CHARAKTERIZACE KOLON Pokročilá kapalinová chromatografie Ústav chemie, Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita, Brno, urban@chemi.muni.cz CHROMATOGRAFICKÁ KOLONA Délka, průměr, velikost částic 150 x 4.6 mm, 5 mmwww.prozyme.com www.chromnet.net Konvenční LC Mikrokolonová LC Kapilární LC Nano LC 4.6 mm 1 mm – 500 µm 500 µm – 100 µm 100 µm – 50 µm Velikost částicPorozita www.chromatographyshop.com Tvar částic POROZITA Mezičásticové prostory Póry uvnitř částic POROZITA KOLONY 𝜀 𝑇 = 𝑉 𝑀 𝑉𝐶 𝜀0 = 𝑉0 𝑉𝐶 𝜀𝑖 = 𝑉 𝑀 − 𝑉0 𝑉𝐶 = 𝑉𝑖 𝑉𝐶 Mrtvý objem, VM Mezičásticový objem, V0 Objem pórů v částicích, Vi Celková porozita, eT Mezičásticová porozita, e0 Částicová porozita, ei Geometrický objem, VC POROZITA KOLONY 𝜀 𝑇 = 𝑉 𝑀 𝑉𝐶 𝜀0 = 𝑉0 𝑉𝐶 𝜀𝑖 = 𝑉 𝑀 − 𝑉0 𝑉𝐶 = 𝑉𝑖 𝑉𝐶 Mrtvý objem, VM Mezičásticový objem, V0 Objem pórů v částicích, Vi Celková porozita, eT Mezičásticová porozita, e0 Částicová porozita, ei Geometrický objem, VC INVERZNÍ CHROMATOGRAFIE STÉRICKÉ VÝLUKY Hydrodynamický průměr R, nm = 0.0246 · M0.588 pro polystyreny v THF Separace na základě velikosti molekuly Přístupný objem pórů DV, % = (V2 – V1)/VM · 100 Velikost pórů, DR Objempórů,% Hydrodynamický průměr R, nm = 0.0246 · M0.588 pro polystyreny v THF Distribuce velikostí pórů Time, min VM – eluční objem malé molekuly INVERZNÍ CHROMATOGRAFIE STÉRICKÉ VÝLUKY VLIV MODIFIKACE NA DISTRIBUCI PÓRŮ J. Sep. Sci. 2014, 37, 3082. Formování malých pórů J. Sep. Sci. 2017, 40, 10.1002/jssc.201700048. VLIV MODIFIKACE NA DISTRIBUCI PÓRŮ Longitudinální gradient porozity „strmost“ PERMEABILITA KOLONY 𝐾𝐹 = 𝐹𝑚 ∙ 𝜂 ∙ 𝐿 ∆𝑝 ∙ 𝜋 ∙ 𝑟2 Fm – průtok mobilní fáze kolonou, m3/s h – viskozita mobilní fáze Pa·s L – délka kolony, m Dp – tlakový spád, Pa p – 3.14159 26535 r – poloměr kolony, m e0 – mezičásticová porozita dp – průměr částic náplně, m „Průtočnost“ kolony 𝑑 𝑝 = 1 − 𝜀0 180 ∙ 𝐾 𝐹 𝜀0 3 Kozeny-Carman rovnice Nezávisí na teplotě, rozměrech kolony, tlakovém spádu a na složení mobilní fáze Vztah mezi permeabilitou a velikostí částic 𝑑 𝑝 = 1000 ∙ 𝐾 𝐹 (𝜀0 ≈ 0.4) VISKOZITA MOBILNÍ FÁZE Introduction to Modern Liquid Chromatography (L.R. Snyder, J.J. Kirkland, J.W. Dolan, Willey, 2010, 3rd ed.). Acetonitril Metanol 1 cP = 0.001 Pa.s SI jednotky Pa·s Alternativně Poise (P) h[éta] www.jakcvicit.com www.kilogramy.cz CHROMATOGRAFICKÁ SEPARACE CHROMATOGRAFICKÝ ZÁZNAM www.chromatographyonline.com 𝑓𝑛 𝑥 = 1 𝜎 2𝜋 𝑒 − (𝑥−𝜇)2 2𝜎2 Gaussova funkce s – směrodatná odchylka m – střední hodnota náhodné veličiny (tR) Chvostování (tailing) 𝑇𝐹 = 𝐴𝐵 2𝐴𝐶5% Faktor asymetrie 𝐴𝑆 = 𝐵𝐶 𝐶𝐴10% www.wikipedie.org www.lcresources.com RETENČNÍ FAKTOR tM – mrtvý čas tR,A – retenční čas látky A tR,B – retenční čas látky B 𝑘 = 𝐾 𝐷 𝑉𝑆 𝑉 𝑀 Retenční faktor 𝑘 = 𝑉𝑅 − 𝑉 𝑀 𝑉 𝑀 = 𝑡 𝑅 − 𝑡 𝑀 𝑡 𝑀 VS – objem stacionární fáze VM – objem mobilní fáze Kolikrát je eluční objem/čas větší, než mrtvý objem/čas kolony Fm – průtok mobilní fáze 𝑉𝑅 = 𝑡 𝑅 ∙ 𝐹 𝑚 Eluční čas a objem UKÁZKA RYCHLÉ A ÚČINNÉ SEPARACE www.hplc.eu ÚČINNOST SEPARACE (IZOKRATICKÁ ELUCE) 𝑁 = 𝑡 𝑅 2 𝜎𝑡 2 Počet teoretických pater, N 𝑁 = 5.545 ∙ 𝑡 𝑅 𝑤0.5 2 𝑁 = 16 ∙ 𝑡 𝑅 𝑤4𝜎 2 𝑁𝑐𝑜𝑟 = 𝑡 𝑅 − 𝑡 𝑠𝑦𝑠𝑡 2 𝜎𝑡 2 − 𝜎𝑡,𝑠𝑦𝑠𝑡 2 Pozor na vliv mimokolonových objemů J. Sep. Sci. 2003, 26, 1005. Lze (také) extrapolovat z retenčních charakteristik homologické řady (alkylbenzeny) VAN DEEMTEROVA ROVNICE 𝐻 = 𝐿 𝑁 Výškový ekvivalent teoretického patra (H, HETP) Lineární rychlost toku mobilní fáze (u) 𝑢 = 𝐿 𝑡 𝑚 0 1 2 3 4 5 20 40 60 80 100 Výškapatra,mm Lineární rychlost, mm/s VAN DEEMTEROVA ROVNICE 𝐻 = 𝐿 𝑁 Výškový ekvivalent teoretického patra (H, HETP) Lineární rychlost toku mobilní fáze (u) 𝑢 = 𝐿 𝑡 𝑚 0 1 2 3 4 5 20 40 60 80 100 Výškapatra,mm Lineární rychlost, mm/s Optimální účinnost VAN DEEMTEROVA ROVNICE www.thermofisher.com 𝐻 = 𝐴 + 𝐵 𝑢 + 𝐶𝑠 + 𝐶 𝑚 ∙ 𝑢 C – odpor proti převodu hmoty A – turbulentní difúze B – molekulová difúze kvalita a rovnoměrnost náplně Difúzní koeficienty látek (malé vs. velké molekuly) Difúze ve stacionární fázi, tvar a velikosti náplně, „hloubka“ difúze 𝐻 = 𝐻𝐴 + 𝐻 𝐵 + 𝐻 𝐶𝑠 + 𝐻 𝐶𝑚 ℎ = 𝐻 𝑑 𝑝 𝜈 = 𝑢 ∙ 𝑑 𝑝 𝐷 𝑚 Redukované veličiny 𝐷 𝑚 = 7.4 ∙ 10−8 𝑇 𝜙𝑠𝑣 ∙ 𝑀𝑠𝑣 𝜂 𝑠𝑣 ∙ 𝑉𝐴 0.6 Difúzní koeficient Wilke-Changova rovnice f – asociační faktor: voda 2.6, metanol 1.9, etanol 1.5, ACN 1.37, ostatní 