C7075: Bioanalytická chemie v laboratorní medicíně Vitamíny, hormony a jejich stanovení stanovení Vitamíny 53 Role vitamínů v organismu üslouží zejména jako kofaktory enzymů (B1 - thiamin, B2 – riboflavin, B3 – niacin apod.) üuplatnění v oxidačně - redukčních systémech (NAD – NADH+) üjsou významnými antioxidanty (vitamín C, vitamín E) = nízkomolekulární organické látky, které tělo v přiměřené míře potřebuje pro život üaž na výjimky neumí vytvořit a musí být dodávány potravou výjimky: vitamín A – tvorba v organismu z β-karotenu vitamín D – biotransformace z cholesterolu vitamín K – produkce střevními bakteriemi üjsou nezbytné pro fungování základních fyziologických procesů üobvykle jsou vyžadována stopová množství denně (µg - mg/den) Hypervitaminóza = předávkování vitamíny, méně častý jev, snižuje efektivitu vstřebávání a využití, běžnější u vitamínů, rozpustných v tucích Hypovitaminóza = nedostatečný příjem, v důsledku vede ke zdravotním potížím - při poruchách resorpce a při zvýšených nárocích organismu na vitamín 2 Vitamíny - dělení 1. Vitamíny rozpustné ve vodě üvitamíny řady B – B1 (thiamin), B2 (riboflavin), B3 (niacin, kyselina nikotinová), B5 (kyselina pantotenová) B6 (pyridoxin), B7 (biotin), B9 (kyselina listová) B12 (kobalamin) üvitamín C (kyselina askorbová) = velmi obtížné, jedná se o zástupce různých chemických skupin, které nelze klasifikovat na základě strukturní podobnosti 2. Vitamíny rozpustné v tucích üvitamíny řady A – A1 (retinol), A2 (3-dehydroretinol) üvitamíny řady D – D2 (ergokalciferol), D3 (cholekalciferol) üvitamín E (tokoferoly) üvitamíny řady K – K1 (fylochinony), K2 (melachinony) ergokalciferol biotin pyridoxin retinol tokoferol 3 Způsoby stanovení vitamínů Přímé měření koncentrace vitamínů üv krvi – vit E, vit A, β – karoten, vit B12, kyselina listová ü v moči – vit B1, niacin Měření koncentrace specifického metabolitu ühromadění metabolitu v séru nebo moči následkem poruchy např. enzymových reakcí, např. zvýšení hladiny kys. methylmalonové při nedostatku vit B12 Měření koncentrace specifického metabolitu po zátěži substrátem ünapř. sledování hladiny homocysteinu odhalí nedostatky vit B6, vit B12 a kyseliny listové, podání methioninu umocní nárůst hladiny homocysteinu, která klesne podáním chybějícího vitamínu Obsah obrázku interiér, uspořádáno Popis byl vytvořen automaticky 4 Způsoby stanovení vitamínů Stanovení produktu tvořeného působením vitamínu üjde o nepřímou metodu, např. změny koncentrace koagulačních faktorů při nedostatku vit K Zvýšení aktivity vybraného enzymu podáním koenzymu üsledování aktivity ALT a AST po přidání pyridoxalfosfátu (stanovuje se vit B6 – pyridoxin) Saturační testy üstanovení např. vitamínu C, při nedostatku dochází k jeho vychytávání a koncentrace v moči je minimální až nulová, po saturaci dochází k vylučování stejného množství, jaké bylo podáno Obsah obrázku interiér, uspořádáno Popis byl vytvořen automaticky 5 Vybrané příklady stanovení Vitamín A = retinol – má několik konformací , lze chápat jen 2 aktivní formy üv krevním oběhu vázán převážně na RBP (retinol vázající protein) a prealbumin ümá nezaměnitelný význam při reprodukci, podílí se na správné funkci zraku üje fotocitlivý, což stěžuje jeho stanovení üpři nedostatku nastává šeroslepost, při nadbytku dochází k akumulaci v játrech, což vede k jejich poškození üStanovuje se pro zjištění poruchy trávení a vstřebávání tuků ü Stanovení