B C L- e r G u. 7 h -7QJa lansse iovi Z 9 x,: 9 , -W6 Replika mikroskopu Antony van Leeuwenhoeka Z50-275x-17.století Mikroskopické techniky „The role of the infinitely small in nature is infinitely large" Louis Pasteur "Objekt, který má reálně 1 milimetr, by měl při zvětšení tímto mikroskopem 700 metrů," ^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^ Ústav molekulární genetiky AV ČR v současnosti nejdokonalejší biologický prozařovací elektronový mikroskop, prodaný v ČR - Tecnai T20 í B C L-£ F- G U Zdroje: KS - Campbell N.A. a kol. (2006): Biologie, Computer press, Brno - Dušan Matis a kolektív: Mikroskopická technika. Skriptum PřF Univerzity Komenského, 1993 - Jaromír Plášek: Nové metody optické mikroskopie. Skriptum Fyzikálního ústavu Univerzity Karlovy - Hrazdíra.I., Mornstein V. (2001): Lékařská biofyzika a přístrojová technika, Neptun, Brno - Rosypal a kol. (1999): Úvod do molekulární biologie, Brno - http://www.natur.cuni.cz/biologie/servisni-laboratore/laborator-konfokalni-a-fluorescencni-mikroskopie - http://www.microscopy.cz/ - http://www.fzu.cz/popularizace/elektronovym-mikroskopem-do-nitra-materialu-aneb-iak-vypada-iejich-struktura 4 Buňka minimální jednotka strukturní, funkční a reprodukční J.E.Purkyně Vývoj buněčné teorie rozvoj mikroskopie (17. století až současnost) Jan Evangelista Purkyně (1787-1869) mezi prvními na světě přisoudil buňkám jejich stěžejní význam pro život Matthias.J. Schleiden (1804-81) a Theodor Schwann (1810-82) 1839 buněčná teorie: Vývoj živé přírody se opírá o růst a tvoření buněk, buňky rostlin a živočichů se shodují tvarem a funkcí. Buňka je základní, stavební a funkční jednotkou živých organismů. Rudolf Virchow (1821-1902) nové buňky vznikají jen dělením z již existujících" Pasteur (1822-85) fermentace, popřel teorii spontánního tvoření buněk Louis Pasteur rozvoj biochemie 1.pol.20.stol 1953 struktura DNA (Watson, Crick,Franklinová) R. Virchow i á ľ Zvláštnosti prokaryotické buňky I _ _ mm • živý, otevřený systém schopný regulace a autoreprodukce • jádro neodděleno od CPL membránou, větš. kruhová (i lineárni) DNA • haploidní buňky (1 alela) množící se nepohlavne • bez buněčných organel, jediná membrána je cytoplasmatická • ribosomy se liší od ribosomů eukaryotních buněk - menší, volně v CPL vyjma Archea: 5S, 16Sa23S rRNA translace začíná N-formylmethioninem geny pro RNA bez intronů specifické struktury a vlastnosti bakt. buňky: bakteriální ribozom J|^^jm^0ur: 1 1 1 1. C ram ■ pes itive cocc i i n g rapel ike clusters (staphylococci) 2. Gram-positive cocci in chains (streptococc i) 3. Cram-positive cocci with capsules (pneumococci) 4. Cram-positive, cluhshaped, pleomorphic rods (corynebacteria) 5. Cram-negative rods with pointed ends (fusobacteria) 6. Cram-negative curved rods (here com mashaped vibrios) 7. Cram-negative diplococci. adjacent sides flattened (neisseria) B. Cram-negative straight rods with rounded ends [coli bacteria) 9. Spiral rods (spirilla) and Cram-negative curved rods [Helicobacter) ID. Feritrichous flagellation 11. Lophotrichous flagellation \l. Monotrichous flagellation 13. Formation of endo spores (sporulation) in cells of the genera BcciSSus and Clostridium (spore stain) a) Central spore, vegetative cell shows no swelling b) " c; rr- i r □ I: po rci, ve g etative cell shows no swelling c) Terminal spore ("tennis racquet") d) Central spore, vegetative cell shows swelling e) Terminal spore ("drumstick") 14. Free spores [spore stain) 7 Morfologie kolonií A II -ti ELEVATION FORM MARGI (even) Velikost (průměr; mm) Tvar Profil Okraje Povrch Transparence - průhledná, průsvitná, neprůsvitná kolonie Barva - kolonie bezbarvá, pigment: nasedla, bělavá, žlutá ... Další znaky Vůně, zápach -pojasmínu, žluklém másle, ovocný ... Tvorba mycelia Změny media - dvorec