RETENČNÍ MECHANISMY Pokročilá kapalinová
chromatografie
Jiří Urban, Ústav chemie, Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita, Brno, urban@chemi.muni.cz
JSOU STEJNÉ?
JSOU STEJNÉ?
+
CHROMATOGRAFIE
JSOU STEJNÉ?
KOLONOVÁ CHROMATOGRAFIE
CHROMATOGRAFIE
Michail Semjonovič Cvět
▪ separace chlorofylových barviv na CaCO3
▪ 1901 – 1903 – 1905 – 1906
(pokus – odesláno – publikováno – název)
Chromato-grafie
▪ z řeckého chroma (barva) a graphein (psát)
▪ цвет = barva
Elektroforéza
(Nobelova Cena 1948)
Rozdělovací chromatografie (Nobelova Cena 1952)
A. Tisselius
A.J.P. Martin R. Synge
www.wikipedia.org
CHROMATOGRAFIE
Michail Semjonovič Cvět
▪ separace chlorofylových barviv na CaCO3
▪ 1901 – 1903 – 1905 – 1906
(pokus – odesláno – publikováno – název)
Chromato-grafie
▪ z řeckého chroma (barva) a graphein (psát)
▪ цвет = barva
Elektroforéza
(Nobelova Cena 1948)
Rozdělovací chromatografie (Nobelova Cena 1952)
A. Tisselius
A.J.P. Martin R. Synge
S03E10
Martin Prince
www.wikipedia.org
KAPALINOVÁ CHROMATOGRAFIE
www.prozyme.com
KAPALINOVÁ CHROMATOGRAFIE
Mobilní fáze
Stacionární fáze
Analyty
12
3
www.prozyme.com
Neustálé ustalování
rovnovážného rozdělení
složek vzorku mezi
fázemi.
KOLONOVÁ CHROMATOGRAFIE
V dnešní době hlavně čištění, preparace.
Adsorbent (silikagel, alumina) či
ionex
Kolony (50 – 250 mm) sypané za
sucha (předem nastavená aktivita
adsorbentu)
Vzorek nalit na vrch sloupce,
postupná eluce rozpouštědly
(odmísení!)
Odběr a analýza frakcí
VYSOKOÚČINNÁ CHROMATOGRAFIE (HPLC)
High Performance Liquid Chromatography
Automatická metoda od zavedení vzorků po vyhodnocení dat
Krátké kolony (30 - 250 mm)
Sorbent s malými částicemi (mm)
Separace ovlivněna náplní
kolony i mobilní fází.
Rychlá (<15-20 min),
Vysoká účinnost (>40 000 n/m)
Vysoký tlak (5-40 MPa)
Kontinuální detekce
www.waters.com
INSTRUMENTACE
1 – zásobník mobilní fáze
2 – odplyňovač mobilní fáze
3 – vysokotlaké čerpadlo
4 – dávkovač
5 – separační kolona
6 – termostat kolony
7 – detektor
8 – datová stanice
1
2
3
4
5
6
78
www.thermofischer.com
VYSOKOTLAKÁ ČERPADLA
Velkoobjemová stříkačka Pístové čerpadlo
30 – 50 MPa, odolnost vůči korozi, stabilní a reprodukovatelný průtok < 0,5 – 1%
Aplikace Průměr kolony Průtok
Konvenční LC 4,6 mm 0,5 – 1,0 ml/min
Mikrokolonová LC 1 mm – 500 µm 40 µl/min – 20 µl/min
Kapilární LC 500 µm – 100 µm 20 µl/min – 300 nl/min
Nano LC 100 µm – 75 µm – 50 µm 300 nl/min – 180 nl/min – 80 nl/min
DÁVKOVÁNÍ VZORKŮ
Nutno překonat protitlak mobilní fáze
Automatické dávkovače (úprava
vzorku, deprivatizace,…)
Nezapomenout, že objem vzorku
ovlivňuje kvalitu separace!
