Design shRNA a gRNA
Teoretický úvod ke cvičení a veškeré potřebné informace pro design shRNA a gRNA sekvencí byl podán na úvodní přednášce, která je součástí studijních materiálů k předmětu BÍ6405 Metody molekulární biologie - cvičení. Jako modelový případ byl vybrán myší gen tacstd2.
Kódující sekvence genu tacstd2 s vyznačenými cílovými sekvencemi pro shRNA (žlutě) a gRNA (modře).
Atggcgaggggcttggatctagcaccgctgctactgctactgctggcgatggcgacccgcttttgcacggctcag agcaactgtacatgccccaccaacaagatgacggtctgcgacacaaatggcccaggcggggtctgccaatgtcgg gcaatgggctcacaggtattggtcgactgctccacgctaacttccaagtgcctgctgctcaaggcgcgcatgagc gcccggaagagcggccgcagcctggtgatgccgagcgagcacgcgatactggacaacgatggcctctacgacccg gagtgtgacgacaagggccgcttcaaggcgcgccagtgcaaccagacctcggtgtgctggtgcgtaaactcggtg ggcgtgcgccgcacggacaagggagaccaaagcctgcgctgcgacgaagtggtgcgaacccaccacatcctcatt gagttgcgccaccgcccgaccgaccgagccttcaaccactctgacctagactccgagctgcggcggctcttccaa gaacgctacaagctgcaccccagcttcctatccgcggtacactatgaggagcccaccattcagatagagcttcgg cagaacgcgtcgcagaagggcttgagagacgtggacatcgctgatgccgcctactacttcgaaagggacattaaa ggcgagtcactgttcatgggccgccgcggcctggacgtgcaggtgcgtggggaacccctgcatgtggagcggacg ctcatctactacctggacgagaagcccccccagttctccatgaagcgcctcaccgccggcgtcattgccgtcatc gctgtcgtctcggtagcggtagtggctggtgtggtggtcttggtggtcaccaaacggaggaagtcgggcaaatac aaaaaggtggagcttaaggagctgggggagatgagaagcgaacctagcttgtag
Používané plazmidy
lentiCRISPRv2
IH.JĽH Pwl l-i.i lll ľlKll
(M.]H) Fial l
[I2.3Z1I liľ.lWl *S»A| :.;.0P.: Hiu«I ÍJ1.ÍL6? Avm
X bal 'i
pRNA-U6.1/Neo
Příprava klonované sekvence gRNA a shRNA
shRNA:
Konstrukt pro shRNA tacstd2, pro vklonování do pRNA U6.1/Neo plazmidu Oligonukleotid a:
5' GATCCGCAATGGGCTCACAGGTATTGTTCAAGAGACAATACCTGTGAGCCCATTGCTTTTTT GG AAA3 Antisense | Loop | Sense | Termination Signal
Oligonukleotid B:
5' AGCTTTTCCAAAAAAGCAATGGGCTCACAGGTATTGrCTC7TGAACAATACCTGTGAGCCCATTGCCG 3'
BamH I
5'   GATCCGGCAATGGGCTCACAGGTATTGTTCAAGAGACAATACCTGTGAGCCCATTGCTTTTTTGG 3' 3' GCCGTTACCCGAGTGTCCATAACAAGTTCTCTGTTATGGACACTCGGGTAACGAAAAAACCTCGA 5'
Hind III
Jednotlivě nasyntetizované řetězce oligonukleotidů, které jsou k sobě komplementární, je potřeba spojit ve dvouřetězec, který je následně ligován do vektoru pRNA_U6.1/Neo štěpeném BamHl/Hindlll.
gRNA:
cílová sekvence v myším genu tacstd2
CGTCACACTCCGGGTCGTAG AGG
Oligonukleotidy:
Primán fur (MID fluidu:
Name
primer sequence
gN20-guideRNA23íkvU(Í5Eni?lpni1iCrÍ3f]r CACCQcstCEcactceffftcgtag
Jednotlivě nasyntetizované řetězce oligonukleotidů, které jsou k sobě komplementární, je potřeba spojit ve dvouřetězec, který je následně ligován do vektoru lentiCRISPRv2 štěpeném Esp3I.