zbarvení, hemolýzy, precipitátu Konzistence - zjišťuje se bakteriální kličkou (viskózní, mazlavá, drobivá, zarůstá do agaru) .Punctiform Circular Filamentous Irregular Rhizoid Raised Convex Pulvinate Spindle (lens) Unnbonate "OOOQO Entire Undulate Filamentous Lobate Erose Curled (wavy) (lobes)_(serrated) i Figure 4 Colony mutants derived from SIN96 strain. Strains were grown on 1.5% agar medium for 50 hours at 25°C. The colony in the center is SIN96, with wild type morphotype 'and mutants at the periphery: I) SINett, 2) CAD, 3) CIC, ■ 6) cotton-like colonies. fa.;- .c v ...."üMfo1 Mikroskopie I l/j J: ^1 ľ Lidské oko má rozlišovací schopnost 0,07 mm ■ i 5 I_I Pro mikroskopii lze využít jakékoli vlnění s vlnovou délkou kratší než jsou rozměry objektu. 11 TT Pojmy a schémata mikroskopie ! A 1 optická -=-aobrazení struktur lišících se vzájemně absorbcí viditelného světla ) Yarianty optického mikroskopu eciální optické mikroskopy zobrazení struktur lišících se vzájemně větla B) Elektronová C) Akustická £3^ Historie mikroskopie - Tubulární mikroskop Bratři Janssenové, 1595 J* VC Robert Hook 1665 Již olejová lampa 1itlĽH,lt'[< i if n trek (j. JMládce J"* Men I v m Lckc fířřiuici Hüuk^ i iMac íl of i k i'i (dcync [ rentals dach Icc im kuni hqE nun A NTÜ ^ tcEBU Wfcfciy QlíK$ Nejstarší nákres složeného mikroskopu, Isaac Beeckman, Middelburg, 1625 f cm niun Doert en tiizn'i men na|_ dekkúigc nier Wťiiii]: mu kun-HfOnViTviíiiurte-imťrcikvncĽL. Ac wurciij fteld iLLuiptiLilu Jatík u fup rascu had Kľ.Ji 11: ■- -1 -1 = I i . Lliťl Wkupici), 1 i>i,d"uc:lwJtl wjL-WLiLLinv.cliJíoČJtj i.i-ir Ofdlt ;.in ťfaílitrijiti íoo ik andcrrigt y^rď. 1^" " " Krystaly vinného octa, Antony van Leeuwenhoek T Mikroskop typ 1,1670 Antony van Leeuwenhoek Jednoduché, zaostŕovací šroub, držák. Bez světel. Celkem 419 mikroskopů ¥ 3 1595 - Zacharias a Jan Janssenovi -1. mikroskop John Yarwell Compound Monocular Microscope (circa late 1&00s) 1 Cuffs Microscopef (Círta mid 1700s) Spencer Compound Binocular Microscope (circa 1932) T3 TT John Marshall Compound English Microscope (circa 1720) Brass Galileo-Style Compound Microscope (circa 1801-187B) Early Ross Compound Microscope (circa 1831) Oberhauser's| Drum Microscope (circa 1850) Carl Zeiss 1886 Složený monokulárni mikroskop Van Leeuwenhoekovy „Listy" „Carl Zeiss" binokulární mikroskop (design 2002 E F G H Kterou metodou? 'Pih • Její dostupnost • Záleží na mikroskopované struktuře * * F • Tolerance k artefaktům J_L Př: EM - tři hlavní skupinky preparátu mesozomy, filamenta, nukleoid - dehydratace + barvení - ovlivňují morfologii struktur - kryoelektronová mikroskopie - pozorování hydratovaných zmražených buněk Optická (světelná) mikroskopie, Max. zvětšení 1500 X, max. rozlišení 200 nm Stavba světelného mikroskopu • - mechanické součásti - stativ, noha, tubus, revolverový měnič objektivů, stolek, makro- a mikrošroub • - optika mikroskopu (objektiv a okulár) - kombinace čoček, korekce vad • - osvětlovací zařízení - světlo prochází objektem I - zdroj světla: lampa v noze s kolektorovou čočkou I&W* kondenzor - ze 2-3 spojených čoček -____- soustřeďuje světelné paprsky na objekt Základem mikroskopu jsou dvě soustavy čoček: 1) Objektiv - převrací neskutečný, zvětšený a přímý obraz pozorovaný okulárem (lupou) Výsledkem je neskutečny, zvětšeny a převráceny obraz. - čím kratší ohnisková vzdálenost objektivu, tím větší je zvětšení 2) Okulár - zvětšuje obraz vytvořený objektivem, zvětšení je prázdné. Koriguje zbytek vad. a) jeden - mikroskopy monokulárni b) dva - binokulární (Carl Zeiss 1933), světelný svazek rozdělen hranolem na dva Na základě vlastností světla v prostředí vzniká obraz fy T A Celkové zvětšení Z - kolikrát je obraz sledovaného objektu větší než o -je dáno součinem zvětšení objektivu a okuláru - omezeno rozlišovací mezí í "Empty" Magnification Final magnification using a simple lens system (e.g.: dissecting microscope Same images: Final magnification using a compound light microscope "CT BioEd Online ~7 Rozlišení - jak daleko musí být od sebe 2 body, aby nesplynuly v jeden ■ I ! Rozlišovací mez - teorie výpočtu vychází z interference prošlých paprsků (E.K. Abbe) ___ * . "~>v Numerická r=Á/n.síi\a ^ 1 A.........vlnová délka použitého světla - čím vyšší, tím vyšší rozlišení n.........index lomu prostředí mezi čelem objektivu a sklíčkem a.........