VÍCEROZMĚRNÉ SEPARAČNÍ TECHNIKY Pokročilá kapalinová chromatografie Jiří Urban, Ústav chemie, Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita, Brno, urban@chemi.muni.cz MODERNÍ UMĚNÍ (?) www.tjbiochip.com (2D) GELOVÁ ELEKTROFORÉZA www.tjbiochip.com Molárníhmotnost pH BYLO NEBYLO … „…but the two-dimensional chromatogram is especially convenient, in that it shows at a glance information that can be gained otherwise only as the result of numerous experiments“. A.J.P. Martin Biochem J. 38 (1944) 224. Aminokyseliny z hydrolyzátu vlny První dimenze: 3 dny Druhá dimenze: 27 hodin E. COLI DIGEST J. Chromatogr. A,1217 (2010) 6610 – 6615. ~ 1000 píků za 11 hodin 1D HPLC První dimenze, 1nc 2D HPLC První dimenze, 1nc 𝑛 𝑐,2𝐷 = 1 𝑛 𝑐 × 2 𝑛 𝑐 Násobné zvýšení píkové kapacity OFF-LINE Jednotlivé frakce se sbírají z D1 kolony, zakoncentrují se a dávkují se na D2 kolonu. ON-LINE: HEART-CUT Předem vybrané frakce z D1 kolony se přímo převádí na D2 kolonu přepínacím ventilem ON-LINE: HEART-CUT Analýza nečistot COMPREHENSIVE 2D-LC „Bezztrátová“ 2D-LC COMPREHENSIVE 2D-LC www.laboratory-journal.com DVOUROZMĚRNÁ CHROMATOGRAFIE J. Chromatogr. A 1189 (2008) 207–220 Fenolické látky a flavony PODROBNĚJŠÍ INFORMACE O VZORKU Sazenice kukuřice Majoritní složka Minoritní složky ZPRACOVÁNÍ DAT 1) Modulace Kompletní převod D1eluátu do druhé dimenze (D2) 2) Transformace Zpracování dat poskytnutých detektorem druhé dimenze. 3) Vizualizace Prezentace dat pomocí obrysového nebo prostorového grafu. D1 pump D2 pump D1 column D2 column waste loop 1 loop 2 detector PŘEVOD FRAKCÍ Tomáš Hájek, Univerzita Pardubice PŘEVOD FRAKCÍ Dvě 2D kolony FREKVENCE PŘEVODU FRAKCÍ OK xx FREKVENCE PŘEVODU FRAKCÍ OPTIMALIZACE SLOŽENÍ MOBILNÍ FÁZE J. Chromatogr. A 1360 (2014) 164 – 171. 8x vyšší signál Isopropanol AKTIVNÍ MODULACE Snížení eluční síly mobilní fáze (7 x 1D Fm) Zakoncentrování píků HILIC x RP Surfaktanty (tristyrylfenol ethoxylátfosphát (TSP)) HILIC: délka etoxylátového řetězce RP: míra substituce (styren, fosfát) Anal. Chem. 88 (2016) 1785–1793. ORTOGONALITA Úplná korelace Částečná korelace Ortogonalní separace ORTOGONALITA Úplná korelace Částečná korelace Ortogonalní separace Žádná přidaná informace Nejlepší pokrytí prostoru KVANTIFIKACE ORTOGONALITY TYPY 2D-LC SEPARACÍ Teorie „Bananagrams“ Shluky Ideální ortogonalita OPTIMALIZACE PODMÍNEK www.chromatographyonline.com/comprehensive-two-dimensional-liquid-chromatography-lc×lc-review VLIV KOLONY VE DRUHÉ DIMENZI J. Chromatogr. A 1268 (2012) 