5'- CACCGCGTCACACTCCGGGTCGTAG- 3'
3'- CGCAGTGTGAGGCCCAGCATCCAAA - 5'
Postup (stejný pro shRNA i gRNA oligonukleotidy):
1. Připravte 20 [A reakční směsi, která obsahuje: 2 [ú (1 [ig) oligonukleotidů A 2 [ú (1 [ig) oligonukleotidů B 1 ul 20x SSC
doplnit vodou do 20 ul analogicky připravte i kontrolní reakce, kde bude pouze jeden ze dvou oligonukleotidů
2. Inkubujte směs 5 minut při 94 °C
3. Nechte reakční směs chladnout 30 min při pokojové teplotě - probíhá renaturace a spojení komplementárních oligonukleotidů do dvouřetězce
4. 15 ul reakční směsi smíchejte s nanášecím pufrem v poměru 5:1 a proveďte agarózovou elektroforézu na 3% gelu. Zbylých 5 ul reakční směsi si ponechte pro ligaci.
Štěpení DNA restrikčními endonukleázami
Při ligaci cizorodé DNA do vektoru je žádoucí, aby frekvence vektorových molekul obsahující začleněnou cizorodou DNA byla co nejvyšší. Ideální je situace, kdy lze jak cizorodou DNA, tak i vektor štěpit současně 2 restriktázami, po jejichž štěpení nevznikají komplementární konce. V tomto případě po ligaci a transformaci získáváme prakticky pouze klony obsahující vektor s cizorodou DNA začleněnou v požadované orientaci.
V případě, že jak cizorodá DNA, tak linearizovaný vektor mají zatupené konce nebo komplementární konce po restrikčním štěpení, získáme po ligaci a transformaci velké množství klonů obsahujících vektorovou DNA bez začleněné cizorodé DNA. Abychom zabránili této „self-ligaci" vektoru, je možné linearizovanou vektorovou DNA defosforylovat na 5'konci pomocí alkalické fosfatázy. Ligaci takto modifikované vektorové DNA s cizorodou DNA vzniká otevřená kružnicová molekula, která je schopná transformace do E. coli.
Různé reštrikční endonukleázy většinou poskytují taková zakončení fragmentů, která nejsou vzájemně kompatibilní a jejich spojení ligaci není možné. Ligaci pak lze provést pouze v tom případě, že se odstraní jednořetězcové přečnívající úseky DNA, čímž se konce dsDNA zatupí. Tento typ modifikace lze provést dvěma způsoby: 1) polymerázovou reakcí, kdy se chybějící úsek DNA dosyntetizuje nebo 2) nukleázovou reakcí, kdy se přečnívající jednořetězec odštěpí.
Pro modifikaci přečnívajícího 5' konce lze použít obě techniky - zpravidla se používá Klenowův fragment DNA polymerázy I nebo nukleáza Mung Bean. Pro modifikaci přečnívajícího 3' konce lze použít pouze nukleázovou reakci. Nejčastěji používanými enzymy jsou T4 DNA polymeráza, Klenowův fragment DNA polymerázy I, nukleáza SI nebo nukleáza Mung Bean.
V našem případě byl postup navržen tak, aby odpovídal ideální situaci popsané výše (tučný text). Tedy, při Honování do pRNA_U6.1/Neo plazmidu jsou BamHI a Hindlll konce nekomplementární a k ligaci tak může dojít pouze po začlenění inzertu kódujícího shRNA.
V případě Honování do vektoru lentiCRISPRv2 je situace poněkud odlišná. Enzym Esp31 (levnější izoschizomer enzymu BsmBV) štěpí mimo svou rozpoznávací sekvenci.
Esp3\:
cleavage I
5'. .CGTCTCN. ... 3' 3'. .GCAGAGNNNNN. ... 5' recognition ^
J " cleavage
Klonovací místo vektoru lentiCRISPRv2 však obsahuje 2 rozpoznávací místa pro Esp3I mezi kterými je jedinečná sekvence. Po štěpeni tohoto plazmidu tak dojde kvyštěpení této sekvence a vznikne lineární plazmid, který nemá komplementární konce. K ligaci tak může dojít pouze po začlenění inzertu kódujícího gRNA
cPPí
[)s;i- IP,
lentiCRISPRvĚ
J6
P kh filler FfS
SpCasB n AG p?a Putu wrnr
Postup:
1A (shRNA). Připravte 30 [ú reakční směsi, která obsahuje:
1 ug plazmidu pRNA_U6.1/Neo 3 [ú lOx restrikčního pufru
2 x 1 ul restrikčního enzymu (BamHI a HindlII) doplňte vodou do 30 ul
analogicky připravte i neštěpenou kontrolu a kontroly pouze s jedním enzymem
1B (gRNA). Připravte 30 ul reakční směsi, která obsahuje: 1 ug plazmidu lentiRISPRv2
3 ul lOx restrikčního pufru
1,5 ul restrikčního enzymu (Esp3ľ) doplňte vodou do 30 ul analogicky připravte i neštěpenou kontrolu
