Sklíčkové kultury a fluorescence
5. – 6. cvičení
Cytologie a morfologie bakterií
Fidrich (2020)

Sklíčkové kultury I.
1.Podložní sklíčko umístit na sklenené kuličky/skleněné tyčinky v sterilní Petriho misce
2.Tenký bloček agaru umístit na podložní sklíčko (sterilním skalpelem)
3.Zočkovat kulturu po okraji agarového bločku
4.Přidat asi 5 ml sterilní destilované vody, těsně pod podložní sklíčko
5.Bloček agaru přikryjeme krycím sklíčkem
6.Zavřít Petriho misku a nechat kultivovat

Petriho misku samozřejmě při kultivaci neotáčíme dnem vzhůru.

Sklíčkové kultury II.
1.Zapíchnout sterilní krycí sklíčko do agaru (cca 45° úhel)
2.Zaočkovat kulturu na agar podél okraje krycího sklíčka
3.Zavřít Petriho misku a kultivovat

Jak je znázorněné na obrázku, je možné zaočkovat více kultur na 1 Petriho misku.

Co pozorovat?
o
o1x sklíčková kultura na podložném sklíčku na kuličkách
o1x sklíčková kultura na misce s krycími sklíčkami
o
osklíčko s narostlou kulturou položit nárustem na podložní sklo
o
opozorovat při zvětšení 400x (obj 40)
o100 objektiv s imerzí v jasném poli nebo Nomarského kontrastem
o
o
5 denní kultury:
Rhodococcus erythropolis (M8 or MPA)  Nocardia carnea (M8)
Streptomyces griseus (M15)

M8, M15, MPA – typy médií, dle kterých dané kultury očkujeme na správné půdy.

Co pozorovat?

Na fotografiích je možné vidět substrátové a vzdušné mycelium sledovaných mikroorganismů.

Fluorescence - DAPI
1.Nalít sterilní destilovanou vodu do zkumavky (cca 5 ml)
2.Do zkumavky napipetovat 2-4 kultury (přibližně 25 µl 24-hodinové kultury z každé)
3.Profiltrovat kulturu s vodou pomocí bakteriálního filtru
4.Filtr nechat volně uschnout (je možné nastříhat na menší části)
5.PRACOVAT BEZ SVĚTLA (V ŠERU)
6.Na filtr nanést asi 20 µl DAPI
7.Vložit do lednice na 10 min
8.Filtr promýt postupně: destilovaná voda -> etanol -> dest. voda
9.Filtr nechat volně uschnout (přikrýt)
10.Na podložní sklíčko nanést kapku imerzního oleje -> umístit filtrační papír -> kapka imerzního
oleje -> krycí sklíčko -> imerzní olej -> pozorování pomocí fluorescenčního mikroskopu

Místo laboratorních kultur je možné využít například přírodní vzorek vody a podobně (nutné větší
množství vzhledem k očekávanému nižšímu zastoupení mikroorganismů v porovnání s kultivovanou
kulturou).
Filtr je možné nastříhat na ¼ případně až na 1/8.
Při práci s DAPI používáme ochranní rukavice.
Po nanesení DAPI, se snažíme uchovávat filtrační papír v tmě (alespoň přikrýt).
Pro pozorování preparátu je nutné použít správná UV filtr, dle návodu při mikroskopu.

Co pozorovat?

Příklady pozorování kultur obarvených DAPI. Je možné vidět velké oválné buňky Saccharomyces
cerevisiae, relativně velké tyčinky Bacillus subtilis, zároveň krátké malé tyčinky Escherichia
coli, a malé kokovité buňky Micrococcus luteus.