Vnější smyčka
Vnitřní smyčka
www.vici.com
Velmi malé objemy (nl)
KOLONA
Aplikace Průměr kolony Průtok
Konvenční LC 4,6 mm 0,5 – 1,0 ml/min
Mikrokolonová LC 1 mm – 500 µm 40 µl/min – 20 µl/min
Kapilární LC 500 µm – 100 µm 20 µl/min – 300 nl/min
Nano LC 100 µm – 75 µm – 50 µm 300 nl/min – 180 nl/min – 80 nl/min
Délka konvenční kolony: 100 – 250 mm
„high speed“ kolony < 50 mm
Průměr 3 – 4 mm (analytické), 1 – 2 mm
(mikrokolony), < 1 mm (kapilární),
> 4 mm (preparativní)
Částice
LC > 20 mm (plněné za sucha)
HPLC > 10 > 5 > 3 > 1.5 mm (suspenzní
technika), kulové, pórovité, povrchově
pórovité, neporézní, nejčastěji silikagel
www.analytical-sales.com
Optimalizace mimokolonových objemů
Výběr instrumentace na základě kolony
POŽADAVKY NA HPLC KOLONY
▪ Retence, selektivita a účinnost separace různých šarží
daného typu kolon – reprodukovatelné a dlouhodobě
stabilní v co nejširším rozsahu polarit
a pH mobilních fází a pracovních teplot.
▪ Vysoká účinnost a symetrie píků i pro separaci
polárních, kyselých, bazických či vysokomolekulárních
látek (peptidy, proteiny, syntetické polymery).
www.emdmillipore.com
www.hamiltoncompany.com
▪ Mechanická stabilita kolon při pracovních
tlacích do 30 – 40 MPa, co nejvyšší
permeabilita (malý tlakový odpor) a počet
teoretických pater
i při vysokých průtocích mobilních fází –
rychlé separace.
▪ Kompatibilita s technikou HPLC-MS.
DETEKČNÍ TECHNIKY
Selektivní – odezva pouze na koncentraci analyzované látky
Univerzální – odezva úměrná celkové vlastnosti eluátu
▪ citlivý
▪ malý šum
▪ okamžitá odezva
▪ lineární v širokém koncentračním
rozsahu
▪ minimální příspěvek k rozšiřování píků
▪ málo citlivý ke změnám tlaku, teploty a průtoku
▪ možnost práce s gradientem – kompromis
Ideální detektor
Nejpoužívanější
▪ hmotnostní (HPLC/MS)
▪ spektrofotometrický UV – VIS
▪ fluorimetrický
▪ elektrochemický
▪ vodivostní
▪ rozptyl světla
ROZDĚLENÍ SEPARAČNÍCH METOD
▪ Adsorpce
▪ Rozdělování
▪ Chemická reakce
▪Výměna iontů
▪Srážení
▪ Sítový efekt
100 1 000 100 00010 000
chromatografie stérické výluky
tenkovrstevná chromatografie
vysokoúčinná kapalinová chromatografie
plynová chromatografie
molární hmotnost
Vliv velikosti látek Mechanismy
ROZDĚLENÍ SEPARAČNÍCH METOD
▪ Adsorpce
▪ Rozdělování
▪ Chemická reakce
▪Výměna iontů
▪Srážení
▪ Sítový efekt
100 1 000 100 00010 000
tenkovrstevná chromatografie
vysokoúčinná kapalinová chromatografie
plynová chromatografie
molární hmotnost
Vliv velikosti látek Mechanismy
Vše lze rozdělit!
chromatografie stérické výluky
ROZPOUŠTĚDLA / MOBILNÍ FÁZE
I Alifatické ethery, trialkylaminy
II Alifatické alkoholy
III Pyridiny, tetrahydrofuran, amidy
(bez formamidu)
IV Glykoly, glykolethery,
benzylalkohol, formamid, HAc
V Dichlormethan, dichlorethan,
trikresylfosfát
VIa Alkylhalogenidy, ketony, estery,
nitrily, sulfoxidy, sulfony, anilin,
dioxan
VIb Nitrosloučeniny, fenyalkylethery,
aromatické uhlovodíky
VII Aromatické halogensloučeniny,
difenyether
VIII Fluoralkanoly, m-kresol,
chloroform, voda
Introduction to Modern Liquid Chromatography, Snyder, Kirkland, Dolan, 3rd edition.