2. Inkubujte reštrikční směsi 75 minut při 37 °C
3. Reakční směs smíchejte s nanášecím pufrem v poměru 5:1 a proveďte agarózovou elektroforézu.
Purifikace fragmentů dna z agarózového gelu pomocí Top-Bio kitu pro extrakci DNA
z agarozového gelu
Celou řadu různých metod lze využít pro purifikaci fragmentů DNA z agarozových gelů. Mezi nejčastěji používané metody patří eluce DNA z gelu na membránu, následné uvolnění DNA z membrány do roztoku a její purifikace. Druhou možností je solubilizace části gelu obsahující fragment DNA a jeho následné přečištění běžnými postupy.
Princip:
Metoda využívá vysokých koncentrací chaotropních solí (pufr LI) k narušení vodíkových vazeb mezi cukernými zbytky v agarozovém gelu, čímž umožňuje jeho solubilizaci. Vysoká koncentrace solí navíc odstraňuje z DNA fragmentů DNA-vazebné proteiny. Po solubilizaci j sou fragmenty DNA adsorbovány na povrch silica částic odkud jsou po promytí (pufr L2) uvolněny lOmM roztokem Tris-Cl, pH=8,5 (pufr L3). Pro purifikaci fragmentů DNA z gelu bude využit Column DNA Lego kit (Top-Bio).
Postup (stejný pro shRNA i gRNA):
1) Rozdělte reštrikční fragmenty elektroforézou, dokud nejsou od sebe dostatečně odděleny. Vyřízněte pomocí skalpelu co nejmenší proužek gelu obsahující požadovaný fragment DNA (štěpený vektor) a vložte jej do zkumavky. Přidejte 700 pl pufru LI.
2) Inkubujte při 55 °C dokud nedojde k úplné solubilizaci agarozového gelu.
3) Kolonku vsaďte do zkumavky. Po úplné solubilizaci agarozového gelu naneste 700 ul roztoku obsahujícího rozpuštěnou agarózu a DNA na kolonku.
4) Centrifugujte 13000g/l minuta/pokojová teplota.
5) Roztok prošlý filtrem kolonky odstraňte a kolonku znovu umístěte na stejnou sběrnou zkumavku. Naneste zbytek roztoku obsahujícího rozpuštěnou agarózu a DNA na kolonku a opakujte centrifugaci (krok 4).
6) Roztok prošlý filtrem kolonky odstraňte a kolonku znovu umístěte na sběrnou zkumavku. Naneste 700 ul promývacího pufru P2.
7) Centrifugace 13000g/l min.
8) Roztok prošlý filtrem kolonky ostraňte a opakujte promývací krok s 500 ul pufru P2.
9) Roztok prošlý filtrem kolonky opět odtraňte, kolonku znovu umístěte na sběrnou zkumavku a centrifugujte 13000 g/l min pro odstranění zbytkového promývacího pufru.
10) Kolonku přeneste do čisté zkumavky, na kolonku naneste 25 ul elučního pufru (L3). Nechte 2 minuty stát při pokojové teplotě.
ll)Centrifugace 13000g/l min.
12)Kolonku odstraňte. Roztok prošlý kolonkou obsahuje čistou DNA (štěpený plazmid) vhodnou pro ligaci.
Tvorba fosfodiesterové vazby mezi 3'- OH a 5'- P fragmentů DNA nebo RNA za účasti kofaktorů (př. ATP) je katalyzovaná ligázami. Ligázy se in vivo účastní procesů replikace, rekombinace či DNA reparace. In vitro jsou pak využívány k tvorbě rekombinatních DNA molekul. Mezi nejčastěji používané ligázy patří ligázy produkované bakteriemi nebo bakteriofágy: např. T4 DNA ligáza, E. coli DNA ligáza, termostabilní DNA ligázy. V současné době existuje několik způsobů vyjádření ligázové aktivity. Komerční firmy obvykle jednotku definují jako množství ligázy, které je potřebné pro ligaci kohezních konců DNA (určitý čas, teplota a určitá DNA štěpená určitou restriktázou). Používají se však rovněž i další jednotky: např. Wei s sova jednotka = množství ligázy, které katalyzuje výměnu 1 nmol 32P mezi pyrofosfátem a ATP za 20 minut při 37 °C.
