© 2018 ZPRACOVÁNÍ KLINICKÝCH DAT ANEB STATISTIKA V PRAXI Doc. MVDr. Eva Bártová, Ph.D. bartovae@vfu.cz https://encrypted-tbn1.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcSsZh_qbLc7Jb5pCAo2zzAdHsX0FlQa90Dezc5HKfRapLn sqfzt7Q Parazitární onemocnění TOXOPLAZMÓZA NEOSPORÓZA ENCEFALITOZOONÓZA https://encrypted-tbn0.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcT0GfObWCegxE6QK45B3XP8xSIswPKQBK0TbHb3H29WruF hiRQFHA Kolik lidí se s infekcí setkalo? Zdroje infekce pro člověka? Diagnostika? Prevence? Lidi §75% bez příznaků §25% klinické příznaky - rizikové skupiny Toxoplazmóza - zoonóza http://classconnection.s3.amazonaws.com/271/flashcards/912271/png/toxoplasmosis1358640082797.png Toxoplazmóza - zoonóza §uzlinová forma §oční forma §vrozená toxoplazmóza §mozková, plicní, srdeční, svalová MUDr. Markéta Geleneky, Klinika infekčních nemocí 3.LFUK a Nemocnice Na Bulovce, Praha www.toxoplasmoza.cz www.tehotenstvi-infekce.cz Toxoplasma gondii - historie Systematické zařazení (Volf et al., 2007): Doména: Eukaryota Říše: Chromalveolata Skupina: Alveolata Kmen: Apicomplexa (Výtrusovci) Třída: Coccidea (Kokcidie) Řád: Eimeriida Čeleď: Toxoplasmatidae Rod: Toxoplasma Druh: Toxoplasma gondii Gundi saharský (Ctenodactylus gundii) (Nicolle a Manceaux, 1908) Gundi - severoafrický (Maroko, severní Alžírsko, Tunisko a Libye) hlodavec velikosti morčete, žije v koloniích. ČR - koncem roku 2008 import 10 kusů, první odchov v ČR v Zoo Praha v září 2009. Toxoplasma gondii – infekční stádia Sporozoiti 2 x 6 - 8 μm, uvnitř oocyst (více rhoptrií a mikronem než tachyzoit) oocysta 11 x 13 μm uvnitř dvě sporocysty, každá po čtyřech sporozoitech Bradyzoiti (cystozoiti) 5 - 8,5 x 1-3 μm, nachází se uvnitř cyst tkáňová cysta (5 – 100 μm) ve vnitřních orgánech a tkáních (CNS, svaly, oko, srdce..) chronická fáze infekce Definitivní hostitel? Mezihostitelé? Infekční stádia? Tachyzoiti (endozoiti, trofozoiti) 2 x 6 μm, dělí se uvnitř jaderných buněk endodyogonií akutní fáze infekce životní cyklus - T Toxoplasma gondii – životní cyklus Prepatentní perioda (doba od infekce po vylučování oocyst): 3 - 10 dnů po infekci TC, > 18 dnů po infekci oocystami. Vylučování oocyst 1–3 týdny až 150 milionů oocyst (Bártová et al., 2003) – experiment, vylučování za 3-5 dnů po infekci TC, vylučování 7-18 dnů, max. 5-6 den, celkem 1-47 miliónů oocyst. Klinika u koček? Opakované vylučování? https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/0/0d/Jaroslav_Flegr_-_portrait.jpg §Prof. RNDr. Jaroslav Flegr, CSc., Přírodovědecká fakulta, Karlova univerzita, dílo Zamrzlá evoluce §Ig Nobel (za výzkum, které přinutí k zasmání a poté k zamyšlení) §http://pokusnikralici.cz/ Manipulační teorie Toxoplasma gondii Infikovaní: Ø2,7x vyšší riziko dopravních nehod Øméně vadí pach kočky Øvliv na vzhled, chování, povahu, reakční časy, pohlaví plodu, rizikové chování, sexuální preference … Øzvýšení rizika výskytu cca 70 onemocnění včetně schizofrenie, deprese, infarktu myokardu, nádorových, psychiatrických, imunitních a neurodegenerativních. Založeno pouze na statistickém vyhodnocení Toxoplasma gondii – cesty šíření Tkáňové cysty, oocysty - perorální infekce Toxoplasma gondii – cesty šíření Tachyzoiti - transplacentární infekce, transfuze, transplantace, kozí mléko… Zvířata §bez kliniky x klinika §domácí, volně žijící, zoo zvířata §ovce, kozy - aborty, ekon. ztráty §mořské vydry, antilopy, manul - úhyny http://www.zivapriroda.sk/wp-content/uploads/2015/03/manul.jpg