1 VLIV EXPERIMENTÁLNÍCH PODMÍNEK www.pubs.rsc.org J. Chromatogr. A 1217 (2010) 8212. Pracovní teplota www.chromacademy.com Plněné kolony Polymerní monolity Velikost částic Dávkované množství Retence J. Chromatogr. A 1217 (2010) 7514.J. Chromatogr. A 1217 (2010) 5389. KINETICKÁ ANALÝZA KINETICKÁ ANALÝZA 250 mm, 5 mm 150 mm, 3.5 mm 50 mm, 1.8 mm KINETICKÁ ANALÝZA 250 mm, 5 mm 150 mm, 3.5 mm 50 mm, 1.8 mm 𝑁 = ∆𝑝 𝜂 ∙ 𝐾𝐹 𝑢 ∙ 𝐻 𝑡 𝑀 = ∆𝑝 𝜂 ∙ 𝐾𝐹 𝑢2 𝐿 = 𝑁 ∙ 𝐻 KINETICKÁ ANALÝZA (KINETIC PLOT) Analytica Chimica Acta 894 (2015) 20-34. 1.8 mm 3.5 mm 5 mm 10 000 100 000 1 000 000 KINETICKÁ ANALÝZA (KINETIC PLOT) Analytica Chimica Acta 894 (2015) 20-34. 1.8 mm 3.5 mm 5 mm 10 000 100 000 1 000 000 účinnost časanalýzy KINETICKÁ ANALÝZA (KINETIC PLOT) Analytica Chimica Acta 894 (2015) 20-34. 1.8 mm 3.5 mm 5 mm 10 000 100 000 1 000 000 účinnost časanalýzy KINETICKÁ ANALÝZA (KINETIC PLOT) Rychlé analýzy? Analytica Chimica Acta 894 (2015) 20-34. 1.8 mm 3.5 mm 5 mm 30 000 10 000 100 000 1 000 000 Malé částice Nižší účinnost KINETICKÁ ANALÝZA (KINETIC PLOT) Rychlé analýzy? Analytica Chimica Acta 894 (2015) 20-34. 1.8 mm 3.5 mm 5 mm 30 000 10 000 100 000 1 000 000 350 000 Malé částice Nižší účinnost Vysoká účinnost? Větší částice Pomalejší analýzy POPPEHO GRAFY J. Chromatogr. A 778 (1997) 3-21. CHARAKTERIZACE KOLON www.americanpharmaceuticalreview.com RŮZNÉ POHLEDY Srovnání kolon z hlediska času analýzy, velikosti částic, účinnosti, pracovního tlaku (UPLC!) apod. Chybí vliv experimentálních podmínek na rozmývání píků (účinnost) LCGC Europe 18 (2005) 403–408. van Deemterova rovnice (PŘÍPADNÉ) SAMOSTUDIUM  H. Poppe, Some reflections on speed and efficiency of modem chromatographic methods, J. Chromatogr. A 778 (1997) 3-21.  A. Andrés, K. Broeckhoven, G. Desmet, Methods for the experimental characterization and analysis of the efficiency and speed of chromatographic columns: A step-by-step Tutorial, Analytica Chimica Acta 894 (2015) 20-34.  G. Desmet, D. Clicq, P. Gzil, Kinetic Plots to Directly Compare the Performance of LC Supports, LCGC Europe 18 (2005) 403–408.  