Inovace tohoto předmětu je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky
ENDOKRINNÍ DISRUPCE
Klára Hilscherová
Co jsou endokrinní disruptory(EDCs)?
narušení hormonální rovnováhy organismů s potenciálními
negativními následky pro celkovou homeostázu,
reprodukční, vývojové a behaviorálních funkce
 Definice Evropské komise:
Exogenní látky nebo směsi, které mají potenciální schopnost
způsobit endokrinní disrupci u zasaženého organismu, jeho potomků
nebo (sub)populací
 Antropogenní i přírodní látky, které přímo nebo nepřímo ovlivňují
hormonální systém a mohou působit na velmi nízkých koncentracích
Co je endokrinní disrupce (ED)?
K čemu je endokrinní systém?
ES je spolu s CNS hlavní řídící systém organismu
Endokrinní Funkce
• Udržování vnitřní homeostázy
• Podpora růstu buněk
• Koordinace vývoje
• Koordinace reprodukce
• Zprostředkování odpovědi na vnější impulsy
- gonadotropin, růstový h.
- estradiol, testosteron
- glukokortikoidy,
mineralokortikoidy, thyroidy
- melatonin, kalcitonin, insulin,
„oxytocin“…
- neuropeptidy (kladení vajíček,
tep, vývoj, růst, metabolismus)
- ekdysteroidy ???
- pohlavní hormony (progesteron,
testosteron, estradiol) ???
- neuropeptidy (kladení vajíček, tep,
vývoj, růst, metabolismus)
- ekdysteroidy (svlékání, vývoj)
- pohlavní hormony (androgenní h.;
estradiol, progesteron ???)
Mechanismy účinku EDCs
EDCs mohou působit
 přímo
vazbou na receptory jako:
 agonisté – chovají se jako přirozené hormony
(např. ethinylestradiol, nonylphenol)
 antagonisté – blokování receptorů pro přirozené hormony
(např. tamoxifen, PCB 77, p,p'-DDE)
 nepřímo
ovlivněním biosyntézy, metabolismu, vylučování a/nebo
biodostupnosti přirozených hormonů
Příklad:
 inhibice aromatázy – blokování přeměny androgenů na
estrogeny
Následky disrupce
Neschopnost udržet homeostázu
Narušení růstu & vývoje
Narušení odpovědi na vnější impulsy
Změny chování
Potlačená gametogeneze
Embryonální malformace
Zvýšená neoplasie nebo karcinogeneze
Mezi endokrinní disruptory patří
Pesticidy (herbicidy, insecticidy, …)
Změkčovače plastů
Rostlinné metabolity
Farmaceutika (antikoncepce, léky,…)
Produkty rozkladu detergentů
Chemikálie z vaření & hoření
Antibiotika
Kovy
PPCPs – endokrinní disrupce
Classification Relevant compounds
Persistent organic pollutants 1,1,1-Trichloro-2,2-bis(4-chlorophenyl)ethane (DDT ) and derivates,
2,3,7,8-tetrabromodibenzo-p-dioxin, brominated diphenylether (BDE) 209, chlordane,
hexachlorobenzene, hexachlorocyclohexanes, mirex, PCBs, PCDDs/PCDFs, short and intermediate
chain chlorinated paraffins, toxaphene, trichlorobenzene
Pesticides 2,4-dichlorophenoxyacetic acid, 3,4-dichloroaniline, acetochlor, alachlor, amitrol, atrazine, bifenthrin,
boric acid, carbaryl, chlordimeform, cyhalothrin, deltamethrin, dibromochloropropane, dibromoethane,
fenarimol, fenitrothion, kepone (chlordecone), linuron (lorox), loxynil, mancozeb, maneb, metam natrium,
methoxychlor, metiram (complex), metribuzin, nitrofen, omethoate, picloram, quinalphos = chinalphos,
resmethrin, stannane, terbutryn, thiram, trifluralin, vinclozolin, zineb
Pharmaceuticals cyclophosphamide, ketoconazol, mestranol, mestranol
Personal care product ingredients 2,6-cis diphenyl hexamethylcyclotetrasiloxane, 2-ethyl-hexyl-4-methoxycinnamate,
3-(4-methylbenzylidene)camphor, 3-benzylidene camphor, cyclotetrasiloxane,
ethyl 4-hydroxybenzoate, methyl p-hydroxybenzoate
Plasticizers and other additives in
materials and goods
2,2'-bis(2-(2,3 epoxypropoxy)phenyl)-propane, 4-nitrotoluene, butylbenzylphthalate (BBP),
di-(2-ethylhexyl)phthalate (DEHP), dicyclohexyl phthalate, diethyl phthalate (DEP),
di-n-butylphthalate (DBP), dipentylphthalate (DPP), epichlorohydrin (1-chloro-2,3-epoxypropane), methyl
tertiary butyl ether, mono 2 ethyl, hexylphthalate, mono-n-butylphthalate, resorcinol, styrene, tert.