úhel mezi optickou osou mikroskopu a kuželem paprsků vstupujích z preparátu do objektivu [ Numerická apertura objektivu (NA) n . sin a = součin úhlu dopadu paprsků od objektu do objektivu a indexu lomu A - čím je vyšší, tím vyšší je rozlišovací schopnost objektivu, ale nižší hloubková ostrost • Pracovní vzdálenost Working distance Slide with specimen Figure 2.5 Numerical Aperture in Microscopy. The angular aperture 9 is Vi the angle of the tone of tight that enters a lens from a specimen, ami the numerical aperture is n sin 9. In the right-hand illustration the lens has larger angular and numerical apertures; its resolution is greater and its working distance smaller. - od povrchu čočky objektivu po krycí sklo Kontrast - rozdíl ve vizualizaci objekt / pozadí Suchý objektiv: Paprsek vystupující z preparátu pod úhlem a se na rozhraní mezi krycím sklíčkem a vzduchem láme od kolmice a nemůže se již podílet na tvorbě obrazu. menší index lomu menší numerická apertura vyšší rozlišovací mez Rozlišovací mez 5 = k I n. sin a n= 1 NA = max 1 R. Hook - po 1.olejová lampa Kapalina zvyšuje účinek světla Imerzní objektiv: Paprsek přecházející ze skla do imerzního prostředí svůj směr nemění a může se podílet na tvorbě obrazu. Imerzní prostředí - kapalina o stejném n jako krycí sklíčko. Často cedrový olej (n = 1,52). Imerze umožňuje korigovat některé opt. vady mikroskopu. větší index lomu vyšší úhel a vyšší numerická apertura nižší rozlišovací mez Pro žlutozelené světlo: A = 550 nm NA =0,95 Rozlišovací mez = 0,6 |j m Ulm Robert O'BnEn NA = 1,2-1,4 Pro žlutozelené světlo: Rozlišovací mez 0,4 |j m iL Optické vady (aberace) objektivů: Otvorová vada (kulová, sférická) Čočky objektivu nejsou tenké: různý lom paprsků od optické osy Bodový předmět zobrazen jako úsečka IT V A XL Barevná vada (chromatická) Je způsobena optickou disperzí (závislost indexu lomu na vlnové délce světla). Bodový předmět zobrazován na různá místa optické osy v závislosti na vlnové délce světla. UV Spektrum tzv. bílého světla + + + H-h IR —V 350 600 650 viditelné světlo Korekce vad nm i i * Kombinacemi vhodných spojných či rozptylných čoček z různých materiálů o různém n. Rozlišení objektivů dle stupně korekce vad: Achromáty - barevná vada korigována pro 2 barvy světla (červené a modrozelené), otvorová pro žluté Semiapochromáty - barevná vada korigována pro 2 barvy blíže oběma koncům viditelného světla Apochromáty - barevná: nejméně pro 3 barvy, otvorová pro 2. Nejdokonalejší objektivy pro bílé světlo Planachromáty a planapochromáty - korigované i zklenutí zorného pole. Význam pro mikrofotografii. Okuláry - typy dle účelu mikroskopie !l I J 1 ľ jj-1 Huygensův Ortoskopické - nezkreslují zorné pole, přesně stejné zvětšení v celém zorném poli. Zejména k měřicím účelům. Kompenzační - kompenzují zbytkové chromatické vady. Periplanatické - odstraňují astigmatickou vadu silněji zvětšujících objektivů. Brillovy - dioptrické Širokoúhlé - průměr zorného pole až 2,5 cm Projektivy - mikrofotografie L fa.;- .c v ...."üMfo1 Mikroskopie I l/j J: ^1 ľ Lidské oko má rozlišovací schopnost 0,07 mm ■ i 5 I_I Pro mikroskopii lze využít jakékoli vlnění s vlnovou délkou kratší než jsou rozměry objektu. 