Cytologie a morfologie bakterií 2 Iva Buriánková MIK, UEB MUNI •Základní (esenciální) - cytoplasmatická, ribozomy, nukleoid • Obvyklé - tvoří se pouze v závislosti na podmínkách (kromě BS - není u mykoplazmat) • – nejsou nutné k přežití buňky, poskytují výhodu Struktury prokaryotické buňky Základní struktury •Cytoplazmatická membrána •Nukleoid •Ribozómy •Buněčná stěna •Organely pohybu •Fimbrie •Plazmidy •Kapsuly, slizy •Inkluze Obvyklé struktury - nejsou nezbytné chrání proti vyschnutí, maskuje antigeny, proti fagocytoze... •v nich odpadní nebo zásobní látky •polyhydroxyburát - vznik za nepříznivých podmínek - nedostatek živin •karboxyzomy - fixace uhlíku •parasporální krystal - obsahuje endotoxiny > působí proti hmyzu...má ho třeba bacillus-musí se dostat do střev, aktivují se endotoxiny --> hmyz zemře Cytoplazmatická membrána •fluidní vrstva fosfolipidů, v ní vnořené bílkoviny – mnoho proti Eucarya •jednoduchý řetězec, esterová vazba Bacteria, Archaea – etherová v. !! •semipermeabilní – transport, respirační funkce (zastupuje mitochondrie), zakotvuje rotor bakteriálních bičíků • •G- mají plazmatickou membránu a vnější membránu oddělené periplazmatickým prostorem •ost. prokaryota pouze vnější CM •někt. mořské sinice plazmatické membrány bez fosfolipidů – náhradní membránový lipid - SQDG •(v oceánech s nedostatkem fosforečných a dusíkatých živin) GG- buňky Lipid A (toxin) Buněčná membrána obsahuje různé biologické molekuly, především lipidy a proteiny Lipidy –složení do urč.míry podle výživy a typu prostředí Hopanoidy – lipidy u 50% bakt., obdoba euk. sterolů Cytoplazmatická membrána obsahuje tři třídy amfipatických lipidů: •fosfolipidy (obs. zbytky kys. fosforečné) a ost. •glykolipidy (p. obsahu cukru) a ost. •p. alkoholu - deriváty glycerolu (především fosfatidáty) a deriváty sfingosinu (sfingolipidy) • Proteiny Proteiny pevně vázané – enzymy (ATPáza, nukleáza, fosfatázy), transportéry, strukturální proteiny • volné proteiny – fosfatázy • inducibilní složky membrány – přítomnost - nutný spouštěcí faktor syntézy= spektrum proteinů proměnlivé Lipoproteiny – lipid do periplazmy Glykoproteiny a glykolipidy – orientovány cukernou složkou vně membrány Lipopolysacharidy G- •vrstva lipidů – 5 nm, cca 50 atomů •bariéra, brání úniku obsahu buňky •semipermeabilní, selekt. permeabilní •živiny dovnitř, odpady ven – selektivní kanály, pumpy –proteiny (import, export spec. látek) •buněčná adheze, výměna iontů a buněčná signalizace – reakce na prostředí •cílová struktura pro extrabuněčné struktury - buněčná stěna, glykokalyx • •cytoplazmatická membrána může být uměle vytvořena - micely •růst, tvar buněk – mění se i membrána přidáním složek •tendence držet tvar, zacelovat trhliny • •prokaryota – jen CM (eukaryota – i vnitrobuněčné membrány), princip stejný •invaginace - membránou obdařeny i některé typy inkluzí • (glykogen, PHB, S, plyn. vakuoly, karboxyzomy) – 1 vrstevná! • • Fosfolipidy •dvojvrstva, nepropustná, samouspořádávání •hlavní silou formující lipidovou dvojvrstvu hydrofobní interakce, dále van der Waalsovy síly, elektrostatické, hydrogenní a nekovalentní interakce •fosfatidycholin - nejvýznamnějšími strukturními fosfatidát, tvoří základ lipidové dvojvrstvy biologických membrán (též lecithin) • •hydrofilní hlavička se orientuje k vodě a je spoj. se zbytkem molekuly přes fosfátovou skupinu •hydrofobní uhlovod. konce jsou nenabité, nepolární, orientace k jiným nepolárním l. •amfipatické l. •lipidové dvojvrstvy jsou v zásadě nepropustné pro polární