Postup (stejný pro shRNA i gRNA):
Obecně platí, že ligační reakci provádíme vždy v co nejnižším objemu (obvykle 10 ul). Důležitým parametrem je molární poměr plazmidové a inzertované DNA. V případě, že molekula plazmidu má tupé nebo komplementární konce, by při nadbytku plazmidové DNA v ligační směsi mohl vznikat nadbytek transformatů obsahujících pouze plazmidovou DNA bez zašleněné Honované molekuly DNA. V našem případě však by takovéto molekuly DNA měly vznikat jen ojediněle.
1. Při ligaci je zapotřebí provádět i kontrolní reakce. Obvyklou kontrolou je reakce s naštěpenou DNA bez začleňované DNA a také reakce bez DNA ligázy.
2. Před mícháním reakce si spojené oligonukleotidy (kódující shRNA/gRNA) naředíme
4. Při pipetování postupujeme tak, že do mikrozkumavky napipetujeme nejprve vodu a DNA fragmenty, zahřejeme 5 minut na 45 °C, zchladíme na ledu a přidáme zbytek ligační reakce.
5. Inkubujte reakční směs 10 min při RT (nebo 16 °C přes noc)
Ligace vektoru s cizorodou DNA
50x vodou.
3.  Složeni kompletní reakce:   lOx ligační pufr (jiz obsahuje ATP)
vektorová DNA začleňovaná DNA
1 ul
100 ng 10 ng 0,1 Ml
T4 DNA ligáza (400 U/ul) doplnit vodou do 10 ul
6.  Transformujte kompetentní buňky E. coli.
Příprava kompetentních buněk Escherichia coli DH5a
Byla popsána řada metod umožňující účinný přenos plazmidové DNA do buněk E. coli. Pomineme-li přenos metodou elektroporace (přenos DNA pomocí krátkých impulsů vysokého napětí) patří mezi nej používanější metody navození kompetence bakteriálních buněk pomocí vychlazených roztoků dvoj mocných iontů kovů. Tato metoda byla poprvé popsána již na počátku osmdesátých let (Hanahan, J Mol Biol 1983:166,557-580) a v různých modifikacích je používána dodnes. Pomocí této metody lze dosáhnout účinnosti transformace 5x108 transformovaných kolonií/ug superhelikální plazmidové DNA. Účinnost transformace je výrazně ovlivňována čistotou použitých pufrů a laboratorního skla a také podmínkami pěstování bakteriální kultury.
Pro rutinní přípravu kompetentních buněk v laboratořích je dnes nejčastěji používaná zjednodušená modifikace původní Hanahanovy metody, která umožňuje dosáhnout účinnosti transformace 107 transformovaných kolonií/ug superhelikální plazmidové DNA, což je dostatečné pro Honování plazmidů v běžných aplikacích. Kompetentní buňky připravené touto metodou lze dlouhodobě uchovávat při -80°C.
Postup:
1. Naočkujte 1 kolonii buněk E.coli kmene DH5a do 1 ml růstového média LB a kultivujte přes noc na třepačce při 37°C.
2. Druhý den použijte 0,5 ml této kultury pro inokulaci 100 ml LB. Inkubujte na třepačce při 37°C do dosažení OD550 = 0,5. Při měření absorbance použijte médium LB jako blank.
3. Po dosažení požadované hustoty kulturu promíchejte a ponořte do ledové lázně na 10 minut.
4. Centrifugujte po 25 ml při 2700g/10 minut/4°C v 50 ml sterilních zkumavkách.
5. Opatrně odstraňte supernatant a suspendujte pelet v 5 ml vychlazeného 0,1 M roztoku MgCh sterilní pipetou. Přeneste suspenzi do 15 ml sterilních zkumavek.
6. Centrifugujte při 2700g/10 minut/4°C.
7. Opatrně odstraňte supernatant a suspendujte pelet v 1 ml vychlazeného 0,1 M roztoku CaCh . Přidejte dalších 5 ml vychlazeného 0,1 M roztoku CaCh, opatrně promíchejte a inkubujte v ledové lázni 20 minut.
8. Centrifugujte při 2700g/10 minut/4°C.
9. Odstraňte supernatant a opatrně suspendujte pelet v 1,2 ml vychlazeného zamražovacího pufru (22,5 ml 0,1 M CaCh plus 3,5 ml sterilního glycerolu)
10. Rozdělte po alikvotech 200ul do sterilních mikrozkumavek a zamrazte při -80°C.
Transformace kompetentních buněk E. coli
Pro Honování cizorodé DNA se využívá kmenů E. coli, které byly metodami genového inženýrství upraveny tak, aby byly schopny s vysokou účinností přijímat cizorodou DNA, umožňovaly její replikaci a udržovaly její původní strukturu (tj. nezpůsobovaly vystepování či rekombinaci nakloňované DNA) a dovolovaly selekci rekombinantních plazmidů. Vlastní navození kompetence (schopnosti přijmout cizorodou DNA) spočívá ve vystavení buněk příslušného kmene E. coli v exponenciální fázi růstu vychlazeným roztokům dvojmocných iontů (CaCh, MgCh). Promývání a inkubace buněk v těchto roztocích vede ke změnám v metabolismu buněk a složení jejich buněčné stěny, které jim umožňují přijmout cizorodou DNA (viz. postup přípravy kompetentních buněk E.coli).