11 TT Pojmy a schémata mikroskopie ! A 1 optická -=-aobrazení struktur lišících se vzájemně absorbcí viditelného světla ) Yarianty optického mikroskopu eciální optické mikroskopy zobrazení struktur lišících se vzájemně větla B) Elektronová C) Akustická Varianty optického mikroskopu £ TP 1 JLI- 11 1) Mikroskopie v temném poli - pro zvýšení kontrastu - preparát silný pro průchod paprsků - pozorování v odražených paprscích - upravený kondenzor osvětluje preparát zespodu (čočka uprostřed zacloněná) - objekt svítí ,b;:vlL.:iĽ|,i-.-..|iL:L. Figuře ZI _ metoda na pozorování velmi malých objektů (prvoci, bakterie) a jejich struktur zaživa J. W, Stevenson C o m p 01 j n d □ issect j ng ■Ste reoTiicros cope by J. Swift & 5on 2) Stereomikroskopie - 2 mikroskopy se samostatnými objektivy a okuláry - jejich optické osy svírají - plynulá změna zvětšení bez zaostření (operační mikroskopy) 3) Mikroskopy pro mikrofotografování, pro pořizování videozáznamu s digitálními kamerami, projekční mikroskopy, mikroskopy s mikromanipulátory já Speciální optické mikroskopy zobrazení struktur lišících se vzájemně absorbcí např.UV, IR světla fázově kontrastní mikroskop 1953 - Nobelova cena za objev - Frits Zernike (1888-1966) interferenční mikroskop - diferenční interferenční kontrast dle Nomarského (DIC) polarizační mikroskop UV mikroskopie fluorescenční mikroskop T Li- I - Složení paprsky tj[] mturFĽucnci Okuläry I KuTncfrivý MiTncifódný papiMik — PVilarmivunĽ [iVCtlc] Světici ,-Vzorek —Polariíitor Analyzaltir— Rádný Osvětlení pm i dopadající světlo ~ -Objektiv ■ OwEný KtnLuk Os-třLiii Stuliv Filtry ry U PÜIT7 Fázový kontrast I. ^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^ Klasický světelný mikroskop: - detaily objektů nejsou rozeznány vzhledem k malému kontrastu mezi strukturami s podobnou propi|QtnnQtí wofiq * Různé části. různý index lomu a ohyb paprsků tt n2 < n3 ni "^3 - objekty s vysokým n velmi ohýbají světlo možnost pozorování živých objektů v nativním stavu bez barvení orosarcina ure Bacillus cereus tzv. „haló" efekt okolo buněk Obr^ 7- Průchod av^tln absorbuj ícim objektem A - avěťelná. vlna dopadajíc! na ob^elrt, B - avStelná vlna --uoJaodu zbai-vťmviíi objekty C - světelná vlna po difrakci v objekt a, C B vzniká interferencí A a O) V husté absorbující části preparátu vidíme ji jako světlou; dojde k částečné absorbci vlnové délky a ke změně amplitudy což zachytíme jako změnu intenzity světlá B=A+C Vlna C je oproti původní vlně A po difrakci posunuta o 180 Obr. 8. Průchod av&tlft transparentním objektem A - svotelnd vlna dopadající na Objekt, B — švfitwlxiŕí vlna po průchodu tranaparer-tním ob.lefc-tera, c - svat elná vlna po dirrak-oi v objektu, vzniká interferencí A a C) Při průchodu světelné vlny transparent, objektem se vlna zpozdí, nemění však intenzitu ani amplitudu, ale posune se její fáze - často o 90 . Mikroskop zvýší změnu ve fázi mezi původní vlnou A a vlnou po difrakci C na 180 - obě se pak po interferenci co nejvíce ruší. Pozn: posun fáze je v závislosti na rozdílu indexu lomu dané struktury a okolí, na délce optické dráhy a na vlnové délce a světla. Fázový kontrast x. Princip: V kondenzoru - kruhová clona (zatemnělý střed) Paprsky projdou vzorkem - na fázových objektech dojde k odchýlení některých paprsků z původního směru (vlivem ohybu, rozptylu, lomu). V objektivu - čtvrtfázová destička, také tvar mezikruží. Na ni dopad paprsků, co nezměnily směr při interakci s fázovými objekty, ty posunuty, ostatní paprsky (se změněným směrem) destičku minou, nejsou posunuty. Rozdíly ve fázi světla převedeny na změny kontrastu i. - 1 Fázový kontrast III. Contrast Three views of Paramecium cat/datum (food vacuoles contain stained yeast cells) bw contrast optimum contrast {felt) BádkiS thuringinensis with endospúfss: ŕfí b rig ht fie Id; p hase oo ntrast (400x) (right) Pse udo p odium of Chaús (pÉÍôrfiyxä) cadfciĚnšte: (C) bright ffekŕ, (D) dark fie Id (tWx) BioEd Online 1 i i juh y Obraz je vytvářen interferncí paprsků fázově posunutých i neposunutých • Pozitivní fázový kontrast: objekty tmavší vůči pozadí (fázově posunuty paprsky se změněným šířením) • Negativní fázový kontrast jsou-li objekty oproti pozadí relativně světlejší (fázově posunuty paprsky nevychýlené ze svého směru) Interferenční mikroskop ■ti- i-1 íi Princip: pracuje se 2 koherentními (interference schopnými) paprsky, prochází objektem 1. 