molekuly, připouští pasivní difúzi hydrofobních molekul •voda se uspořádává kolem nich – spotřeba E Fosfátová skupina vázaná na glycerol 1) 1) 2 mastné kys.vázané na glycerol CM - 2D kapalina – fluidní mozaika •samozacelovací schopnost – trhliny vytv. rozhraní s vodou – nevýhodné, snaha zacelit •lipidy neopouští vrstvu kvůli vod. prostředí kolem, ale mohou měnit místa •teplo - pohyby molekuly – otáčení kolem osy, výměna pozic mezi sousedy – podporuje difuzi •sniž. teplota – nižší E , nižší rychlost výměny pohybu lipidů v membráně • •stupeň fluidity – závisí na T a fosfolipidech – čím těsněji se řetězec může sbalit, tím viskóznější bude •délka a stupeň nenasycenosti řetězců mastných kyselin •nenasycené lipidy vytvářejí ohyby - vzrůst fluidity membrány •mastné řetězce fosfolipidů a glykolipidů – cca 14 – 24 atomů uhlíku •kratší řetězce zvyšují fluiditu - méně interagují navzájem • •bakterie a kvasinky – snaha udržet konst. fluiditu CM •homeovisciózní adaptace - schopnost organismu regulovat fluiditu buněčné membrány změnou složení lipidů •délka a složení řetězce se mění v záv. na T prostředí •vys. T – produkuje delší řetězce a méně dvoj. vazeb • • •Asymetrické složení membrány •obě vrstvy se liší počtem a slož. fosfolipidů, důl. i orientace kanálů •nové fosfolipidy jsou synt. enzymy z mast. kyselin •uvolňují se do té samé monovrstvy, pak dochází přeskupení •flipázy – přenos selektivní – r. koncentrace fosfolipidů v k. monovrstvě • •Flexibita – sch. se ohýbat – spodní hranice 25 nm – min. pro tvorbu váčků • • Proteiny • • membrána obsahuje velké množství proteinů, typicky kolem 50 % membránového objemu •různé biologické aktivity, mezibuněčná komunikace, enzymatické aktivity nebo transport látek přes membránu •velké množství proteinových receptorů a identifikačních proteinů, např. antigeny • • • • • • • • • • • • • •Integrální proteiny nebo transmembránové proteiny •prochází skrz CM •hydrofilní cytosolická doména (interaguje s vnitřními molekulami) •hydrofilní extracelulární doména - interaguje s vnějšími molekulami •hydrofobní doména - ukotvuje uvnitř buněčné membrány •hydrofobní domény se skládají z α-helix a β listů proteinových motivů •hydrofobní vazby cca 70% •daná orientace v membráně •Iontové kanály, protonové pumpy • • • Periferní proteiny •spojené s integrálními membránovými proteiny •dočasné interakce s biologickými membránami a jednou reagující molekula se odloučí a pokračuje ve své práci v cytoplazmě •spojeny s intergralnimi za pomoci H-mustku a elektrostat.sil • Proteiny ukotvené s lipidy •kovalentně vázané na lipidové molekuly hydrofobně vložené do buněčné membrány •proteiny nejsou v kontaktu s membránou •elstat.síly, H-můstky •G proteiny – přenos signálu •Funkce cytoplazmatické membrány • •bariéra, receptory, antigeny •transport – prostá difúze, zprostředkovaná difúze, aktivní transport • •membrána je hydrofilní - malé neutrální molekuly projdou skrz membránu snáze než nabité, velké molekuly •připouští pasivní difúzi hydrofobních molekul •CM v podstatě nepropustné pro větší polární molekuly •brání v difúzi polárním rozpuštěným látkám (AM, NK, cukry, proteiny, ionty) •tj. schopnost kontrolovat pohyb těchto látek skrz transmembránové proteinové komplexy - póry, kanály a brány •propustnost membrány je míra pasivní difuze molekul membránou •závisí hlavně na el. náboji, polaritě molekul a na mol. hm. molekuly •transport přes membránu dělíme na pasivní a aktivní •Transmembránový transport – pasivní • •přenos látek přes buněčnou membránu •samovolně