Metody sterilní práce
Očkování a uchovávání mikroorganismů
Bakteriální druh
o jasně vymezená skupina navzájem príbuzných kmenů, zahrnujících typový kmen
bakteriální kmeny jednoho druhu mají průměrnou nukleotidovou identitu 95 - 96% (Average Nucleotide Identity, ANI)
o druh vykazuje, až na výjimky, shodné fenotypové znaky a současně má některé odlišné znaky od jiných bakteriálních druhů
o hŤŤpsV/help.ezbiocloud.neŤ/bacŤerial-species-concept-explained/
Kultura
o odhaduje se, že pouze 2 % všech mikroorganismů jsou kultivovatelná v laboratorních podmínkách na živných médiích
čistá kultura (jeden druh) x smíšená (několik druhů) x technická (výzkum, provoz)
o přeočkovávaní- přenos kultury na čerstvé médium (oživení, izolace, odečet vlastností, diagnostika)
o bakteriální kolonie = klon jedné buňky
o Colony forming unit (CFU) = buňka schopná vytvořit kolonii; udáváno v CFU/ml indikuje množství životaschopných buněk, které jsou schopné reprodukce a tím pádem tvorby jednotlivých kolonií
Izolace bakteriálního kmene
o = získání čisté kultury
o mohou se využít selektivní média - vyroste jen daný taxon
o metoda izolace = Krížový roztěr
= postupné zřeďování původní kultury za účelem zisku jednotlivých kolonií, které pak hodnotíme
o jak udělat správný křížový roztěr?
o https://www.youtube.com/watch?v=zfmdZ4C4SPI&feat ure=youtu.be
o https://youtu.be/qeXS92cWjw8
Izolace čisté kultury z kultury smíšené
Média pro očkování kultury
o ve cvičení pracujeme s čistými kulturami získanými z České sbírky mikroorganismů (hŤŤps://www.sci.muni.cz/ccm/), kultivujeme podle jejich doporučení
o kmeny z prostredí - snažíme se dodržet pro ně přirozené podmínky (koncentrace soli, živiny, teplota)
o zvažujeme aspekty růstu kultury (pracujeme s čistou či smíšenou kulturou?), zvažujeme limit živin, kyslíku, typ kultivace (stacionární, kontinuální), homogenitu růstu; odlišně bude probíhat růst v tekutém médiu a na agaru (jiná distribuce živin, kyslíku)
Kultivace
o kultivace - předstupeň izolace, identifikace, stanovení citlivosti na ATB... o typy kultivace - pro kultury v tekutém médiu:
o kontinuálně
o chemostat - růstová rychlost kultury je v něm řízena koncentrací limitující živiny, která je přítokem nového média dodávána
o staticky
o submerzní kultivace (třepaná) nebo vzdušněná (promícháváním se zvětšuje plocha fázového rozhrania může probíhat efektivnější výměna plynů)
Nároky mikroorganismů na teplotu
termofilní- optimum cca nad 55 °C; extrémní termofilní druhy rostou kolem 100 °C
mezofilní mikroorganismy
o optimum růstu 20 - 40 °C
o většina bakteriálních druhů; parazitické mikroorganismy
o Pseudomonos (některé její druhy mohou růst i při nízkých teplotách v lednici (4 °C)!
psychrofilní mikroorganismy
o optimum růstu pod 20 °C
o oceány, jeskyně; mohou růst i v ledničce! - např. pseudomonády, aeromonády, listerie
Další vybrané nároky
o nároky na tlak - barofilní, barotolerantní o nároky na živiny o zdroj uhlíku
o heterotrof - organické látky (živočichové, houby,.
o autotrof-C02 (anorg. látky) o zdroj energie
o fototrof -světelná energie (rostliny, řasy,..)