2 vedle objektu Obraz: vzniká interferencí obou oddělených paprsků. Výhoda: možnost přímého měření indexu lomu objektů. la '- - Varianta interferenčního mikroskopu: Mikroskopy s diferenčním interferenčním kontrastem dle Nomarského (DIC) Hlavní součásti: Polarizátor srovnává vlny, jež jsou v různých rovinách Nomarského destička v kondenzoru je hranol, jež zpracovává polarizované světlo tak, že na preparát jdou dva paprsky souběžně vedle sebe. V analyzátoru vidíme 3D obraz v závislosti na různém n různých částí buňky Zvýrazněním i malých rozdílů vznikne plastický obraz povrchu buňky. Bacillus megaterlum Sporosarcina ureae 1 £_a_B-Ei -iL • Princip: svazek polarizovaného světla je po průchodu preparátem štěpen polarizačním filtrem na 2 nepatrně posunuté svazky (nastává dvojlom). Takto se vytvoří i dva nepatrně posunuté obrazy, navzájem „kolmo polarizované". Oblasti obrazů s fázovým posunem (způsobeného fázovými objekty preparátu) se přesně nekryjí a místa překryvu různého fáz.posunu jsou interferencí zviditelněna změnou jasu či barevným obrysem, v závislosti na použití monochromatického / polychromatického světla. 4 Cr i Image plane Interference space Analyzer Main Nomarski prism ® H I U- Auxiliary Nomarski prism Plane-polarized light Polarizer Field diaphragm Unpolarized light ^ Výhoda: citlivé i na I velmi malou změnu optické dráhy paprsků (optická dráha je součinem indexu lomu a geometrické dráhy paprsku v daném prostředí) ..ä. Polarizační mikroskop 7 r ' ť**1 ,B5šs zviditelnění opticky aktivních nebo dvojlom vykazujících struktur Princip: spojení konvenčního mikroskopu a polarimetru. Optickou aktivitou se projevují i některé složky cytoplazmy i proudění cytoplazmy. í UV mikroskopie Princip: optika mikroskopu musí být z křemenného skla (dobře propouští UV). Obraz nepozorujeme okem, je zviditelněn na luminiscenčním stínítku a je fotografován. Kratší vlnová délka UV = vyšší rozlišovací schopnost, té obvykle ale dosaženo není. Optika má korigovány vady pro jedinou vlnovou délku -takovou, co je přítomna ve zdroji UV záření. Výhoda: přímé pozorování struktur propouštějících viditelné, ale pohlcujících UV světlo (bílkoviny, DNA). 3 Fluorescenční mikroskop Mycobacterium phlei min-rodamin i Využívá schopnosti některých látek po ozáření světlem o kratší vlnové délce emitovat viditelné světlo o delší vlnové délce. Využito dlouhovlnné UV a přilehlá oblast viditelného spektra emitovaného halogenovými lampami. UV světlu je přizpůsobena optika kondenzoru, zbytek optického systému totožný s běžným optickým mikroskopem. Přidány filtry (bariérový) chránící lidské oko před zbytkovým UV. Fluorescenci vykazují: Fluorescein DAPI Calcofluor Akridinová oranž někt. složky živé hmoty i bez obarvení (látky^artfmatickým jádrem či heterocyklem - např. amk. tryptofan), v^járhitTp re pařátů však barvíme fluorescenčními barvivy na zákl^Specifické interakce s buněčnými strukturami. Mnohdy je fluorescenční barvivo (fluorochrom, fluorescenční sonda) navázáno na protilátku specifickou pro určitou \ bílkovinu v cytoplazmě, tak lze selektivně zviditelnit složky cytoskeletu eukaryotických buněk, chromatin, membránové bílkoviny apod. ■ . "li ľ Schéma a princip fluorescenčního mikroskopu 7r~n-1-r Schéma fluorescenčního mikroskopu Olympus 1 _ vysokonapäťový