prostřednictvím kanálů a přenašečových proteinů •nespotřebovává energii ATP •řízen gradientem koncentrace a membránovým potenciálem •gradient elektrochemického potenciálu = rozdíl elektrochemických potenciálů na vnější a vnitřní straně membrány •hnací sílou pro pohyb iontů přes membránu •závisí na propustnosti buněčné membrány •prostá difuze, zprostředkovaná difuze, osmóza • • •1) Prostá difúze •transport látek po koncentračním spádu •plyny (N2, O2, CO2), malé polární molekuly bez náboje (etanol, voda) •umožňuje pohyb látek uvnitř buněk a tím látkovou výměnu • • • 2) Zprostředkovaná difúze •přenos látky po elektrochem. gradientu přenašečů v membráně •tyto procesy fungují i při aktivním transportu • kanály - hydrofilní pór, který pro přenos specifických anorganických iontů nepotřebuje změnit svou konformaci •způsob přenosu rychlejší než typ předchozí •protein může být svou konformací otevřen či uzavřen • proteinové přenašeče využívá pro přenos solutu svých konformačních změn - umožňují přenos malých ve vodě rozpustných molekul •kapacita přenašeče je limitována •koncentrace difundované látky nejprve stoupá, rychlost difuze se už rychlost difuze nemění •využíván pro transport látek spojených s metabolismem buňky a dalších látek potřebných pro fungování buněk • např. aminokyseliny, proteiny, ionty větších rozměrů • • •Uniport - transportované molekuly procházejí samostatně •Kotransport – symport a antiport •Symport - prostupují molekuly stejným směrem •Antiport - prostupují směrem opačným Msc channels • mechanosensitivní kanály – reagují na zvýšení turgoru buňky zvětšením velikosti póru • adaptace na osmotický stres - MscL – E. coli • KANÁLY prosté •stále otevřené válcové struktury s centrálním vodním kanálem •neregulovány • př: poriny β vnější membrány - maltoporin umožňující difúzi maltodextrinů, aquaporin Maltoporin v komplexu s maltodextrinem (6 Glu jednotek Dimer GramicidinuA tvoří kanálek Pro transport Iontu K+ KANÁLY hradlové •mají schopnost se otevírat a uzavírat •polypeptid. žetězec tvoří hrdlo, ktere je specificky otevíráno •pomocí vazebných míst rozpoznávají ionty •mají specifitu - hradlo regulováno: napětím, chemicky, mechanicky •specifické iontové kanály slouží pro rychlý průchod iontů jako Na+, K+a Cl- • • Př: K+ pasivně difundují z cytoplasmy do extracelulárního prostoru přes transmembránové proteiny - tetramery řízené el. polem • • •Aktivní transport •aktivní transport vede ke kumulaci látky, transport •i proti koncentračnímu spádu za spotřeby ATP • •ATPáza (adenosin trifosfatáza) •enzym, katalyzuje hydrolýzu ATP na ADP a fosfát •energie vzniklá zmíněnými defosforylacemi se užívá k pohánění jiných chemických reakcí •např transport iontů přes membránu • • Vznik energie v buňce V membráně je komplex proteinů F0, který funguje jako protonový kanál, a ten je propojen s komplexem F1, vyčnívajícím do cytoplazmy. Jsou-li jednotkou F0 vpuštěny protony (po spádu svého ΔμH+), lze jejich energii zachytit a využít ji v komplexu F1 k syntéze ATP. A malá molekula ATP už není vázána na membránu a může v buňce snadno difundovat tam, kde je jí třeba. I)primární akt. transport •zdroj energie nesouvisí s dalším průběhem přenosu •je zapotřebí přítomnost volné energie •pouze jedna částice (např. na Na+/K+ a ATPáza, která současně čerpá sodík z buňky a draslík do buňky) • •ABC transportéry – motivy vážící ATP a štěpící jej při příjmu látky •bakterie stovky typů pro transport •ABC transportéry jsou schopné přenášet přes membránu sacharidy, aminokyseliny, lipidy, ionty, peptidy