butylhydroxyanisole
Polycyclic aromatic chemicals 3,9-dihydroxybenz(a)anthracene, 3-methylcholanthrene, ,6-cyclopento-1,2-benzanthracene,
7,12-dimethyl-1,2 benz(a)anthracene, benzo[a]pyrene
Halogenated phenolic chemicals 1,1-trichloro-2,2-bis(4-hydroxyphenyl)ethane, hydroxy - PCBs, pentachlorophenol
Non-halogenated phenolic
chemicals
4,4'-biphenol, 4,4'-dihydroxybenzophenon, 4-cyclohexylphenol, 4-nonylphenol and nonylphenol (2
compounds), 4-isooctylphenol, 4-octyl-phenol, 4-phenylphenol
4-tert-octylphenol, benzophenone-2, bisphenol A (BPA), bisphenol B, n-butyl p-hydroxybenzoate,
nonylphenolethoxylate, n-propyl p-hydroxybenzoate, octylphenol, p-benzylphenol, phenolphthaleine,
resbenzophenone
Chemicals containing tin fentin acetate, methoxyetylacrylate tinbutyltin, copolymer, phenol,
2-[[(tributylstannyl)oxy]carbony, stannanes (9 compounds), tetrabutyltin, tributyltincarboxylate, tributyltin
compounds, tributyltin hydride, tributyltinnaphthalate, tributyltin oxide = bis(tributyltin) oxide,
tributyltinpolyethoxylate, tri-n-propyltin, triphenyltin
Other chemicals 1,3-dichloro-2,2-bis(4-methoxy-3-methylphenyl)propane, ethylene thiourea, p-coumaric acid,
o,p'-DDA-glycinat = n-(2-chlorophenyl)(4-chlorophenyl), acetylglycin
Potenciální EDCs (Category 1 in European Commission 2014)
International Panel on Chemical Pollution (IPCP) - July 2016
A Compilation of Lists of Chemicals Recognised as
Endocrine Disrupting Chemicals (EDCs) or Suggested as Potential EDCs
24 lists and databases considered, thousands of chemicals on the lists
BENZOPHENONES, BISPHENOLS, PARABENS, PFOS AND ITS SALTS,
PHTHALATES, PESTICIDES / FUNGICIDES, ORGANOTINS
triclosan, triphenyl phosphate, perchloroethylene,
tetrachloroethylene, perfluorooctanoic acid
butylated hydroxytoluene, carbon disulphide,
chlorinated paraffins, deca-BDE,
2-ethylhexyl 4-methoxycinnamate
galaxolide, tonalide, tert-butyl methyl ether
MTBE, 2-methoxy-2-methylpropane
4-tert-butylphenol, tert-butylhydroxyanisole
tert-butyl-4-methoxyphenol
pentachlorophenol, 4-nitrophenol,
2,4,6-tribromophenol, siloxanes, resorcinol
Relativní potence látek
Estrogenní potenciál
• Jednotlivé polutanty se liší svým
estrogenním potenciálem (silou
účinku).
• Lze ho vyjádřit pomocí EEF –
estradiol ekvivalentní faktor
⇒Ten se stanovuje většinou pomocí
standardních in vitro testů (ESCREEN,
kvasinkový test…)
- Klíčový faktor vlivu
xenoestrogenů na organismy!
17ß-Estradiol 1
Ethynyl-estradiol 1.2
Estrone 1.6x10-2
Estriol 1.0
Genistin 2.6x10-4
Diadzein 1.3x10-4
o,p'-DDT 9.1x10-6
Dieldrin 2.4x10-7
4-nonylphenol (NP) 2.3x10-5
4-octylphenol (OP) 1.4xl0-6
bisphenol A 7.8x10-6
diethylphthalate 3.2x10-8
(ER-CALUX assay; Legler et al.,
1999 a 2002)
Estrogenní aktivita v ČOV
0
20
40
60
80
100
120
140
M
ay
07June
07July
07
August07
Septem
ber07
O
ctober07
Novem
ber07
Decem
ber07
January08
February
08M
arch
08April08
EEQ(ngE2/L).