zdroj ■ 2 - schránka s výbojkou 3 - iluminátor (osvětlovač) 4 - objektiv 5 - otočná kazeta na kostky s 6 - okulár 7 - univerzální kondenzor Schéma principu fluorescenční mikroskopie 1. Rtuťová výbojka 2. Excitačni filtr 3. Zrcátko JO / /i^yif^^C 4. Objektiv 5. Preparát 6. Bariérový filtr - tUfjl**.' d — _-y-- ■ t- ~~"^\ žlutá" n n eUOlCJ Pfi£PA«Ár ear1ébový fí1tä S flUOSOCKflOWOVANÝM fllí* objektem Princip fluorescenčního mikroskopu Otočná kostka s filtry a zrcátkem. Zrcátko rozdělí excitační a emitované světlo Příklad s filtry: Složené světlo po průchodu excitačním filtrem redukováno na světlo modré, ost. pohlceno. Modré světlo dopadá na buňky s fluoresc. barvivem, to vysílá paprsky o delší vlně (žluté). Modré je pohlceno bariér.filtrem. V temném poli svítí žluté buňky. :: Doposud zmiňované optické mikroskopy (optický + j varianty a speciální mikroskopy) vytvářejí obraz okamžitě, jako spojitý celek. A ) T^~-- Optické mikroskopy vytvářející obraz postupně, z jednotlivých bodů (pixelů) = nesou informaci z úzkého světel.paprsku: 1 .laserový řádkovací (rastrovací, skenovací) konfokální mikroskop ^ ■Rušivé světlo z vrstev nad a pod rovinou ostrosti odstraněno z dráhy k detektoru zábranou s malým otvorem - výsledek: perfektně ostrý obraz. Paprsek se po objektu posouvá a obraz jednotlivých bodů se skládá v PC. Posunem paprsku do jiné hloubky lze vytvořit optické řezy a skládat je do 3D obrazu. ■Význam: možnost pozorování i relativně silných preparátů, včetně nativních. ■Konfokální mikroskop lze upravit i pro konfokální fluorescenční mikroskopii V-43 Využití pro pozorování a) silných preparátů b) 3D modelů Patent 1957 Zdroj světlaje laser, světlo prochází přes bodovou = konfokální clonu Využití při studiu architektury buňky (cytoskeletu), rozložení receptorů v membráně, topologie nukleoidu... i - *t T T A - barevny řád kovací mikroskop „s letící stopou" místo mechanického řádkovacího systému používá jasnou bílou světelnou stopu, která přebíhá po řádcích na obrazovce osciloskopu. Výhody: výborné rozlišení, vysoký kontrast (úpravou jasu zdrojové světelné stopy v závislosti na absorbanci preparátu) optická skenovací mikroskopie v blízkém poli NFOS velmi úzký světelný paprsek prochází po řádcích velmi tenkým preparátem a jsou měřeny změny jeho intenzity. Výhody: rozlišení 10 -100x vyšší než u klasického světelného mikroskopu. Výhodou oproti elektronové mikroskopii (viz dále) je, že vzorek nemusí být umístěn ve vakuu ale lze jej pozorovat např. ve vodném prostředí. Německý vědec nositel Nobelovy ceny (1986) objev elektronového mikroskopu (1931) Elektronová mikroskopie (EM) '1 ^ ! \ ,-1 S HU I h ,11 Zobrazení předmětů pomocí urychlených elektronových svazků - elektrony mají vlnovou délku de Broglieových hmotnost.vln Urychlením lze dosáhnout stotisíckrát kratších vlnových délek Rozlišovací schopnost pak (a= A /n*sina): velmi malá A Vlivem velkých optických vad použitých čoček (magnetické) poměrně malá numerická apertura - řádově setiny. Rozlišovací mez: desetiny nm Dělení EM dle způsobu zobrazování transmisní 7 emisní I odrazové (v praxi málo í používané) i řádkovací (skenovací či rastrovací) Elektronový mikroskop E "K V 1 mi s* iiaiuiitiatťriálv jjč** světelný mikroskop 1 transmisní elektronový mikroskop nitlkoxucí elektionow mikroskop III I I........ I........ I........ Il....... Il l ti 1111 lOUuni lOiim I leh H ii in in lOntn lnm OJ nm 1-j |jľir[i;triii elektronový svazek charakterferickÉ RTC záŕení kďtlod i.rl u i] i ij i Ísľľ iht-L- zpttuŕ ndraíeiiŕ elektrony šekmi tlumí elektrony Augerovy elektrony v z a r c k nepružne- rozptýlené pruzuf rozptýlení pr(rôlč elektrony prosit elcktrnuy 03 33 Transmisní elektronový mikroskop (TEM) ju i i n i i Wh Pomocí TEM lze studovat vznik, vlastnosti a vzájemné působení jednotlivých poruch krystalové struktury vzorků. i Transmisní elektronový mikroskop (TEM) V biologické praxi: Z 5 000-100 000 = rozlišení: desetiny nm (větší molekuly) Struktura objektu: průchodem el.svazku Elektronový paprsek: ze žhaveného kovového vlákna Proti rozptylu elektronů: v tubusu vysoké vakuum Čočky vytvářeny obvykle rotačně symetrickým elmag. polem Konečný obraz pozorujeme nepřímo, projekcí na luminiscenční stínítko F EM elektronové dělo Čočka kondenzoru preparát čočka objektivu Čočka projektivu stínítko Nevýhody: speciální postupy pro fixaci a barvení; vakuum;vysoký tlakjako „barviva": soli a oxidy těžkých kovů, nutno rozlišit artefakty vzniklé zpracováním preparátu. Procházející elektrony se zachycují a obraz se zvětší a fotografuje. Metoda umožňuje pozorovat detaily buňky a virových částic. Ke kontrastnímu znázornění zvýraznění struktur se používá negativní barvení solemi těžkých kovů, které nepropuštějí elektrony například uranyl acetát, molybdenan amonný. íl 7í T Li- V í TU JjJ Rastrovací elektronová mikroskopie (skenovací, řádkovací, Scanning Electron Microscope - SEM) t ti ..i Popularita SEM pramení z Umožnosti získat obrázky __povrchů širokého spektra materiálů, které jsou navíc jednoduše interpretovatelné. tí 1 B C L-£ F- G U Rastrovací elektronová mikroskopie (skenovací, řádkovací, Scanning Electron Microscope - SEM) -;-f— 777 — n u* u v. *« velmi úzký paprsek elektronu je vychylovacím systémem nucen přejíždět po povrchu preparátu po řádcích Rozlišovací schopnost SEM o 1-2 řády menší než TEM, ale možnost pozorování objektů s komplikovanou 3D strukturou (signál totiž nese informaci o sklonu povrchu v místě dopadu svazku elektronů) výsledkem je obraz s vysokou hloubkou ostrosti E F Xl;J. Nevýhody: pokovování povrchu preparátu, složitá fixace. Problém rozlišení artefaktů vzniklých zpracováním preparátu í. . < Rastrovací elektronová mikroskopie znázorňuje povrch objektu (bakterie, viru, leukocytu), tence potaženého paprskem iontů kovu, například platiny. Protože se pokovuje pod ostrým úhlem, v místech, kde se kovové ionty nedostanou vznikají stíny. Výsledkem je plastický trojrozměrný obraz. íi tí I L i Skenovací tunelová elektronová mikroskopie (scanning tuneling electron microscopy, STM) _ n f Mil I Nad povrchem preparátu se pohybuje velmi tenký kovový hrot, ke kterému „tunelují" elektrony z povrchu preparátu (tunelový efekt - jev kvantové 3 mechaniky, kdy částice pronikají oblastí, na překonání níž by dle zákonů klasické mechaniky neměli dostatek energie) Zobrazuje se elektronová hustota na povrchu preparátu s rozlišením na úrovni rozměrů atomů. Výhody: Vzorky nemusí být ve vakuu, ale např. i ve vodném prostředí. Vynalezen v laboratořích IBM v Zurichu G. Binnigem a H. Rohrerem r.1980 í ťtriDKOUACf TUNELOUv MIKROSKOP jehla s extémně ostrým hrotem (pohybovat v řádcích -nanometry) 2) Na hrot je ze zdroje 3) přiloženo elektrické napětí vzhledem ke vzorku, jež může díky tunelovému efektu odsávat elektrony 4) Výška hrotu nad vzorkem nastavována piezoelektrickým systémem i 5) Proud snímaný jehlou měřen citlivým měřidlem 5) a je využit k tomu, aby se pomocí regulátoru 6) udržovala výška hrotu nad povrchem vzorku konstantní, jak je vyznačeno na obrázku čárkovanou křivkou 7) Hrot tak s extrémní přesnosti mapuje výškový profil vzorku. Další zpracování je pak záležitostí počítače 8). Systém je schopen rozeznat jednotlivé atomy na povrchu vzorku. IE*. Skenovací tunelová elektronová mikroskopie (scanning tuneling electron microscopy, STM) 100[jm 4\ v r» U V71Í . rň^WĚ já Akustická mikroskopie U F M - Mikroskopie ultrazvukových si 777 77^ -u. akustický mikroskop - zařízení, které vysílá na vzorek řádkovacím způsobem ultrazvukový signál, odezvu převádí na elektrický signál a na monitoru prezentuje rekonstruovaný videoobraz IT7TC —__ Hyperzvuk