Postup (stejný pro shRNA i gRNA):
1. Na ledu pozvolna rozmrazte mikrozkumavku s kompetentními buňkami, přidejte 2 [iL ligační směsi, promíchejte a inkubujte na ledu 30 minut.
2. Inkubujte směs 30 sec minuty při 42 °C a poté ji umístěte na 2 minuty opět na led.
3. Přidejte 1 ml růstového LB média a inkubujte 45 minut při 37 °C.
4. Směs centrifugujte 6000 rpm/1 minuta/RT.
5. Odlijte supernatant vyjma cca 40 \ú, ve kterých resuspendujte bakteriální sediment.
6. Suspenzi přeneste na agarovou plotnu obsahující 50 ug/ml ampicilinu a rozetřete bakteriologickou hokejkou.
7. Inkubujte přes noc při 37 °C.
8. Druhý den přeočkujte jednotlivé rezistentní kolonie křížovým roztěrem na nové agarové plotny s příslušným antibiotikem a inkubujte opět přes noc při 37 °C.
9. Misky lze poté uchovat několik týdnů při 4°C.
Izolace plazmidové DNA metodou alkalické lyže (miniprep)
Z narostlé bakteriální kultury na agarové plotně izolujeme plazmidovou DNA pomocí následujícího postupu.
Postup (stejný pro shRNA i gRNA):
1. Přenést bakteriální kulturu opakovaně plastovou špičkou do mikrocentrifugační zkumavky obsahující 200 |u.l pufru Pl s RNAzou ve výsledné koncentraci 100 |jg/mL.
2. Přidat 200 |u.l roztoku P2. Opatrně promíchat několikerým převracením zkumavky. Inkubovat 5 minut (ne déle) při pokojové teplotě.
3. Přidat 200 |u.l ledově vychlazeného roztoku P3. Promíchat několikerým převracením zkumavky. Zkumavku ponechat 10 minut na ledu.
4. Centrifugovat při 15 000 RPM/15 min/4 °C.
5. Supernatant přenést do čisté mikrozkumavky, přidat 900 ul etanolu, promíchat opakovaným převracením zkumavky a umístit na 15 minut do -80 °C.
6. Centrifugovat při 15 000 RPM/10 min/4 °C.
7. Opláchnout sediment 1 ml 70% etanolu.
8. Sediment vysušit a rozpustit ve 40 ul lOmM Tris, pH=8..
9. Koncentraci a čistotu izolované DNA změřit na Nanodropu.
Použité roztoky:
Pl - 50mM glukóza, 25mM Tris-HCl (pH 8,0), lOmM EDTA
P2-0,2MNaOH, 1% SDS
P3 - 5M octan draselný, pH = 5,2
O tom, že se nám podařilo připravit požadovaný plazmid se následně přesvědčíme pomocí sekvenace. Pro sekvenaci používáme primer doporučený výrobcem daného vektoru. Vzhledem k nízkým cenám sekvenačních reakcí a rychlosti dodání výsledků dnes většinou využíváme služeb komerčních firem. Před odesláním vzorků danému komerčnímu subjektu, se lze o úspěšném začlenění Honované sekvence do vektoru přesvědčit i jiným způsobem -restrikčním štěpením či pomocí PCR. Druhou variantu si ukážeme na příkladu Honování sekvence shRNA pro B-Myb.
Primery pro detekci byly navrženy tak, aby sekvence forward primeru byla komplementární k sekvenci U6 promotoru, jenž je součástí vektoru pRNA-U6.1 neo. Sekvence reverse primeru je pak komplementární k sekvenci, jež je lokalizovaná za klonovacím místem Hindlll-BamHl. V případě PCR pro samotný vektor pRNA-U6.1 neo je očekávaná délka produHu 282 bp. V případě, že došlo k začlenění sekvence pro shRNA do vektoru je očekáván produkt o velikosti 350 bp.