Influent
Effluent
Odbourávání estrogenní
aktivity v ČOV Brno
Následky ED ve volně žijících organismech:
• Abnormální funkce a vzhled štítné žlázy
• Snížená plodnost
• Snížená líhnivost
• Demaskulinizace a feminizace samců
• Defeminizace a maskulinizace samic
• Snížené přežívání mláďat
• Změna funkce imunitního systému
• Změny chování
• Poruchy svlékání a růstu
⇒ vliv na populaci ⇒ vliv na ekosystém
Hormonální regulace biologických procesů je společná
charakteristika živočišného kmene – projevy ED u obratlovců i
bezobratlých
Důležitá fakta o účincích ED ve volně žijících
živočiších
• Účinky se projeví po expozici i velmi malými dávkami látek
• Účinky se pravděpodobněji projeví v mláďatech, než v
dospělcích
• Účinky jsou velmi ovlivňovány načasováním expozice stupněm
vývoje, na kterém byl jedinec exponován
• Účinky odlišné během doby života organismu (fetus vs.
embryo vs. dospělec)
• Účinky často opožděné
– ke kompletním projevům nemusí dojít až do dospělosti
• okna senzitivity
Projevy u vodních obratlovců
Malformace-změny v pohlavních orgánech. Příklady:
 Hemi- a minipenis
u aligátorů na Floridě,
Jezero Apopka –
způsobeno únikem DDT
 Feminizace samců ryb (ovotestes) v povrchových vodách
znečištěných odpadními vodami v severní Americe a v Evropě
 Maskulinizace
samic kapra
pod výpustmi
z papíren
 Maskulinizace samic střevle potoční
v tocích pod farmami živočišné výroby
Endokrinní disrupce u plazů
• Samci aligátorů z jezera Apopka (Florida)
demaskulinizováni
• Výrazně zmenšené sekundární pohlavní znaky (1/3
až 1/2) proti normálním zdravým samcům
• Nízké hladiny testosteronu i estrogenu, ale měli více
estrogenu než testosteronu
• Vylíhlá mláďata byla buďto samice s normálními
vaječníky nebo samci s intersexem
(žádní normální samci) a byla u
nich zvýšená mortalita
• Byla snížená líhnivost v populaci
Endokrinní disrupce v populacích ryb
• V závislosti na látce:
– Feminizace samců
– Maskulinizace samic
• Změněný poměr pohlaví
• Snížená plodnost, kvalita a kvantita
spermatu
• Vymizení populací
– Jezerní pstruh v jezeře Ontario
Důvod intersexuality v rybách?
• Samci ryb jsou ‘feminizováni’ estrogeními
látkami.
• Mnoho látek s estrogenní aktivitou je
přítomno ve výpustích ČOV a tak
uvolňováno do řek.
• Steroidní estrogeny, jak přírodní (např.
estradiol, estrone), tak syntetické (např.
ethynylestradiol) jsou pravděpodobně
základní příčinou.
• Řada důkazů ED a narušení reprodukce v rybách v
tocích pod výpustěmi ČOV:
– Poměr pohlaví: velká převaha samic
– Intersex: zvýšený výskyt
– Neobvyklý vývoj ovárií
– Zvýšené hladiny vitellogeninu (proteinu vaječného
žloutku) v dospívajících samcích
https://www.youtube.com/watch?v=25zr_mseZOM
(Příroda s hormony)
• Prvně identifikovány
díky současnému
výskytu samčích a
samičích pohlavních
buněk v gonádách –
intersex u ryb v UK
• Exponovaní samci
pstruha
• Měření VTG (ng/ml)
C 6.25 12.5 25 50 100 25 25/25
10
100
1000
10000
100000
1000000
10000000
100000000
*
*
oestrone (ng/l) E2 oes/E2
Octylphenol and 17 ß oestradiol
C MC 1 10 100 1 10 10010
100
1000
10000
100000
1000000
10000000
100000000
Initial
Final
OP µg/l E2 ng/l
*
*
*
Produkce vitellogeninu v samcích ryb exponovaných
látkami z výpustí ČOV v prostředí
ČOV a endokrinní disrupce
• klece s pstruhy umístěny v řece pod výpustí ČOV a dále po toku
(do vzdálenosti 14 km)
• sledována hladina vitelogeninu u samců
• koncentrace VTG významně zvýšena ještě ve vzdálenosti 4,5 km