Carr-Price test = extrakce pomocí chloroformu, acetanhydridu (odstraňuje vlhkost), kdy vznikne nažloutlý roztok, který přidáním chloridu antimonitého SbCl3 v přítomnosti vit A zmodrá - měří se spektrofotometricky při 550 nm - jednotlivé formy vitamínu A se stanovují pomocí HPLC retinol 6 Vybrané příklady stanovení Vitamín D = cholekalciferol (D3) a ergokalciferol (D2) üaktivní formou je 1,25-dihydroxycholekalciferol ücholekalciferol je částečně syntetizován v těle ze 7-dehydrocholesterolu ühraje zásadní roli v metabolismu vápníku a fosforu – stimuluje tvorbu vazebného proteinu ünedostatek vede k poruše mineralizace kostí - osteoporóza, křivice ünadbytek bez většího významu üje mu přikládán význam také v souvislosti s aktivitou imunitního systému Kapitola 09 - 08-09 ergokalciferol 7 Vybrané příklady stanovení Vitamín D Stanovení ünejčastěji RIA metody ükombinace HPLC a fotometrie, MS üchemiluminiscenční imunochemické techniky ükoncentrace v krvi je závislá na ročním období a době vystavení organismu slunečního světla üv poslední době narůstá v klinické diagnostice význam stanovení 1,25-dihydroxycholekalciferolu ü Kapitola 09 - 08-09 ergokalciferol 8 Vybrané příklady stanovení Vitamín C = kyselina askorbová, oxidovaná forma dehydroaskorbová üsoučástí kofaktorů, podílí se na vstřebávání železa, má silnou antioxidační aktivitu ünedostatek způsobuje náchylnost k infekcím, kurděje, přebytek je vylučován močí üstanovuje se převážně v séru, méně v moči Stanovení - nejčastěji HPLC nebo fluorescenční stanovení - využití redukčních vlastností vitamínu C (spektrofotometrie, titrace – jodometrie) Stanovení Tillmanovým činidlem = kyselina askorbová redukuje v kyselém prostředí růžový roztok 2,4-dichlorfenolindofenolu do vzniku bezbarvé leukobáze 9 Hormony = látky chemické povahy, které působí na specifické receptory cílových buněk a orgánů üstimulují a regulují látkovou výměnu (pochody, vedoucí k tvorbě a využití energie) üpodílí se na rozmnožování a růstu, ovlivňují vývoj organismů üslouží k adaptaci organismu a k regulaci vnitřního prostředí (homeostázy) üřídí reakce organismu v souvislosti s vnějšími podněty a biorytmy üjsou tvořeny výlučně organismem a nelze je tělu dodávat (např. potravou) Produkce hormonů ünejčastěji jsou pomocí žláz s vnitřní sekrecí vylučovány přímo do krevního oběhu ütvoří se také v buňkách různých tkání a orgánů (játra, ledviny, CNS) = tkáňové hormony Účinky hormonů Øendokrinní – účinek na vzdálenou tkáň, přenos krevním řečištěm – Øparakrinní– účinek v blízkém okolí buňky – např. růstové hormony Ø autokrinní – účinek přímo v buňce, která hormon vytvořila Øexokrinní – v různých vzdálenostech od místa vzniku, např. buňky podél střeva 10 Hormony üvětšina hormonů se tvoří ve žlázách s vnitřní sekrecí üprodukce hormonů je úzce spjata s celou CNS, jejíž působení je nadřazeno stimulaci endokrinních žláz üzásadní propojení celého systému spočívá v podmíněné činnosti jedné žlázy účinky hormonů, vytvořených žlázou jinou, např. tvorba kortikoliberinu (v hypothalamu) spustí tvorbu adrenokortikotropinu (v adenohypofýze), který následně v kůře nadledvinek stimuluje produkci kortikosteroidů, zejména kortizolu hormon_final 11 Hormony - dělení = hormony jsou velmi rozdílné látky a lze je dělit podle několika kritérií üliší se fyzikálně-chemickými vlastnosti, mechanismem a rychlostí působení, transportem … 1. Hormony odvozené od aminokyselin hormony