proniká v kapalinách i pevném prostředí do hloubky jednotek až desítek mikrometrů. Pozorování preparátů neprostupných pro elektrony a viditelné světlo. Informace o mechanických vlastnostech prostředí. ^^^^^^^ -i Barvení buněk TU A r • Grámovo barvení - barvení bakterií jako identifikační metoda • Hans Christian Joachim Gram (1884) 1 )Bazické barvivo — 2)voda — 3)Lugolův fixační roztok — 4)voda -5)aceton, ethanol — 6)voda — 7)safranin (dobarvení) lv« „v. Iv. Iv. (a^Applicg-tion of (tJjApplitation ni (d AÍwhůl wash (d)Applkation of crystal violet iodin* iafranin Gramnegativní typ buněčné stěny: peptidoglykan 10%, 2nm, porózní výplň mezi cytoplazmatickou membránou a vnější membránou. Barvivo se v porózní vrstvě nenaváže, od mývá se. GUAM-NEGATIVE iL (aŕApplizgiíon of (b) Application M (O.AICflhůl wash (d)Application of crystal violet iodine iafranin > Cell wall Cell membrane is ŕ GRAM-POSITIVE Flagellurn Cell Cell wall membrane Grampozitivní typ buněčné stěny: peptidoglykan 40nm, 90%, hydrofobní struktura. Mezi polymerem je voda. Do hydratované vrstvy se dostává barvivo krystalové violeti, Lugolův roztok fixuje přímo na strukturách. Organické rozpouštědlo poté dehydratuje vrstvu. Barvivo zůstává pevně vázáno, nedobarví se dál safraninem. Table 2-1 Comparison of Various Types of Microscopes Type of Microscope Maximum Useful Magnification Resolution Description Brightfield Darkfield Ultraviolet Fluorescence Phase contrast Nomarski differential interference ConFocal Transmission electron (TEVf) Scanning electron (SEM) 1,500X 1,500X 2,500X 1,500X 1.500X 1.500X 1.500X 500.000-1;000,OOOX 10,000-1 f0OO,O0OX 100-200 nm 100-200 nm 100 nm 100-200 nm 100-200 run 10Ü-200 nm 100-200 nm 1-2 nm 1-10 nm Extensively used for the visualization of microorganisms; usually necessary to stain specimens for viewing Used for viewing live microorganisms, particularly those with characteristic morphology: staining not required; specimen appears bright on a dark background Improved resolution over normal light microscope; largoly replaced by electron microscopes Uses fluorescent staining; useful in many diagnostic procedures for identifying microorganisms Used to examine structures of living microorganisms; does not require staining specimens Used to examine structures of microorganisms; produces sharp, multicolored image with throe-dimensional appearance Used to examine structures of microorganisms and individual microorganisms within mixtures of various types of microorganisms; uses fluorescence staining; produces blur-iree image; used to produce txuee-dimensional images Used to view ultrastructure of microorganisms, including viruses; much greater resolving power and useful magnification than can be achieved with light microscopy Used for showing detailed surface structures of microorganisms; produces a three-dimensional image ■ ĺ i Obrazová dokumentace a zpracování obrazu fr o i ■í • Zařízení Komprese a formáty obrazu Pojmy Programy - analýza obrazu (LUCIA, NIS) I Zajímavé adresy a odkazy JU T Z. 1^* ť- - _■ ■ v http ://www. gate2biotech.cz/nei dokonalej si- elektronovy-mikroskop-ve-sluzbach-ustavu- molekularni-genetiky-av-cr/ http://micro.magnet.fsu.edu/cells/bacteriacell.html http://www.micro-scope.de/toc.html http://w3.uniromal.it/MEDICFISIO/microscopv.ht m http://www.euronet.n1/users/warnar/leeuwenhoek.h tmi ň;. ;q P Z_ L_ Děkuji za pozornost hl li Zdroje: r i w Campbell N.A. a kol. (2006): Biologie, Computer press. Brno Dušan Matis a kolektív: Mikroskopická technika. Skriptum PřF Univerzity Komenského, 1993 Jaromír Plášek: Nové metody optické mikroskopie. Skriptum Fyzikálního ústavu Univerzity Karlovy Hrazdira.L, Mornstein V. (2001): Lékařská biofyzika a přístrojová technika, Neptun, Brno Rosypal a kol. (1999): Uvod do molekulární biologie, Brno