Mísitelnost!
SEŘAĎTE PODLE POLARITY
Uracil
Thiomočovina
Fenol
Toluen
Ethylbenzen
Propylbenzen
Butylbenzen
SEŘAĎTE PODLE POLARITY
Uracil
Thiomočovina
Fenol
Toluen
Ethylbenzen
Propylbenzen
Butylbenzen
NEPOLÁRNÍ POLÁRNÍ
POLARITA
www.wikipedia.org
„Polární molekuly jsou molekuly, které
mají stálý a nenulový dipólový moment,
protože elektrický náboj je v nich
rozložen nesymetricky.“
voda
hexan
Rozdíl elektronegativit
MECHANISMY RETENCE
▪ Chromatografie
stérické výluky
▪ Imunoafinitní
chromatografie
▪ Chromatografie
za kritických
podmínek
▪ Normální fáze
▪ Obrácené fáze
▪ Hydrofilní
interakce
▪ Iontová výměna
▪ Iontová
chromatografie
NORMÁLNÍ FÁZE (NP)
Mechanismus
Aplikace
Mobilní fáze
Nepolární
hexan, heptan
s přídavkem
izopropanolu,
chloroformu
nebo octanu ethylnatého
www.agc.com
Stacionární fáze
Polární
Silikagel, Al2O3, polární gely
www.silicycle.com
Uhlovodíky < halogen sloučeniny < ethery < nitrily < nitro sloučeniny < ketony
< aldehydy < alkoholy < kyseliny
▪ Izomery
▪ Vysoce hydrofobní látky
▪ Hydrofilní látky (ANP, cukry)
▪ Nepoužívá se gradient
Pořadí eluce
k – retenční faktor
j – koncentrace polárního
rozpouštědla
a, m – konstanty
Nepolární > Polární
log 𝑘 = 𝑎 − 𝑚 ∙ log 𝜑
APLIKACE – NORMÁLNÍ FÁZE
Amino kolona, Acetonitril/voda (75:25)
1 – fruktóza, 2 – glukóza, 3 – sukróza, 4 –maltóza).
www.chromatographyshop.com
YMC-Pack Polyamine II 250 x 4.6mmI.D.,
n-hexan/octan etylnatý (70/30)
Izomery Vitamínu ECukry
www.ymcamerica.com
REVERZNÍ FÁZE (RP)
log 𝑘 = 𝑎 − 𝑚 ∙ 𝜑
k – retenční faktor
j – koncentrace organického
rozpouštědla
a, m – konstanty
80 – 90 % všech aplikací
MechanismusMobilní fáze
Polární
Acetonitril
Metanol
Tetrahydrofuran
Voda
Stacionární fáze
Nepolární
Chemicky vázané fáze
-C4, -C8, -C18
silikagel, uhlík, polymery
www.biocomma.com
www.materialharvest.com
▪ Biologické vědy
▪ Životní prostředí
▪ Průmysl
▪ Gradient mobilní fáze
Aplikace
Pořadí eluce Polární > Nepolární
SELEKTIVITA SEPARACE
Stacionární fáze
C18
C8
C4
Nitril
Fenyl
Amin
C8 C4
Fenyl
Retence
Polarita
Alkylbenzeny, 35% acetonitril
APLIKACE – BARBITURÁTY
www.sigmaaldrich.com Discovery C18, 15 cm × 4.6 mm, 5 μm, 40% metanol, 1 ml/min, 30°C
HYDROFILNÍ INTERAKCE (HILIC)
MechanismusMobilní fáze
Polární
Acetonitril
Metanol
Vody/Pufr
(nízké koncentrace)
Stacionární fáze
Polární
Silikagel
Polární funkční skupiny
www.merckmillipore.com
Andrew J. Alpert
Interakce ve vodné vrstvě
Rozhodující role v mechanismu separace
Snadná volba podmínek pro daný separační
problém.