Toxoplasma gondii Diagnostika - průkaz T. gondii 1 Nepřímé metody: §serologie (detekce protilátek, organismus se setkal s infekcí, titry) §LAT, IFAT, ELISA §sérum, masová šťáva Průkaz T. gondii – nepřímé metody Latex aglutinační test (LAT, MAT) - rychlý orientační test Sada PASTOREX TOXO §kapka latexové suspenze (antigen T. gondii) + kapka ředícího roztoku + 15 μl krevního séra, smíchat tyčinkou, otáčet aglutinační kartu, po 5 až 7 min - aglutinace Průkaz T. gondii – nepřímé metody Nepřímý imunofluorescenční test (NIFR, IFAT) §sklíčka s antigenem T. gondii + ředěné sérum (1:40, 1:50..) - vazba antigen-protilátka §vazba konjugátu (Ab s s fluoresceinem) na protilátky §immunofluorescenční mikroskop pozitivní negativní Průkaz T. gondii – nepřímé metody Enzymová imunoanalýza (ELISA) §Destičky s antigen T + ředěné sérum – vazba antigen-protilátka §vazba konjugátu (protilátka IgG konjugovaná křenovou peroxidázou) §spektrofotometr - detekce peroxidázové aktivity na substrátu = barevný produkt pozitivní negativní P8040018 Průkaz T. gondii – přímé metody Flotace §založena na vyšší specifické váze flotačního roztoku (cukerný roztok) než parazitárních útvarů §po centrifugaci vyplavou parazitární útvary ve zkumavce na hladinu Průkaz T. gondii – přímé metody Mikroskopie §barvené otiskové preparáty §histopatologie Otiskový preparát – mozeček Otiskový preparát – slezina Průkaz T. gondii – přímé metody Experiment, izolace §biologický pokus (Balb myši) §buněčné kultury (Vero) T. gondii oblast TGR1 E 1 - velikostní standard, 2 - pozitivní kontrola (194 pb), 3 - pozitivní vzorek, 4 - negativní kontrola IMG_1434[2421]111 1 - 100 bp velikostní standard, 2 - virulentní kontrola (kmen P-CZ), 3 - avirulentní kontrola, 4 -izolát K24 Molekulární metody §PCR, PCR/RFLP, genotypizace T. gondii oblast TGR1 E 1 - velikostní standard, 2 - pozitivní kontrola (194 pb), 3 - pozitivní vzorek, 4 - negativní kontrola Ducks_and_poultry Ø kozy 66 % (n = 251) Bartova a Sedlak 2013 Ø ovce 59 % (n = 547) Bartova et al. 2010 Ø kočky 44 % (n = 286) Sedlak a Bartova 2006 Ø prasata 36 % (n = 551) Bartova a Sedlak 2011 Ø psi 26 % (n = 413) Sedlak a Bartova 2006 Ø pštrosi 25% (n = 298) Bartova et al. non published Ø koně 23 % (n = 552) Bartova et al. 2010 Ø drůbež 12 % (n = 1108) Bartova et al. 2009 Ø skot 10 % (n = 546) Bartova et al. 2015 Ø králíci 5,5 % (n = 902) Neumayerova et al. 2014 Protilátky u domácích zvířat v ČR (2006-2015) jelen_lesni_Cervus elaphus2 Protilátky u volně žijících zvířat v ČR (2006-2016) fallow 2211 lw2 Ølišky 100 % (n = 80) Bartova et al., 2016 Øprase divoké 40 % (n = 656) Racka et al., 2015 26 % (n = 565) Bartova et al. 2006 Øpřežvýkavci 32 % (n = 720) Bartova et al., 2007 Øexot přežv. 31 % (n = 184) Bartova et al., 2017 Øzajíci 20 % (n = 333) Bartova et al. 2010 Ødrobní savci 3 % (n = 240) Machacova et al. 2016 Zajíci vysoce vnímaví k infekci – úhyny po exper. infekci !! Léčba a prevence T. gondii Lidi §zabezpečit dětské hřiště §dodržovat hygienu (kočičí záchodky, ovoce, zelenina, prkýnka v kuchyni při práci se syrovým masem…) §konzumovat tepelně opracované masné výrobky !! tepelné opracování masa (min 67 °C 10 min / -12 °C 48 h) nasolení (> 2% soli 1 den) Prevence Zvířata §zamezit přístup koček (hlodavců, ptáků) do chovu §podestýlka, krmivo, voda, pastva – bez oocyst §krmit masem bez TC (labor. myši, hovězí) Neospora caninum nonsporulated oocyst sporulated oocyst Intermediate host