Ověření začlenění klonované sekvence do vektoru
PCR detekce inzerce sekvence pro shRNA do vektoru pRNA-U6.1 neo
Princip:
Postup:
destilovaná voda 16,5 uL
lOxPCRpufr 2,5 uL
lOmM směs dNTP 0,5 uL
20uM forward primer 2 uL
20uM reverse primer 2 uL
100 ng plazmidové DNA 1 uL
Taq polymeráza (5U/ uL) 0,5 uL
celkem 25 uL
Složení PCR reakce:
Průběh PCR reakce:
1. 94°C-2 minuty
2. 95°C-30 s
3. 55°C-30 s
4. 72°C - 30 s
5. bod 2-4 opakuj 30x
6. 72°C - 7 minut
7. 10°C- 1 minuta
Při pipetování PCR směsi se obvykle postupuje tak, že nejprve se zhotoví směs všech složek (mimo plazmidové DNA) spočítaná pro všechny vzorky + negativní kontrolu (PCR reakce bez plazmidové DNA) +1, přičemž jednotlivé složky se pipetují ve výše uvedeném pořadí. Jednotlivé vzorky plazmidové DNA se napipetují do 0,5ml zkumavek a přidá se k nim odpovídající množství PCR směsi. Zkumavky s PCR směsí se poté umístí do termocykléru a spustí se daný program.
Máme-li ověřeno, že se nám podařilo připravit správný plazmid, můžeme přistoupit k otestování jeho účinku v eukaryotických buňkách. Pro tento účel jsme zvolili myší nádorovou buněčno linii 4T1.
Transfekce plazmidů metodou lipofekce do buněčné linie MDA-MB-231
V současné době existuje velké množství metod pro přenos DNA (RNA) do eukaryotických buněk. Volba použité metody závisí na typu buněk, požadované účinnnosti transfekce a v neposlední řadě také na možnostech laboratoře. Při lipofekci dochází nejprve k vytvoření komplexů záporně nabité plazmidové DNA s kationickým lipidovým činidlem. Takto vytvořené komplexy jsou schopny pronikat přes lipidovou membránu do eukaryotických buněk.
V reálné situaci bychom do buněk přenášeli výše připravené vektory. Abychom ale v rámci cvičení již druhý den mohli vyhodnotit úspěšnost transfekce, budeme do buněk přenášet plazmid pcDNA3.1 (Invitrogen, kontrola), respektive plazmid pcDNA3.1-GFP, který nese gen pro zelený fluorescenční protein (GFP). Druhý den tak budeme moci vyhodnotit úspěšnost transfekce pod fluorescenčním mikroskopem, případně pomocí průtokové cytometrie.
Postup:
1. Do 2 mikrozkumavek napipetovat 200 ul média OPTI-MEM (Invitrogen). Do jedné přidáme 2,5 ug plazmidové DNA a 5 jal činidla Lipofectamine Plus (Invitrogen). Do druhé mikrozumavky napipetujeme 5 ul činidla Lipofectamine LTX (Invitrogen).
2. Obě směsi inkubujeme 5 minut při RT, poté je smícháme a ponecháme 30 minut při pokojové teplotě.
3. Přikapapeme tuto směs k buňkám MDA-MB-231 a umístíme je na 24 hodin do CO2 inkubátoru. Po 5 hodinách vyměníme médium (odstranění komplexů Lipofectamine-DNA sníží cytotoxicitu).
4. Po 24 hodinách vyhodnotit účinnost transfekce pomocí fluorescenčnho mikroskopu/průtokového cytometru a následně buňky sklidit a připravit buněčné lyzáty pro SDS-PAGE.
Elektroforéza proteinů a immunobloting
V případě postranskripčního umlčování genů pomocí siRNA/shRNA vyhodnocujeme expresi cílového genu na úrovni proteinu obvykle 24-96 hod po transfekci. Tento čas je mimo jiné závislý na tom, jak je daný protein v buňce „stabilní", tedy za jak dlouho po syntéze na ribozomu dochází k jeho degradaci. V případě mutageneze pomocí CRISPR/Cas9 selektujeme po transfekci buňky na rezistenci k antibiotiku (v našem případě puromycinu). Rezistentní buňky následně Honujeme metodou limitního ředění do 96-jamkových destiček, abychom získali klony vzniklé z jedné jediné buňky. Tyto klony expandujeme a expresi cílového proteinu stanovíme pomocí SDS-PAGE a imunoblotingu.