DUÁLNÍ RETENČNÍ MECHANISMUS
fenol
thiomočovina
HILIC RP
Retence ovlivněná
složením mobilní fáze
log 𝑘 = 𝑎 + 𝑚 𝑅𝑃 ∙ 𝜑 𝐻2𝑂 − 𝑚 𝐻𝐼𝐿𝐼𝐶 ∙ 𝜑 𝐻2𝑂
J. Sep. Sci. 2013, 36, 2806.
𝜑 𝑚𝑖𝑛 =
𝑚 𝐻𝐼𝐿𝐼𝐶
2.301 ∙ 𝑚 𝑅𝑃
Minimum „U-křivky“
Charakterizace HILIC kolon
~20 – 30 %
Popis retence
Retence
VLIV SLOŽENÍ MOBILNÍ FÁZE
95% ACN
90% ACN
Fenolické kyseliny, monolitická kapilární kolona, mobilní fáze octan amonný v acetonitrilu,
J. Sep. Sci. 2013, 36, 2806–2812
HILIC VS. RP
HILIC a RP separace, 4-karboxybenzaldehydu (1),
4-hydroxymethylbenzoové kys. (2), kys. tereftalové
(3) a minoritních nečistot B1, B2, X.
Kolona ZIC-HILIC 4.6 x 50 mm; 5 µm gradient:
100 – 90% acetonitrilu ve vodě / 60 min
Kolona Aqua C18; 3.0 x 150 mm;
5 µm (Phenomenex)
gradient: 0-80% acetonitrilu ve vodě / 70 min.
APLIKACE – „BATH SALTS“
Ascentis Express HILIC (Si), 10 cm x 2.1 mm, 2.7 µm, mobile phase: (A) 5 mM ammonium formate acetonitrile;
(B) 5 mM ammonium formate water; (98:2, A:B); flow rate: 0.6 mL/min
APLIKACE – „BATH SALTS“
Ascentis Express HILIC (Si), 10 cm x 2.1 mm, 2.7 µm, mobile phase: (A) 5 mM ammonium formate acetonitrile;
(B) 5 mM ammonium formate water; (98:2, A:B); flow rate: 0.6 mL/min
SHRNUTÍ NP X RP X HILIC
NP RP HILIC
Stacionární fáze Polární Nepolární Polární
Mobilní fáze Nepolární Polární Polární
Vzorky Méně polární Ne/Polární Polární
Retenci a selektivitu ovlivňuje
polarita vzorku a mobilní a stacionární fáze.
IONTOVĚ-VÝMĚNNÁ CHROMATOGRAFIE (IEX)
▪ Katexy s anionickými
sulfonovými nebo karboxylovými
iontově-výměnnými skupinami
▪ Anexy s kvarterními nebo
terciárními aminovými skupinami
Stacionární fáze
Roztoky elektrolytů (pufry, soli, slabé kyseliny či báze),
Protiionty C soutěží s ionty vzorku S:
kationty: EX-C+ + S+  EX-S+ + C+ anionty: EX+C- + S-  EX+S- + CMobilní
fáze
Q - iontově-výměnná kapacita,
m = s/c je poměr nábojů vyměňovaných iontů
( )
 
m
c
s
c
s
c
S
M
S
M
S
k
c
QK
V
V
S
S
V
V
k −
=== j0
1
www.shimadzu.com
Organické polymerní sorbenty, silikagel s chemicky vázanými iontově-výměnnými skupinami.