štítné žlázy, adrenalin, melatonin 2. Hormony odvozené od mastných kyselin prostaglandiny 3. Hormony steroidní povahy testosteron, progesteron, hormony kůry nadledvin 4. Hormony peptidové a bílkovinné povahy většina ostatních hormonů 5. Ostatní látky růstové hormony apod. 12 Hormony a jejich hladiny Hladinu hormonů v krevní plazmě ovlivňují: übiorytmy (cirkadiánní) üonemocnění, např. zánět, trauma, nádor ünedostatek transportních bílkovin, např. albuminu üjaterní nedostatečnost či porucha vylučování ledvinami üpřítomnost jiných látek – hormonální agonisté a antagonisté üporucha receptorů – snížený až žádný účinek üskladování odebraného vzorku, např. u hormonů štítné žlázy üšpatná konverze jednotlivých forem, např. tyroxin – trijódtyronin üpřítomnost protilátek, např. snížení účinku inzulínu 13 Způsoby stanovení hormonů Nepřímé měření koncentrace hormonů v krvi üúčinky hormonů se posuzují na základě přítomných metabolitů Stanovení hormonů a jejich metabolitů v moči üběžnější, avšak ne všechny hormony se močí vylučují Přímé stanovení v krvi ünejčastější využití v souvislosti s velmi nízkými koncentracemi üvyužívají se komerčně dostupné diagnostické soupravy Využití imunoanalytických metod RIA – radioimunoanalýza, kdy izotopem značíme analyt jako antigen IRMA – imunoradiometrická analýza, kdy je radioaktivně značená protilátka EIA – enzymová imunoanalýza IEMA – imunoenzymometrická analýza nejčastěji ELISA – enzyme-linked immunosorbent assay Funkční testy ünapř. orální glukózový toleranční test OGTT– diagnostika diabetu 14 Obsah obrázku ovoce, klipart Popis byl vytvořen automaticky Vybrané příklady stanovení Somatotropin = růstový hormon (STH, GH) üjedná se o peptidový hormon, stimulující růst kostí a proteosyntézu üjde o druhově specifický hormon, tj. nelze užít zvířecí hormon k terapii lidí üovlivňuje také hladinu cukru v krvi a působí jako antagonista inzulínu üsnížená produkce STH způsobuje nanismus (zakrnění), zvýšená gigantismus (akromegalii) Klinické vyšetření STH üprovádí se při netypických fyziologických změnách podáváním inzulínu, kdy se stimuluje vylučování STH sníženou koncentrací glukózy v krvi ümetody stanovení jsou na bázi imunochemie Extreme Körpergrößen: He Pingping galt bis zu seinem Tod im März 2010 mit 74,6 Zentmetern als kleinster Mann der Welt, Sultan Kösen mt 2,46 Metern als größter üdopingové kontroly - STH patří na seznam dopingových látek v oboru bodybuildingu a kulturistiky, kdy jeho podávání vede ke změně váhového poměru tuku ve prospěch svalů üjedna injekce stojí cca 25,- USD http://medicina.ronnie.cz/img/data/clanky/normal/6543_1.jpg 15 Vybrané příklady stanovení Kortizol = hormon kůry nadledvin, tzv. glukokortikoid üsteroidní hormon, který se neukládá, ale je vždy čerstvě syntetizován a vyslán do oběhu üpodílí se na regulaci glukózy a ukládání glykogenu v játrech üjeho sekrece je řízena hypofyzálním adrenokortikotropinem (ACTH) üzvýšená i snížená produkce vede k nádorům hypofýzy a hyperglykémii (Cushingův syndrom) Klinické vyšetření STH üzvýšená produkce se sleduje v séru, ve slinách nebo v moči üfunkční testy slouží ke zjištění místa poškození Dexamethazonová suprese = založena na podání dexamethazonu jako syntetického glukokortikoidu, který potlačí tvorbu ACTH a sníží tvorbu kortizolu – ukazuje na poškození hypofýzy ACTH stimulace = měření hladiny kortizolu před a po podání injekce ACTH hladina stoupá, je-li funkce