Postup:
Příprava vzorků:
Buňky MDA-MB-231 promýt v PBS a inkubovat cca 1 min s lmM EDTA v PBS. Poté buňky přenést do 15mL zkumavky a centrifugovat 400g/5 min. Odsát supernatant, suspendovat sediment v 1 mL PBS a znovu centrifugovat při 400g/5 min. Odsát dokonale supernatant a sediment lyžovat v 2xCSB pufru neobsahujícím merkaptoethanol ani bromfenolovou modř, 4 minuty povařit (vzorky lze poté uchovávat při -20 °C). Změřit koncentraci proteinů ve vzorcích DC Protein Assay kitem (Biorad). Vzorky upravit na stejnou koncentraci, smíchat s kompletním 2xCSB pufirem v poměru 1:1a nanést na SDS-PAGE.
Měření koncentrace proteinů (DC Protein Assay Kit):
Na mikrodestičku pipetovat 5 [ú každého vzorku ve třech opakováních. Ke vzorkům přidat 25 [ú roztoku A' (obsahuje 20 [ú roztoku S na 1 mL roztoku A). Přidat 200 [ú roztoku B, zbavit vzorky bublin a ponechat 15 minut stát. Analogicky připravit i vzorky standardu (BSA o koncentracích 0,1; 0,5; 1; 1,5; a 2 [i/[ú). Poté změřit absorbanci na ELISA readeru při 750 nm a pomocí koncentrační řady BSA vypočítat koncentrace proteinů v připravených lyzátech. Na závěr určit vhodné ředění vzorků tak, aby na SDS-PAGE bylo naneseno stejné množství proteinů od každého vzorku.
Příprava gelu:
1. S použitím rukavic vyčistit skla, promýt pod tekoucí vodou, umýt detergentem, propláchnout vodou, opláchnout ethanolem a utřít.
2. Sestavit skla se spacery a sevřít je svorkami.
3. Připravit roztok pro dolní gel, jemně promíchat a nalít mezi připravená skla asi do 2/3. Převrstvit gel slabou vrstvou destilované vody. Nechat polymerovat 30 minut.
4. Slít horní vrstvu destilované vody, připravit roztok pro horní gel, nalít jej na dolní gel, vsunout hřebínek a nechat polymerizovat 45 minut.
Nanášení vzorků a elektroforéza:
1. Skla s gelem umístíme do elektroforetické aparatury, dolijeme elektroforetický pufr a opatrně vytáhneme hřebínky.
2. Na gel nanášíme  10-20 [ú vzorku (množství závisí na koncentraci proteinů v buněčných lyzátech).
3. Připojíme aparaturu ke zdroji. Pro průchod horním gelem aplikujeme 80 V, poté zvýšíme napětí na 120 V.
4. Elektroforézu zastavíme v momentě, když hrana barvičky opouští gel.
Sestavení blotovací aparatury:
1. Nastříháme 4 kusy papíru Whatman 3MM a nitrocelulózovou membránu stejné velikosti jako je proteinový gel.
2. Navlhčíme papíry Whatman a porézní podložky v transferovém pufru.
3. Plastikovou svorku umístíme do vaničky s transferovým pufrem černou plochou dolů. Na ní položíme porézní podložku a vytlačíme bubliny.
4. Na podložku umístíme 2 navlhčené filtrační papíry Whatman 3MM a opět vytlačíme bubliny.
5. Na papíry Whatman položíme gel a na něj opatrně navlhčenou nitrocelulózovou membránu.
6. Na membránu pak opět položíme dva papíry Whatman, vytlačíme bubliny a na ně druhou porézní podložku. Opět vytlačíme bubliny.
7. Takto sestavený sendvič sevřeme do plastikové svorky a umístíme do vaničky s transferovým pufrem a chladítkem.
8. Blotujeme 1 hod při 100 V.
Detekce proteinů na membráně pomocí protilátek:
1. Po skončení blotingu promyjeme nitrocelulózovou membránu v 5% roztoku sušeného mléka v TBS-Tween po dobu 30 minut při pokojové teplotě nebo přes noc při 4 °C.
2. Inkubujeme membránu s primární protilátkou anti-B-Myb ředěnou 1:1000 v 5% roztoku sušeného mléka v TBS-Tween 1 hod při pokojové teplotě nebo přes noc při 4
3. 3x promyjeme v TBS-Tween (cca 7 minut každé promytí).
4. Inkubujeme membránu 1 hod se sekundární protilátkou konjugovanou s křenovou peroxidázou ředěnou 1:10000 v TBS-Tween při pokojové teplotě.