U. D. Neue, Kinetic Plots Made Easy, LCGC North America 27 (2009) 974- 983.  http://www.chromedia.org/chromedia?waxtrapp=curoegDsHonOvmOlIEcCdB oB&subNav=kuroegDsHonOvmOlIEcCdBoBbC ROZLIŠENÍ 𝑅1,2 = 𝑁 4 ∙ 𝑘2 − 𝑘1 𝑘1 ∙ 𝑘1 1 + 𝑘1 = 𝑁 4 ∙ 𝛼 − 1 𝛼 ∙ 𝑘1 1 + 𝑘1 web.natur.cuni.cz/~pcoufal/hplc.html 𝑅1,2 = 2 𝑡 𝑅,2 − 𝑡 𝑅,1 𝑤1 + 𝑤2 w1 w1 N – počet pater k – retenční faktor účinnost selektivita retence a – selektivita 𝛼 = 𝑘2 𝑘1 KONTROLA ROZLIŠENÍ 0 100000 200000 300000 0 2 4 6 8 Rozlišení 0 10 20 30 D R(N) R(k) R(a) 1.0 1.1 1.2 1.3 𝑅1,2 = 𝑁 4 ∙ 𝛼 − 1 𝛼 ∙ 𝑘1 1 + 𝑘1 N N a a k k Rozlišení dvou látek nejvíce ovlivňuje selektivita separace (stacionární a mobilní fáze) TESTY SELEKTIVITY Engelhardt 𝐸 = 𝑘 𝑒𝑡ℎ𝑦𝑙𝑏𝑒𝑛𝑧𝑒𝑛 𝑘 𝑡𝑜𝑙𝑢𝑒𝑛 𝑇 = 𝑘 𝑎𝑚𝑦𝑙𝑏𝑒𝑛𝑧𝑒𝑛 𝑘 𝑏𝑢𝑡𝑦𝑙𝑏𝑒𝑛𝑧𝑒𝑛 55% metanol 80% metanol 𝑊 = 𝑘 𝑎𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑒𝑛 𝑘 𝑏𝑒𝑛𝑧𝑒𝑛 65% acetonitril 60% metanol 𝐸 = 𝑘 𝑎𝑛𝑖𝑙𝑖𝑛 𝑘 𝑓𝑒𝑛𝑜𝑙 𝑇 = 𝑘 𝑘𝑜𝑓𝑒𝑖𝑛 𝑘 𝑓𝑒𝑛𝑜𝑙 30% metanol 55% metanol 𝑊 = 𝑘 𝑁,𝑁−𝑑𝑖𝑒𝑡ℎ𝑦𝑙𝑡𝑜𝑙𝑢𝑎𝑚𝑖𝑑 𝑘 𝑎𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑒𝑛 100% acetonitril 𝐺 = 𝑘 𝑡𝑜𝑙𝑢𝑒𝑛 + 𝑘 𝑏𝑒𝑛𝑧𝑒𝑛 2 𝐺 = 1 + 3 𝑘 𝑎𝑛𝑖𝑙𝑖𝑛 𝑘 𝑓𝑒𝑛𝑜𝑙 − 1 60% metanol Testy hydrofobicity Testy silanolové aktivity Tanaka Walters Galushko RADAROVÉ GRAFY www.chromatographyonline.com H – hydrofobicita S – stérická selektivita A – „kyselost“ stacionární fáze B – „zásaditost“ stacionární fáze C – ion-exchange kapacita, pH 2.8 a 7 http://www.usp.org/app/USPNF/columns.html RůznéPodobné Product Quality Research Institute (PQRI) METYLÉNOVÁ SELEKTIVITA & INDEXY INTERAKCE Alkylbenzeny Retence homologické řady 2 3 4 51 Retence Počet metylenových skupin Lipofilicita stacionární fáze log 𝑘 = 𝑛 𝑐 ∙ log 𝛼 + log 𝛽 = 𝑛 𝑐 ∙ 𝛼, + 𝛽, a, - metylénová selektivita Indexy interakce J. Sep. Sci. 26 (2003) 1005–1016.Anal. Chem. 54 (1982) 435–441. log 𝑘∗ = log 𝑘 − log 𝑉𝑠 𝑉 𝑀 𝑉𝑥 = 𝐴 − 𝐵 ∙ 𝐼 𝑥 Indexy interakce nebo Ix – tabelované hodnoty Charakterizace kolon ÚČINNOST / RETENCE / SELEKTIVITA J. Churáček, P. Jandera, Úvod do vysokoúčinné kapalinové chroamtografie, SNTL, Praha 1984. Nemožné je jen to, o co jsme se nepokusili. Neslon Mandela Tim McFarlin / www.pinterest.com