za výpustí ČOV
Expozice dospělých
ryb estrogenními
látkami vede k
feminizaci samců
Halančík
(Fundulus heteroclitus)
• 3 populace
• 2 estrogenní látky
– NP, BPA
Ekosystémová studie – Kanada
2000-2005
Estrogen (17α-ethynylestradiol) aplikován
do jezera – cílová konc. 5 ng/L
(v povrchových vodách v Evropě 0–23ng/L)
- poločas života 12 dní
- aplikován 3x týdně po 21 týdnů (jaro-podzim)
- 1. rok - nejvýznamnější účinky u ryb s kratší dobou života, které se třou
jen 1x za sezonu (střevle) – zvýšení hladin VTG 9000x u samců,
zpoždění vývoje gonád
- 2.,3. rok – vajíčka v samčích gonádách, pokles reprodukce, téměř
žádná nová generace střevlí – kolaps populace
- podobné, ale méně výrazné účinky u tloušťů - výskyt
intersexu (delší doba života, více tření za sezonu)
- 3. rok pokles populací a méně mladých i u dravých ryb – pstruha
jezerního – především díky nedostatku potravy
⇒ OVLIVNĚNÍ CELÉHO EKOSYSTÉMU
- Po ukončení aplikace – za 2 roky – recovery – znovubudování populací
střevlí a tloušťů, zvýšení populačních hustot pstruha
(Kidd et al., 2006, 2007)
Některé kontaminanty mohou působit jako androgeny
(anti-estrogeny)
Organocíny
Image by M & T Chemicals Inc., Woodbridge, NJ.
Stabilizátory plastů
Biocidy: Fungicidy
Insekticidy
Bactericidy
Nátěry proti zarůstání a nánosům na
trupech lodí (Anti-fouling paints)
TBT = tributylcín
Pomalá biodegradace
Akumulace ve vodě a sedimentu
Bioakumulace
TBT používán na lodě od 60. let
První efekty na měkkýších - 70. léta
Zákaz používání v EU - 2003
Vliv na
metabolismus
steroidních
hormonů
P450 aromatase
TBT
TBT způsobuje maskulinizaci ryb
Ryby exponované TBT od vykulení po 70 dní
TBT (ng/L)
McAllister & Kime, 2003
Danio pruhované
(Danio rerio)
Spermie po 3 - 5 měsících expozice
DDT a ztenčování skořápek v
dravých (i rybožravých) ptácích
• DDT bylo hojně používáno přes 30 let
• Biokoncentruje se v potravním řetězci
• V dravých ptácích způsobilo ztenčování skořápek
• To způsobilo, že se mnoho vajíček rozbilo ještě před
vylíhnutím
• Populace některých dravých ptáků dramaticky poklesly
• Po zákazu DDT (70. léta) zase vzrostly
Endokrinní disrupce u dravých
ptáků
Přírodní populace: Dravci a DDT
Mechanismus není zcela znám
hypotéza: ovlivnění prostaglandinu → transportu Ca a Na2CO3
zjištěno ztenčení skořápek po expozici estradioly
⇒ na úrovni ED ?
Populace sokolovitých ptáků ve Velké Británii
U obojživelníků působí ED´s na několika úrovních:
• v embryonálním a larválním období
• při metamorfóze
• v období diferenciace gonád
• v období sekundární pohlavní diferenciace a
v dospělosti (narušením chování)
Narušení endokrinního systému
obojživelníků
Obojživelníci mají vyšší citlivost k
znečištění prostředí (transdermální přenos)
Ovlivnění sexuálního vývoje
Některé EDCs ovlivňují regulační systém pohlavních steroidů. Pokud takové EDCs
působí na populaci larev v období vývoje gonád, dochází ke změně poměru
pohlaví, intersexu.
Ovlivnění druhotných pohlavních znaků - velikost svalu m. dilatator laryngis. U samců je
tento sval vyvinut mohutněji. Při působení xenoandrogenů se sval zvětšuje.
Endokrinní disrupce u obojživelníků
Ovlivnění procesu metamorfózy
Následkem předčasné metamorfózy
vznikají extrémně malí jedinci,
neschopní reagovat na změny
přírodních podmínek, živit se větší
potravou a s nízkými energetickými
rezervami.
Možný abnormální vývoj končetin výskyt
malformací končetin.