IONTOVÁ CHROMATOGRAFIE (IC)
www.thermofisher.com
Odstranění iontů mobilní fázeInstrumentace
(silný katex pro anionty)
Pitná voda, zubní pasty (F-), zelenina (NO3
-), biologické tekutiny (Na+, K+),
speciační analýza (Cr3+, Cr6+)
Stacionární fáze
Mobilní fáze
Detekce
Silný měnič iontů
NaOH, Na2CO3
▪ Vodivostní (supresor)
▪ Nepřímá detekce
▪ Eluce ftaláty, salicyláty
Moderní forma iontově-výměnné chromatografie
APLIKACE (IC)
LC&GC North America 31 (2013) S4b.
Iontové páry se zásadami – silné kyseliny (k. chloristá, alkansulfonové kyseliny)
Iontové páry s kyselinami – kvarterní amoniové soli (tetrabutylamoniumfosfát)
CHROMATOGRAFIE IONTOVÝCH PÁRŮ
Tvorba iontových párů mezi chromatografovanými disociovanými
kyselinami nebo zásadami a opačně nabitými ionty ve vodné fázi.
Neutralizovaný náboj, hydrofobní látky > systém obrácených fází
Protiionty
Analýza kyselých a bazických látek v barvářských meziproduktech, farmaceutických
výrobcích a produktech látkové výměny.
Aplikace
SEPARACE VYUŽÍVAJÍCÍ TVORBU KOMPLEXŮ
Argentační chromatografie
V tenkovrstevné chromatografii (TLC) je silikagel pokryt AgNO3, což umožňuje
separaci cis- a trans- izomerů derivátů mastných kyselin.
Ag-HPLC separace
TAGs v rýžovém oleji.
J. Chromatogr. A 1086 (2005) 91–98
Silikagelová kolona (Nucleosil)
promyta roztokem 1 M AgNO3
Ag nanočástice
CHROMATOGRAFIE STÉRICKÉ VÝLUKY (SEC)
Celková porozita
Průtočné póry
Malé póry
CHROMATOGRAFIE STÉRICKÉ VÝLUKY (SEC)
Polymery
www.hzg.de
Mobilní fáze
THF, H2O
Stacionární fáze
Gely, polymery
𝑙𝑜𝑔𝑀 = 𝐴 − 𝐵 ∙ 𝑉𝑒
www.shimadzu.com
Kalibrace
𝜂 = 𝐾𝑀 𝑎
Mark-Houwinkova
rovnice
(kalibrace pro jiný polymer)
Vodná SEC
Standardy dextranů
Biopolymery
polystyreny
KRITICKÁ CHROMATOGRAFIE (LCCC)
SoftMatter 12 (2016) 5245.
Anal Bioanal. Chem. 393 (2009) 1797.
„Rovnováha“ mezi SEC (DS) a RP (DH)
▪ Velikost molekuly nehraje roli
▪ Dělení na základě funkčních skupin
▪ Blokové a graftované polymery, jejich směsi,
oligomery
▪ Nevýhody: rozmývání píků, citlivé na teplotu
a složení mobilní fáze (desetiny procent)
CHROMATOGRAFIE CHIRÁLNÍCH LÁTEK
www.phenomenex.com
www.sigmaaldrich.com
Cyklodextrin
Vancomycin
IMUNOAFINITNÍ CHROMATOGRAFIE (IMAC)
Čištění a izolace
imobilizované
protilátky
YYY
1)
směs
antigenů
YYY
2)
YYY
selektivní
záchyt
3)
YYYpromytí
4)
YYY
5)
izolace
Vysoce specifické reakce
▪ Protilátka – Antigen
▪ Enzym – Substrát
▪ Receptor - Ligand
▪ Gely
▪ Magnetické částice
▪ Polymerní monolity
IMPRINTOVANÉ POLYMERY (MIP)
www.biotage.com
Úprava vzorku
Specifická extrakce
Zvýšení retence
JIŘÍ URBAN
Kancelář: bud. A14/334 Telefon: 549 49 8579
Kamenice 753/5 E-mail: urban@chemi.muni.cz
625 00 Brno
„The important thing
is to never stop questioning“
Albert Einstein
www.tomrichmond.com