i proteiny, toxiny a léky včetně antibiotik •Př: E. coli tak přijímá vit. B12 z prostředí, export toxinů • •Primární aktivní transportéry se dají klasifikovat na základě způsobu získávání potřebné energie: •hydrolýzou ATP – vyskytují se ve všech doménách •dekarboxylací – v prokaryontních organismech •přenosem methylové skupiny – vyskytují se u archeí •oxidoreduktázou- zdroj energie je oxidace redukovaného substrátu •světelnou energií- vyskytují se u archeí • Během činnosti ABC transportéru MsbA se periodicky mění jeho prostorové uspořádání Bakteriální ABC transportér pro vitamín B12 •II) sekundární akt. transport • •zdroj energie - spřažení s přenosem jiné látky ve směru koncentračního gradientu •energie uložená v gradientu je využita k přenosu druhé částice proti směru koncentračního spádu (symport, antiport) •proces spojen se změnou koncentrace na membráně •sodno-draselná pumpa •která udržuje koncentrací rozdíl sodíku a draslíku mezi intracelulárním a extracelulárním prostředím tím, že vyčerpává sodík z buňky a naopak vychytává draslík •antiport sodíku a draslíku proti koncentračnímu gradientu – u sodno-draselné pumpy je zdrojem energie ATP 3 Na+ (in) + 2 K+ (out) + ATP + H2O = 3 Na+ (out) + 2 K+ (in ) + ADP + Pi •Skupinová translokace • méně častá •při transportu substrát chemicky modifikován (dostane se do buňky a zůstává v ní) •př: fosfotransferázový systém •fosforylace substrátu; akumulace PEP (fosfofenolpyruvát) přináší do buňky cukry proti koncentračnímu spádu) • • • • • • • • • • • •Vysokoenergetická fosfátová skupina je z fosfoenolpyruvátu přenesena na glukózu za tvorby glukóza-6-fosfátu Buněčná stěna •součást buněčného skeletu •dává buňce tvar •mechanickou ochranu •ochraňuje před zářením, vyschnutím, chemickým poškozením •stěna kompenzuje osmotický přetlak uvnitř buňky • •Peptidoglykan (murein) •peptidová složka - tetrapeptid - alanin, kys muramová, nějaký zbytek • (G+ = lyzin; G- =diaminopimelová kys.) a zase alanin •glykan – cukerná složka, NAG, NAM (N-acetylglukózamin+N-acetylmuramová k.) •Peptidoglykan = uniformní disacharid •N-acetylglukózamin + N-acetylmuramová Tetrapeptid L- a D-AMK Spojení: rozdíl v pozici 3 Interpeptidový můstek u G+ Acidorezistentní mykobakteria, nokardie.. nebarvitelné Gramem: N-glykolylmuramová ! •Peptidoglykan G+ G+ : tetrapeptidy spojeny pentapeptidem G- :tetrapeptidy spojeny přímo D-ala na DAP (diamidinipimelová kys.) G- •vrstvami polysacharidových řetězců, v němž se střídá N-acetylglukosamin a N-acetylmuramová kyselina •spojeny O-glykosidovou vazbou - lze narušit například působením lysozymu •zbytky kyseliny N-acetylmuramové vytváří vzájemné propojení řetězců pomocí krátkých peptidů (tetrapeptidy) - tj. transpeptidace •na proces transpeptidaze působí antibiotika jako peniciliny a cefalosporiny Polymer Spojení tetrapeptidů různé u G+ a G- •Lysozym – štěpí vazbu mezi aminocukry = působí na hotovou stěnu •Penicilin – brání spojení tetrapeptidů = působí při syntéze stěny •Bacitracin - cyklický polypeptid blokující defosforylaci fosfolipidu, potřebného pro transportní funkci během výstavby buněčné stěny Taxonomický význam BS • Barvení buněčné stěny • Chemotaxonomie složek stěny a membrány •Aminkokyselinové složení tetrapeptidu a můstku!! Micrococcaceae •až druhově charakteristická struktura můstku Streptomycety •3 pozice unikátní L-amino DAP kyselina Stěna spory: jiné a unikátní složení peptidoglykanu •jedny z nejmenších prokaryotic.organismu •jsou pleiomorfní (koky, kokotyčky, tyčky) •některá