5. Promyj eme dvakrát TB S-Tween a dvakrát TB S.
6. Opláchneme membránu v destilované vodě a osušíme ubrouskem.
7. Připravíme 2 ml ECL substrátu (Pierce™ ECL Western Blotting Substráte) a nakapeme jej na membránu.
8. Po 5 minutách membránu osušíme a signály exponujeme na film v temné komoře.
9. Nakonec membránu obarvíme na proteiny inkubací s roztokem amidoblacku a následně odbarvit odbarvovacím roztokem.
°C.
Použité roztoky
Transferový pufr: 48 mM Tris 39 mM glycin 20%methanol
50 ml 1M Tris-Cl pH=8.0 57,6 ml 5M NaCl doplnit vodou do 2 litrů
TBS:
TBS-Tween:
přidat 1,5 ml Tween 20 do 2 litrů TBS
Odbarvovací roztok: 500 ml metanolu
400 ml destilované vody 100 ml kyseliny octové
Tris-glycin elektr of or etický pufr (ph=8,3): 25 mM Tris 250 mM glycine 0,1% (w/v) SDS
Pufr pro alkalickou fosfatázu: lml 1M Tris-CL, pH=9 200 |Jl 5M NaCl
50 Ml IM MgCk
doplnit destilovanou vodou do 10ml
Barvící roztok: (barvení proteinů na membráně) 0,1% amidoblack v odbarvovacím roztoku
Dolní (dělící) gel - 10% (TOmľ)      Horní (zaostřovací) gel - 4% (7.5mľ)
H2O 4,9 ml H2O 5,62 ml
40% Akrylamid 2,4 ml        40% Akrylamid 0,79 ml
1,5M Tris-Cl (pH=8,8) 2,5 mll,5M Tris-Cl (pH=6,8) 0,94 ml
10% SDS 0,1 ml 10% SDS 75 |Jl
Ammonium persulfate 75 pi Ammonium persulfate 30 pl
TEMED 7,5 pl TEMED 10 pl
2xCSB lyzační pufr
6,9 ml H2O
2 ml glycerol
1,2 ml lMTrispH=6,8
0,4 ml 0,2% Bromfenolová modř v 1M Tris pH=6,8 2 ml   20% SDS
+ před použitím přidat 100 pl beta-merkaptoethanolu k 900 pl 2x CSB
Protilátky:
králičí monoklonální anti-B-Myb protilátka (sc-724, Santa Cruz) anti-králičí IgG konjugovaná s HRP (A4914, Sigma Aldrich)
Po ověření, že po přechodné transfekci plazmidem exprimujícím požadovanou shRNA došlo k utlumení exprese cílového genu, můžeme následně přistoupit k fenotypové charakterizaci buněk pro posouzení významu utlumeného genu na námi studovaný fenotyp. V případě mutageneze pomocí metody CRISPR/Cas9 získáme v ideálním případě výše uvedeným postupem klony buněk, které neexprimují námi studovaný protein. V dalším kroku je zapotřebí přesně popsat mutace, které v tomto klonu vznikly po transfekci B-Myb-lentiCRISPRv2 plazmidu. Nejprve tedy musíme tento klon expandovat a izolovat genomovou DNA. K tomu využijeme GenELUTE Mammalian Genomic DNA Miniprep Kit od firmy Sigma.
Izolace genomové DNA
Postup:
1) 5x 106 buněk MDA-MB-231 promýt v PBS a inkubovat cca 1 min s roztokem trypsin/lmMEDTA.
2) Buňky přenést do 15mL zkumavky a centrifugovat 400g/5 min. Odsát supernatant, suspendovat sediment v 200 ul Resuspension solution.
3) Přidej 20 ul roztoku Rnázy A a inkubuj 2 minuty při pokojové teplotě.
4) Přidej 20 ul roztoku proteinázy K a 200 ul lyzačního roztoku C, vortexuj 15 sekund a inkubuj 10 minut při 70 °C.
5) Přenes 500 ul Column Preparation Solution do GenElute kolonky a centrifuguj 12000g/l min.
6) K lyzátu přidej 200 ul etanolu, vortexuj 10 s.
7) Přenes lyzát na GenElute kolonku. Centrifuguj 6500g/l min.
8) Promyj kolonku 500 ul promývacího roztoku obsahujícím etanol, centrifuguj 6500g/l min.
9) Promyj kolonku 500 ul promývacího roztoku obsahujícím etanol, centrifuguj 12000g/3 _min a přenes kolonku do čisté zkumavky._
10) Přenes 200 ul elučního pufru do centra kolonky, ponech stát 5 min při pokojové teplotě a poté centrifuguj 6500g/l min.
11) Změř koncentraci genomové DNA na Nanodropu.