Expozice atrazinem způsobuje
hermafroditismus u samců žab
0.1 ppb atrazin (30 krát méně než US limit na pitnou vodu a 2000 krát méně než
standard pro krátkodobou lidskou expozici)
Samec – testes → oocyty v testes Samec – testes → ovaria
spermie
oocyty
malá oblast se
semennými váčky
Rana pipiens
(skokan levhartí)
Projevy ED u bezobratlých:
Narušení reprodukce, rodivosti (fekundita)
Poruchy růstu, sexuálního dozrávání (maturace)
Zvětšení/zmenšení pohlavních žláz
Narušení sexuálního dimorfismu, Intersex, Imposex,
další procesy řízené hormony: pigmentace,
regenerace končetin, diapauza
?AG
 Zkratka pro „superimposed sex“:
dodatečná tvorba samčích pohlavních znaků v samicích
gonochoristických předožábrých plžů, která vede ke sterilitě
 Je indukován působením přírodních i syntetických androgenů
 Byl pozorován u více než 160 druhů na světě
Imposex
Intersex
 Změna nebo nahrazení samičích pohlavních znaků u samic
samčími znaky a naopak
 Postupná přeměna morfologie samičích pohlavních znaků k
morfologické struktuře samčích znaků a naopak
 Je hodnocen jako Intersexový Index (ISI) = průměrná hodnota
všech stupňů intersexu ve vzorku
Superfemale
 Abnormální velikost, počet nebo funkce samičích pohlavních orgánů
 Je indukován působením přírodních i syntetických estrogenů
Projevy intersexu u korýšů
Ostrava-Karviná
- zatopené poklesové plochy
- reflotace
- Chráněný druh
Intersex u přírodní populace
raka bahenního (Pontastacus
leptodactylus)
Blešivec potoční
(Gammarus fossarum)
TBT narušuje hormonální rovnováhu
u měkkýšů
Hladina testosteronu Hladina estrogenů
Morcillo & Porte 2000
Velká kobercová škeble (Ruditapes decussatus)
FF
IMPOSEX u předožábrých plžů
Nepřímý xeno-androgenní efekt organocínů
(persistentní, používány na nátěry lodí)
- Tvorba penisu a chámovodu u samic
- Maskulinizace samic
- Efekt chronické expozice biocidu TBT u
necílových organismů
(EC50=0.72μg TPhT/kg u P. antipodarum)
F M
Důsledek: lokální vymizení populací měkkýšů
Širší souvislosti kontaminace organocíny
ve vodním prostředí
Kolaps populace měkkýšů
Snížení spásání řas a makrofyt
Velký rozvoj populací vodních rostlin, zarůstání
vodních toků
Pokles populací ryb
Takto je dramaticky ovlivněn celý akvatický
ekosystém
Standardní testy OECD
• Androgenised Female Stickleback Screening Assay - anti-androgenní
aktivita u koljušky
• 21-day Fish Endocrine Screening Assay – ED u střevle a dania
• Repeat Dose 28-Day Oral Toxicity Study in Laboratory Rats - ED u potkanů
• Hershberger Assay – detekce androgenní agonistů, antagonistů a inhibitorů
5α-reduktázy u potkanů
• Stably Transfected Transcriptional Activation (TA) Assay – in vitro
estrogenní aktivita na receptoru lidských rakovinných buněk
• Uterotrophic Bioassay – estrogenní aktivita u potkanů
• Reprodukční standardní in vivo testy – ryby, ptáci, hlodavci, kroužkovci,
hlísti, chvostoskok, dafnie
Problémy testování ED
• Prokázání kauzality expozice – efekt
• Nelinearita křivky dávka/odpověď
• Nedostatečné informace o mechanismech
účinku, zaměření pouze na efekty na
receptorech
• Problém environmentálních vzorků, směsí
• Nedostatečné informace o ED potenciálu látek
• Velmi nízké účinné koncentrace EDCs
Shrnutí
• Endokrinní disruptory jsou rozšířeny v prostředí a
zahrnují přírodní i antropogenní látky
• Mají různou chemickou strukturu a působí na velmi
nízkých koncentracích – obtížně chemicky stanovitelné
• Mohou mít závažné důsledky pro volně žijící organismy,
neboť přímo narušují reprodukci a tím i „evoluční
kondici“
• Biologické testy hrají významnou roli v detekci,
charakterizaci potenciálního vlivu endokrinních
disruptorů, a hodnocení jejich odstraňování v
čistírenských procesech, což je velmi aktuální
problematika
Inovace tohoto předmětu je spolufinancována
Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem
České republiky