mykoplazmata tvoří pouzdra •některá tvoří výběžky (zejména patogenní druhy) --> adheze na hostitelskou bunku • •jsou rezistentní na ATB které působí na BS •(logicky - nemají BS - neumí syntetizovat peptidoglykan) • • Mykoplazmata •během evoluce se objevily mnohonásobné redukce velikosti genomu •pozměněn i genetický kód •tempo evoluce je vysoké •redukce velikosti genomu - evoluce Mollicutes na striktní parazity •velká část metabolické mašinérie zakrněla • • mykoplazmata -nejmenší známý mikroorganismus schopný samostatného života u člověka izolováno asi 11 druhu •M. pneumoniae • je nejvýznamnějším patogenem lidského respiračního systému (faryngitis, tracheobronchitis, bronchitis, bronchiolitis, pneumoniae, pneumonitis, myringitis) •detekuje se serologicky - pritomnost protilatek • •M. hominis vyvolává např. lidskou primární atypickou pneumonii •urogenitalni trakt u zen-zavazne poporodni a popotratove horecky, poskozeni plodu, zevni genital-loziska •začíná byt rezistentní vůči erytromycinu (ATB)!!!!!!!! • •M. genitalium, M. urealyticum • • •Mycobacterium •acidoresistentní bakterie, •má BS, ale nebarvitelné Gramem!!! •proto unikalo Mycobacterium tuberculosis •barví se specialním acidorezistentním barvením • •hydrofobní buněčná stěna •problém s transportem Fe •siderofory – sloučeniny chelatizují Fe •exocheliny – extracelulární •mykobaktiny – uvnitř buňky • •Pomalý růst – 3-9 týdnů •zpomalení transportu přes hydrofobní povrch •RNA-pol – nižší reakční rychlost (pomalejší syntéza RNA) •nízký poměr RNA/DNA – pomalejší syntéza proteinů • • Siderofory jsou malé, vysoce afinitní sloučeniny chelatující železo, které jsou vylučovány mikroorganismy, jako jsou bakterie a houby, a slouží především k transportu železa přes buněčné membrány, i když je nyní oceňována širší škála funkcí sideroforu. Siderofory patří k nejsilnějším známým rozpustným pojivům Fe³⁺. •Interakce s povrchy – biotickými i abiotickými •Bakterie evolučně úspěšné – kolonizují všechny niky... •jeden z faktorů virulence • •Adheze •poskytuje mikroorganizmům výhodu v přežití •lepší dostupnost a využitelnost substrátu •adsorpce makromolekul a malých hydrofobních molekul na povrch •lepší využitelnost koncentrovaných živin •ochrana před inhibičními účinky antibakteriálních látek • (antibiotika, chlor, těžké kovy) •ochrana před bakteriofágy a parazitickými bakteriemi •nevýhody – př. potlačení pohyblivosti • Adheze bakterií •Vsuvka: Cytologie buňky a virulence • •Patogenita – schopnost organizmu způsobovat onemocnění •Virulence – stupeň patogenity – míra schopnosti organizmu infikovat a způsobovat onemocnění • • Faktory virulence = struktury/složky buňky •faktory adheze •extracelulární enzymy – invazivní faktory (hyaluronidáza, kolagenáza, koaguláza, kinázy, keratináza, mucináza) •faktory zabraňující fagocytóze (kapsuly, produkty metabolizmu) • •endotoxin - uvolněn až po zániku buněčné stěny bakterie • = lipopolysacharid (LPS), vnější membrány gramnegativních bakterií •Lipid A – tvoří lipidovou složku endotoxinu zodpovědnou za toxicitu •exotoxin - toxin uvolňovaný bakteriemi do okolí Exotoxin - botulotoxin Endotoxin = LPS A Adheze bakterií a indukce cytologických změn •k adhezi je potreba kompatibilita mezi bakterii a cílovou molekulou (klíč a zámek) •stáří, prostředí, adheze - toto určuje tvar buňky • •k adhezi potřebuje receptory • •„surface sensing“ ne všechny buňky schopné adheze na všechny povrchy •vhodné receptory a kompatibilita s cílovou molekulou •(Corynebacterium diphtheriae epitel