o organotrof - organické látky
o litotrof - anorganické látky o nároky na redoxpotenciál, pH
Vztah mikroorganismů ke kyslíku
o aerobní
o fakultativně anaerobní (aerobní prostředí je pro ně výhodnější energeticky, ale nevadí jim anaerobní prostředí)
o anaerobní
o striktně/Obligátně anaerobní (kyslík je zabíjí)
o aerotolerantní (přežijí nízké koncentrace kyslíku)
mikroaerofilní- potřebují určité nízké
%o2
Vyvíječ plynů
Cos Generating Krt
M-
Table 6.1
e Effect of Oxygen on the Growth of Various Types of Bacteria
Effect of Oxygen on Growth
Bacterial Growth in Tube of Solid Growth Medium
a. Obligate Aerobes
Only aerobic growth; oxygen required
b. Facultative Anaerobes
Both aerobic and anaerobic growth; greater growth in presence of oxygen
c. Obligate Anaerobes
Only anaerobic growth; ceases in presence of oxygen
d. Aerotolcrant Anaerobes
Only anaerobic growth; but continues in presence of oxygen
c. Microaerophilcs
Only aerobic growth; oxygen required in lew concentration
Explanation     Growth occurs only where of Growth       high concentrations of Patterns oxygen have diffused into
the medium
Explanation     Presence of en/yuies of Oxygen's     catalase and superoxide Effects dismutase (SOO) allows
toxic forms of oxygen to be neutralized; can use oxygen
Growth is best where most oxygen is present, but occurs throughout tube
Presence of enzymes catalase and SOD allows toxic forms of oxygen to be neutralized; can use oxygen
Growth occurs only where there is no oxygen
Lacks enzymes to neutralize harmful forms of oxygen; cannot tolerate oxygen
Growth occurs evenly; oxygen has no effect
Presence of one enzyme. SOD. allows harmful forms of oxygen to be partially neutralized; tolerates oxygen
Growth occurs only where a low concentration of oxygen has diffused into medium
Produce lethal amounts of toxic forms of oxygen if exposed to normal atmospheric oxygen
Cc**'^a O 20to Roarion Educaton. nc
Růstová křivka
grafické vyjádření závislosti počtu buněk na délce statické kultivace
1 Lag fáze - buňka se přizpůsobuje novým podmínkám
2 Fáze zrychleného růstu (fáze fyziologického mládí) - buňky se přizpůsobily a začínají růst
3 Log fáze Jlogaritmická/exponenciální fáze růstu) - bunky se dělí konstantní maximální rychlostí, dokud nezačnou docházet živiny v médiu
4 Fáze zpomaleného růstu - hromadění metabolitů, snížení intenzity metabolismu
5 Fáze stacionární-vyčerpání živin, počet nových buňek stejný jako počet odumírajících, mohou vznikat spory
6 Fáze odumírání - buňky žijí ze zásob a pomalu odumírají
o — o
c
>o o
CL
CO O
č
•X S
I
01
—
	■S lE
•4,5 6	f celkový počet
rí "T * h \ i	^ ^ ^ počet živých s s bakterii
	v. \ >
II             II 1	
i r     iľ    'i '	-1-r       i-1 ' čas
Diauxie
o postupné využití substrátu
o napr. nejdříve využití jednoduchého zdroje energie - glukóza
o potom nastartován metabolismus potřebný pro využití složitějšího substrátu - laktóza
CH^OH
Lactose  I_q qh
Lactase
CH2OH
Glucose /—O.
OH
CH OH
Galactose
V)
c ©
■o
'C
S o
co
Lactose used
Short lag phase
Glucose used
4 6
Time (hours)
8
FIG. 19.3. Diauxie of diphasic growth curve of E. coli grown with a mixture of glucose and lactose. Glucose is first used, then lactose. A short lag phase In diauxie growth Is present during which the bacterium synthesizes the enzymes needed for use of lactose.
Uchovávání bakterií
je nutné zajištění životaschopnosti
o na Petriho misce pri 4 °C (krátkodobě, nutno preočkovávat)
o ve zkumavce v agaru ve vpichu - měsíce
o na šikmém agaru v lednici pri +4 °C - týdny
o na porézních materiálech - želatínových discích, kuličkách
o lyofilizované - lyofilizace = vymražení vody ve vakuu sublimací vody
o kryoprezervace - zmražení na - 80 °C po malých objemech v hlubokomrazicím boxu
(měsíce, roky)
o boxy s pevným C02 - suchý led (-78 °C)
o zamražení kultur v tekutém dusíku (až-196°C) uchovávání neomezeně dlouho
Postup
o všechny zkumavky i Petriho misky popíšeme fixou (druh, kmen, skupina, datum, své iniciály). POPIS NA SPODNÍ STRANU PET. MISKY!
