existují jistá omezení ohledně
množství a složení matrice vzorků, která může významně ovlivnit kvalitu výsledků. V prvé řadě je to
přítomnost nerozpuštěných látek, které mohou blokovat zmlžovač a ovlivňovat tvorbu aerosolu.
Významné problémy mohou způsobit také vyšší koncentrace rozpuštěných látek ve vzorku.
Matriční prvky společně s plazmovým plynem (Ar) mohou vytvářet tzv. polyatomické ionty, které
mohou interferovat se signály analytů (stejné m/z). Tyto interference se nazývají spektrální. Jako
příklad lze uvést iont 75
ArCl+
, který může navyšovat signál iontu 75
As+
. Dalším problémem spojeným
s vysokými koncentracemi rozpuštěných látek jsou tzv. nespektrální interference. V tomto případě
jde o ovlivnění signálu stanovovaných analytů prostřednictví různých jevů, které však nesouvisejí
s hmotnostními překryvy iontů. Matrice muže ovlivnit míru ionizace analytů v ICP, prostorové
rozložení iontů v iontovém paprsku a pod. V neposlední řadě může docházet k depozici matrice na
vzorkovacích kónusech a iontové optice, což způsobuje přístrojový drift. Z praktického hlediska je
vhodné analyzovat roztoky neobsahující žádné nerozpuštěné látky a rozpuštěné látky anorganické
povahy do koncentrace 2 g/L.
5.2 ICP-MS přístroj a jeho nastavení
Měření budou prováděna na přístroji Agilent 7700x ICP-MS. Jde o kvadrupólový hmotnostní
spektrometr, jehož součástí je kolizně reakční cela, která slouží k redukci spektrálních interferencí.
Pro účely našeho měření bude použito helium jako kolizní plyn. Polyatomické ionty pocházející z
matrice mají větší iontový průměr než jednoduché ionty analytů a tím i vyšší pravděpodobnost
http://www.recetox.muni.cz/
srážky s pracovním plynem v kolizní cele. Interferenty srážkami ztrácejí kinetickou energii a při
správně nastavené potenciální bariéře na výstupu z cely neprocházejí interferenty dále do
hmotnostního spektrometru. Nespektrální interference budou korigovány pomocí porovnávacích
prvků Ge a Rh. Do kalibračních grafů se pak bude vynášet poměr signálu analytu k signálu
porovnávacího prvku tj. poměr Zn/Ge a Cd/Rh. Tento poměr by při dané koncentraci měl ideálně
být nezávislí na složení matrice. Nespektrální interference a přístrojový drift ovlivňují tedy
v optimálním případě signál analytu a porovnávacího prvku stejnou měrou.
5.3 Pracovní postup
Připraví se sada směsných kalibračních roztoků o následujících koncentrací:
• Roztok 1: kalibrační nula (0 μg/L Zn a Cd, pouze roztok zředěné HNO3)
• Roztok 2: 0,2 mg/L Zn a 0,5 μg/L Cd
• Roztok 3: 1 mg/L Zn a 2 μg/L Cd
• Roztok 2: 2 mg/L Zn a 10 μg/L Cd
Pro přípravu kalibračních roztoků se použijí zásobní kalibrační standardy o koncentraci Zn a Cd
1 g/L. Kalibrační roztoky obsahují jako matrici zředěnou kyselinu dusičnou o koncentraci 2 ml
kyseliny na 25 ml roztoku (tj. stejně jako vzorky). Roztok porovnávacích prvků se připraví ředěním
zásobního roztoku 2% HNO3 na koncentraci 200 μg/L v 50 ml odměrné baňce. Roztok
porovnávacích prvků se přimíchává k roztoku vzorku v průběhu měření pomocí peristaltického
čerpadla.
Při analýze postupujeme od kalibračního standardu s nejvyšší koncentrací po kalibrační standard
s nejnižší koncentrací, následně proměříme slepé pokusy (blanky) společně se vzorky – blanky by v
sekvenci měli být rovnoměrně rozprostřeny mezi vzorky.
5.4 Vyhodnocení naměřených dat
Kalibrační závislost se sestrojí z poměrů signálu analytů a signálu porovnávacího prvku (tzn. poměr
signálů Zn/Ge a Cd/Rh proti koncentraci Zn a Cd v kalibračních roztocích). Tentýž přepočet se
provede i pro signály vzorků a slepých pokusů. Přes kalibrační závislost se vypočte koncentrace
prvků v roztocích slepých pokusů a vzorků v mg/L resp. μg/L. Střední hodnota koncentrace analytů
v slepých pokusech (medián) se odečte od koncentrace analytů ve vzorcích. Spočte se mez detekce
metody (LOD) jako trojnásobek směrodatné odchylky (SD) koncentrace analytů v slepých pokusech
a LOD porovnáme s koncentracemi analytů ve vzorcích po odečtu mediánu slepých vzorků.
Najdeme li ve vzorcích koncentraci nižší, než je hodnota LOD, dále s hodnotou nepočítáme.
Koncentrace prvků po odečtení střední hodnoty slepého pokusu přepočteme na obsah prvků
ve vlasech v jednotkách μg/g – v úvahu bereme celkový objem roztoku (25 ml) a navážku vzorku.
U prvků, které se nacházejí pod hodnotou LOD nahradíme hodnotu obsahu značkou <LOD - LOD je
třeba přepočítat z μg/L na μg/g pro daný vzorek a danou navážku.
Protokol by měl obsahovat následující informace:
• Tabulky signálů analytů a porovnávacích prvků v kalibračních roztocích, slepých pokusech a
vzorcích
• Poměry signálu Zn/Ge a Cd/Rh a vypočtené koncentrace (i pro kalibrační roztoky)
• Parametry lineární regrese ve formě y = ax + b, kde parametry a a b budou vypočteny
s přesností alespoň na 3 platné číslice
• Vypočtené střední hodnoty (mediány) u slepých pokusů, jejich SD a vypočtené LOD
• Vypočtené hodnoty obsahů prvků ve vlasech