hrdla; Streptococcus salivarius– zub, chlopně...) •hydrofobicita buněčného povrchu Interakce buňky s povrchem indukuje změnu exprese genů •buněčné morfologie •motility a adheze - souvislost mezi cytologickými znaky a proměnlivými formami existence buněk •blízkost bakteríí k povrchu vyvolává změny v ph, osmolalitě a rotaci bičíků Buňka •pilli, povrchové proteiny, kapsuly a sliz •prostředí – náboj, hydrofobicita, topografie povrchu •vystavené různé chemické skupiny reagují s fyzikálně chemickými vlastnostmi buňky •bioenergetika, technologie (fermentory), znečištění, •bioremediace, biofilm, infekce •budoucí výzkum: ovlivněním buněčné adheze modulací •hydrofobicity buněk; vývoj nepřilnavých materiálů •biofilm - zubni povlak (casto oportunní patogeny) Adheze bakterií - význam Bakterie a hostitelský makroorganizmus adheze bakterií biofilm •Zubní povlak •– A. van Leewenhoek (kys. - mléčná, máselná, propionová, octová, mravenčí) • •Střevní sliznice •Infekce •– sliznice nebo uvnitř tkáně; •- endokarditida •- trvalý biofilm na chlopních •(hl. strepto- a stafylokoky; •nebezpečí krvácivých dásní..) •- rány; bércové vředy; spáleniny Biofilm a medicína •Cévky – arteriální, žilní •Močové katetry •Dýchací a dializační přístroje •Umělé chlopně •Kontaktní čočky •Děložní tělísko • •Bakterie jsou unášeny proudem krve a mohou začít infekční proces na odlehlém místě…. • Nemusí být kontakt s vnějškem! - kovové náhrady kloubů •Stafylokoky – fibronektin-binding protein.. •pseudomonády, E. coli, streptokoky, aktinomycety… •Vytrvalá syntéza a uvolňování toxinů… Biofilm skloviny 700 kmenů z 18ti rodů Mezibuněčný kontakt – role adhezinů (lektiny) a receptorů (sacharidy) Kontak s povrchem zubu – pelikula proteinů, lektiny... (Rickert et al. 2003) •Adheze: Střevní mikroflóra •Střevní mikroflora: 10 14 CFU/ml •napomáhá trávení •tvorba vitaminů •braní patogenům k přilnutí • • •bifidobakterie, kvasinky... tenké strevo •clostridie, enterobakterie (E.coli), matanogenní archaea...tlusté střevo • • Proměna s věkem, dietou (polysacharidy; prebiotika..) •imunitou, hygienou a ATB léčbou •kdyz se narodí dítě – je „sterilní“ - až s tím jak precházi na stravu, prořezávají se zuby --> ztráta sterility, do těla mnoho bakterií • • •Poměr populací – „přínosná mikroflora“ vs. anaerobní •mikroflora jako clostridia... •Alterovaná střevní mikroflora – obezita, cukrovka, záněty, •metabolické poruchy •predevším bakterie mléčného kvašení!!! •kompetice s patogeny o prostredi--zlepšení laktozové tolerance, snížení hladiny cholesterolu, posilení vrozene imunity, zmírnění symptomu na alergeny (snizeni alergie) • Střevní mikroflora a probiotika Funkční potraviny: bakterie mléčného kvašení, fermentace zeleniny •metabolizmus, produkce vitamínů, zábrana adheze patogenů, modulace imunity – alergie, bakteriociny • probiotický efekt – kmenově specifický (genetické inženýrství – konstrukce vhodných kmenů...) • živé vektory a nosiče vakcín – protektivních antigenů Mikroorganismy používané jako probiotika Produkce bakteriocinů x patogenům Produkce EPS – biofilm – quorum sensing Produkce biosurfaktantů – antimikrobní aktivita proti PG, snížení adheze PG Produkce antioxidantů – vychytávají volné radikály (superoxidové anionty, hydroxylové radikály) Prebiotika jsou nestravitelné oligosacharidy stimulují růst anebo aktivitu bakterií, které mají pozitivní účinek na lidské zdraví Inulin, oligofruktóza, galaktooligosacharidy a laktulóza Cílovými mikroorganizmy pro prebiotika jsou hlavně bifidobakterie Další funkce probiotik