nadledvin v pořádku a klesá, jsou-li poškozeny 16 Vybrané příklady stanovení Hormony štítné žlázy = tyroxin (T4), trijódtyronin (T3 - nejúčinnější) a reverzní trijódtyronin (rT3 - neúčinný) üprekurzorem syntézy je tyrosin jako AMK ütvorba tyreoidálních hormonů je spjata s tyreotropinem, pocházejícím z hypothalamu üporuchy funkce štítné žlázy ovlivňují mitochondriální metabolismy, oxidační fosforylaci, metabolismy cukrů, tuků i bílkovin ühyperfunkce štítné žlázy – Gravesova - Basedowova choroba ühypofunkce štítné žlázy – mentální retardace (kretenismus) Klinické vyšetření T3 a T4 üzákladním testem je stanovení tyreotropinu (TSH), což je glykoprotein, který zajišťuje transport jodidů do štítné žlázy, teprve poté se stanovují T3 a T4 jednotlivě ünejčastěji RIA nebo ELISA metodou üřada komerčních testů pro různé analyzátory tyroxin_schema3 17 Vybrané příklady stanovení Pohlavní hormony = steroidní hormony, produkované pohlavními žlázami a/nebo nadledvinami üprodukce je řízena spouštěcími hormony hypothalamu a hypofýzy (gonadoliberin, folikulotropin) ANDROGENY – testosteron, dihydrotestosteron ESTROGENY – estron, estriol, estradiol (účinek v poměru 5 : 1 : 10) GESTAGENY - progesteron Testosteron ütvoří se v Leydigových buňkách varlat mužů, reguluje spermiogenezi üpodílí se na vývoji primírních a sekundárních pohlavních znaků üprodukce je regulována gonadoliberinem, vlastní účinnou formou je 5α – dihydrotestosteron üvylučován je do plazmy, kde je specificky vázán na transportní protein (SHBG, albumin) üodbourává se v játrech a je vylučován ve vazbě na kyselinu glukuronovou üstanovuje se metodami RIA či vazebnými testy 18 Vybrané příklady stanovení Pohlavní hormony Progesteron = hormon žlutého tělíska üpřetváří děložní sliznici a v případě těhotenství inhibuje tvorbu gonadoliberinu (zastaví zrání folikulů) üodbourávání probíhá v játrech, metabolickým produktem je pregnandiol üstanovení – RIA, TLC, ELISA, EIA üsledování hladiny progesteronu – při kontrole menstruačního cyklu a v průběhu těhotenství Estradiol = nejúčinnější z estrogenů üpodílí se na sekundárních znacích ženy, působí na děložní sliznici a řídí menses Lutropin üproduktem adenohypofýzy, společně s folikulotropinem řídí menstruační cyklus ženy 19 Tkáňové hormony = tvoří se mimo žlázy s vnitřní sekrecí, jejich analytické stanovení není zatím zavedeno Angiotensin - stimuluje tvorbu aldosteronu a vazokonstrikci Renin – tvoří se v ledvinách, zajišťuje přívod krve do glomerulů Sekretin – tvoří se ve sliznici tenkého střeva a reguluje hladinu HCl v žaludku Gastrin – stimuluje sekreci žaludečních šťáv Bradykinin – reguluje vazodilataci a tím krevní tlak … prostaglandiny, endorfiny, dopamin… U rostlin se jedná o fytohormony üregulují stárnutí a opadávání listů, podporují růst rostlinných buněk, např. auxiny, cytokiny U živočichů se jedná o feromony üpřenášejí informace mezi jedinci jednoho druhu, lákají k páření, upozorňují na potravu např. terpeny, alkoholy, estery 20 Literatura a zdroje informací Obsah obrázku klipart Popis byl vytvořen automaticky ØChromý, Vratislav a kol.: Bioanalytika – Analytické metody v klinické chemii a laboratorní medicíně, Ústav chemie PřF MU, Brno, 2011. ØRacek a kol.: Klinická biochemie, Galén / UK v Praze, nakladatelství Karolinum 1999 ØDastych, M. a Breinek, P.: Klinická biochemie – bakalářský obor Zdravotní laborant skripta LF MU, Brno 2015 https://www.labtestsonline.cz 21