infected fetus contaminated food and wated trasfer of tachyzoites through placent definitive host tissue cysts Infection with tissue cysts Neosporóza – u zvířat §není zoonóza, ale protilátky byly zjištěny i u lidí Zvířata §domácí, volně žijící, zoo zvířata §skot – aborty §psi - oční a nervová forma §léčba, prevence http://www.aspenvetservice.com/fastfacts/image002.jpg Encephalitozoon cuniculi Encephalitozoonoza – u zvířat Králíci - postižení nervového systému s poruchami rovnováhy a vychýlením hlavy na jednu stranu jedná se o zoonózu! http://teddyhome.nl/wp-content/uploads/2015/02/max-003.jpg Možnosti spolupráce se statistiky? Statistika Vzorkování (sampling) §předem vypočítat počty odebíraných vzorků (dle celkového počtu zvířat, využití statistik ministerstva zemědělství..) §problém spolupráce s chovateli, myslivci… §nedostatečné údaje pro statistické zpracování Data pro statistické zpracování §celkový počet a počet pozitivních zvířat ØJaká je prevalence? ØStatisticky významné rozdíly v prevalenci dle různých faktorů? ØZávislosti, korelace, modely? Statistika Ověřování hypotéz – toxo/neo/encef pozitivita (ne)záleží na: Øvěk (různé věkové kategorie) Øpohlaví (samec x samice x kastrát) Ørůzné státy, kraje, lokality, farmy, velikost farem Øroky a roční období Øplemeno, velikost plemen (např. psů) Øvyužití (pet, jatečné, práce..) Østáj x pastva Øpřítomnost definit. hostitelů, domácích zvířat Øtyp krmiva, co loví (masožravci/býložravci) Øklinické příznaky x bez příznaků…. Statistika – toxo, neo u skotu,ČR Kraj Počet vzorků N. caninum (cELISA) T. gondii (ELISA) Pozitivní (%) % I Pozitivní (%) p-value OR 95%CI Střední Čechy 185 2 (1.1%) 78 and 85 19 (10%) 0.774 1.091 0.604; 1.971 Plzeň 147 1 (0.7%) 47 12 (8%) 0.444 0.770 0.392; 1.509 Ústí nad Labem 125 0 (0%) – 18 (14%) 0.046 1.841 1.003; 3.380 Liberec 43 0 (0%) – 4 (9%) 0.916 0.944 0.324; 2.753 Hradec Králové 30 0 (0%) – 0 (0%) 0.064 0 – Praha 11 0 (0%) – 0 (0%) 0.270 0 – Karlovy Vary 5 0 (0%) – 0 (0%) 0.460 0 – Celkem 546 3 (0.5%) 47 – 85 53 (9.7%) STATISTICA Cz 10, OR – odds ratio, 95% CI (confidence interval) Pohlaví Počty koní IFAT (%) cELISA (%) Chi-square test, df, p-valuea Samice 315 5 (1.6 %) 32 (10.2 %) IFAT (1.67, df = 3, p = 0.434, cELISA (13.28, df = 2, p = 0.0013) Samec 182 5 (2.8 %) 11 (6 %) Kastrát 146 5 (3.4 %) 27 (18.5 %) Věk (roky) IFAT (2.64, df = 3, p = 0.4507), cELISA (1.30, df = 3, p = 0.7281) < 1 – 4 105 3 (2.9 %) 10 (9.5 %) ≥ 4 – 9.5 196 3 (1.5 %) 27 (13.8 %) ≥ 9.5 – 15 178 4 (2.3 %) 20 (11.3 %) ≥ 15 – 34 111 5 (4.5 %) 13 (11.7 %) neznámo 53 0 0 Plemeno IFAT (7.76, df = 7, p = 0.3541), cELISA (23.40, df = 7, p = 0.0015) Appaloosa 34 1 (2.9 %) 5 (14.7 %) Ponny 59 3 (5.1 %) 6 (10 %) Quarter horse 62 2 (3.2 %) 12 (19.4 %) Salernitano 30 0 0 Sella Italiana 92 2 (2.2 %) 3 (3.3 %) Trrotters 71 0 2 (2.8 %) kříženci 60 0 7 (11.7 %) další plemena 111 5 (4.5 %) 18 (16.2 %) neznámo 124 2 (1.6 %) 17 (13.7 %) Statistika – toxo, neo u koní v Itálii Statistika – toxo u oslů v Itálii Coefficient Std Error z P -1.98 0 0.9998 Pohlaví (samec) -17.0 -0.002 0.9980 Věk (roky) -0.709 -2.011 0.0443 0.01 Plemeno kříženci -1.37 -2.277 0.0228 0.01 Sicilian-Grey 1.15 1.569 0.1167 Martina-Franca -381 -0.667 0.5047 Amiata -18.0 -0.004 0.9964 Ragusano 0.176 0.192 0.8479 Sardinian -18.5 -0.005 0.9963 Využití Mléko 1.19 -0.004 0.9999 Pet 1.58 -0.002 0.9998 Chov 17.9 -0.007 0.9944 Přítomnost psů -0.28 1.05 0.1750 Přítomnost přežvýkavců -0.31 1.21 0.0980