o ! aseptická práce o ! žíhat hrdla a kličky o ! misky otevírat co nejméně
o každý pracuje sám - 3 misky, 1 šikmý agar, 1 tekuté médium
Tekuté půdy
o popsat zkumavku
o zapnout kahan, ožíhat kličku, nechat vychladnout
o nebezpečí spálení MO příliš horkou kličkou o nabrat kulturu - cca % kličky
o malíčkem otevřít vršek (malíčkem i vršek držet v dlani), ožíhat zkumavku
o kličkou nanést kulturu těsně nad okraj hladiny na stěnu zkumavky, zkumavku ožehnout, zavřít, ožíhat kličku
o postupně vmíchat kulturu ze stěny zkumavky do média (poklepáváním zkumavky)
o kultivujeme při 30 °C 24 hodin v termostatu
o pro ukázku tekuté půdy (mírně odlišný postup než děláme ve cvičení) https://youtu.be/QCgXJ8hjazs
Šikmý agar
popsat zkumavku
vyžíhat kličku a nechat vychladnout
nabrat cca % kličky
malíčkem otevřít vršek (malíčkem vršek držet v dlani), ožíhat zkumavku
kličkou vytvořit „hádek" na šikmý agar odspodu
ožíhat zkumavku, zavřít, ožíhat kličku kultivujeme při 30 °C 24 hodin v termostaTu
pro ukázku zaočkovaní šikmého agaru https://youtu.be/liGGmHXLm1 o
Petriho misky
o 1. křížový roztěr - čistá kultura
o 2. křížový roztěr - směsná kultura G+ a G- (zde nepoužívat Bocillus cereus -jeho růst je „agresivnější" a ve smíšeném vzorku by Bocillus druhou kulturu „přerostl")
o 3. misku rozdělit na čtvrtiny a pomocí kličky tvořit
hádka od okraje ke středu o kultivujeme při 30 °C 24 hodin v termostatu
Pro ukázku křížového roztěru https://youtu.be/qeXS92cWjw8 https://www.youtube.com/watch?v=_1 KP9zOtjXk
Kultury
G-
o Escherichia coii CCM 3954 (fakultativně anaerobní) 3*
o Pseudomonas fiuorescens (aerobní) 4*
o Serratia marcescens CCM 303 (fakultativně anaerobní) 1*
G+
o Kocuria rosea CCM 839 (aerobní) 7*
o Micrococcus iuteus CCM 169 (aerobní) 6*
o Bacillus cereus CCM 2010 (fakultativně anaerobní) 2*
o Staphyiococcus aureus SA 812 (fakultativně anaerobní) 5*
kvasinky
o Saccharomyces cerevisiae (fakultativně anaerobní) 8*
* označení MO na zkumavkách, Petriho miskách
Podklady pro vyhotovení protokolu
o Do protokolu podle prezentace/skript/výsledků a fotek: o vyplníte cíle, principy, postupy, odpovíte na dané otázky
o vyhodnotíte makroskopické znaky, doplníte tabulku v protokolu
o odpovíte na otázky v závěru
Teoretické podklady pro vyhodnocení
protokolu
- Makroskopické pozorování
Makroskopické pozorování
o spočívá v popisu kolonií
o liší se dle typu živného média, stáří kultury a typu kultivace
Odečítání morfologie bakteriálních kultur
v» ■ r ■   v/v r ■  ~\s • • *     I * I        I        ^    * I i i« /
o pn povedeném krizovém rozteru jsou na misce viditelné jednotlivé kolonie = shluky buněk vzniklých klonováním jediné buňky
hodnotíme jejich:
o tvar (kruhový, nepravidelný, vláknitý)
o okraje (hladké, zvlněné)
o profil (plochý, vypouklý, kráterovitý)
o povrch (lesklý, matný)
o zbarvení
Profil:
plochý
vwoukhj
pupkov* lý
l»IV)ľlí!lOVÍI«j
Tvar:
okrouhli;
laločtiaiij
^0
sektorový
Okrate1
vroubkovaiié
t J
brsdavčilij
Obr. 2: Tvary bakteriálních kolonií (Rosypal, 1981)
v:
niijcclialm'
"I "Ä
drsné, pislovilé (capul medusae)
vláknité
rijoulriŕ
Ivar
Qkra-'e
Heilet
ľ"íT>rí..-idtlzi^    V.uzľc;- Eizcidou
VliLzdtc     2trouc c3c LíLoidijí-
I'ÍLľ 3 "dovity
Tekuté půdy
o nevidíme jednotlivé kolonie, nelze tedy prokázat čistotu dané kultury
o hodnotíme charakter růstu
o hodnocení přítomnosti mikroorganismů:
o blanka - špatná smáčivost, u většiny kultur tvořících drsné vrásčité kolonie
o zákal - rovnoměrný růst v celém objemu média
o vločky-aerobní kultury
o sediment - fakultativně anaerobní mikroorganismy
zbarvení = tvorba pigmentu Difúzni zákal
v celém médiu
Šikmý agar
o nezískáme jednotlivé kolonie
o hodnotíme rychlost růstu a tvar, povrch a profil nátěru či tvorbu pigmentu
Podklady pro vyhodnocení protokolu
-fotky k úkolům
Saccharomyces cerevisioe
Micrococcus      Psedomonas        Serratia _   _      _ Serratia
luteus fluorescensu marcescens       Escherichia coli      marcescens Bacillus cereus
Výsledky - tekuté médium a šikmý agar
Výsledky - tekuté médium a šikmý agar
Kocúria rosea     Saccharomyces    Serratia Bacillus cere us       Micrococcus Serratia
cerevisiae marcescens lute us marcescens
Výsledky - 4 druhy MO na Petriho misce
KŘÍŽOVÝ ROZTĚR SMÍŠENÉ KULTURY
Serratia marcescens o Saccharomyces cerevisiae