91–101. KOMPATIBILITA PODMÍNEK NPLC RPLC HILIC IEX SEC GFC NPLC +++ + ++ + +++ + RPLC + +++ +++ +++ + +++ HILIC + ++ +++ + ++ ++ IEX - +++ + +++ - +++ SEC +++ + ++ + +++ + GFC + +++ ++ +++ + +++ +++ velmi kompatibilní ++ relativně kompatibilní NPLC – normální fáze, RPLC – reverzní fáze, HILIC – hydrofilní interakce, IEX – iontová výměna, SEC – size-exclusion, GFC – gelová filtrace + možné, ale nesnadné - obtížné KOMPATIBILITA PODMÍNEK J. Chromatogr. A 1087 (2005) 112–123. Reverzní fáze (D1) Zorbax Extend C18 column, 5 mm, 150 mm×3.3 mm, 50–100% ACN za 110 min při 0.2 ml/min, 40◦C. Normální fáze (D2) Separon SGX Amin, 5 mm, 150 mm×1mm i.d., 5% 2-propanol v hexanu, 0.5 ml/min, 40◦C. Vf(max) < 5 ml OBJEM PŘEVÁDĚNÉ FRAKCE Kolona ve druhé dimenzi wexp, μL z, 5 μL z, 10 μL z, 20 μL Vf(max), μL Chromolith Flash RP18-e (25 mm × 4.6 mm) 77 1.27 1.58 2.68 4 Poroshell 120 SB-C18 (30 mm × 3.0 mm, 2.7 μm) 49 1.14 – – 4 Ascentis Express C18 (30 mm × 3.0 mm, 2.7 μm) 51 1.17 2.05 – 4 Kinetex 2.6μ C18, 100A (50 mm × 3.0 mm, 2.6 μm) 33 1.15 1.94 – 4 Kinetex 2.6μ XB-C18, 100A (50 mm × 3.0 mm, 2.6 μm) 33 1.03 1.67 1.79 5 Kinetex 2.6μ XB-C18, 100A (30 mm × 3.0 mm, 2.6 μm) 41 1.39 2.58 – 3 Ascentis Express C8 (30 mm × 3.0 mm, 2.7 μm) 48 1.38 – – 4 Kinetex 2.6μ PFP, 100A (50 mm × 3.0 mm, 2.6 μm) 38 1.16 – – 4 Kinetex 2.6μ PFP, 100A (30 mm × 3.0 mm, 2.6 μm) 54 1.63 2.61 – 2 Ascentis Express Phenyl-Hexyl (30 mm × 3.0 mm, 2.7 μm) 103 1.17 1.81 – 4 Ascentis Express RP-Amide (30 mm × 3.0 mm, 2.7 μm) 84 1.19 2 – 3 J. Chromatogr. A 1268 (2012) 91–101. - štěpení píku z < 1.1 z – faktor rozšiřování píku z důvodu nekompatibility OBJEM PŘEVÁDĚNÉ FRAKCE J. Chromatogr. A 1268 (2012) 91–101. Rychlé gradienty 0 – 100% acetonitrilu v 1 min při 2.5 mL/min. Kinetex C18 50 mm × 3 mm I.D., 2.6 μm OPTIMÁLNÍ 1D VNITŘNÍ PRŮMĚR Vf(max) = 4 μL, L = 20 cm, H = 20 μm, ε0 = 0.66, a ke = 3 I.D. ~ 0.5 mm Vf(max) = 4 μL, L = 20 cm, H = 15 μm, ε0 = 0.75, a ke = 3.5 I.D. ~ 1.0 mm Cent. Eur. J. Chem. 10 (2012) 844-875. 𝑑 = 2 3 4 𝑉𝑓(𝑚𝑎𝑥) 𝜋𝜀0 1 + 𝑘 𝑒 𝐿𝐻 − 1 4 = 0.98 𝑉𝑓(𝑚𝑎𝑥) 𝜀0 1 + 𝑘 𝑒 1 2 𝐿𝐻 − 1 4 2D KLASIFIKACE J. Chromatogr. A 1268 (2012) 91–101. I – polární fenolické kyseliny, II – fenolické kyseliny s dvěma –OH skupinami, III – fenolické kyseliny s jednou –OH skupinou a dvěma metoxy skupinami, IV – aglykosidové flavony, V – glykosidové flavony, VI – ostatní fenolické kyseliny s jednou –OH skupinou, VII – katechiny 2D KLASIFIKACE Anal. Chem. 78 (2006) 7743–7750. www.colourbox.com www.helloblend.com PÍKOVÁ KAPACITA (IZOKRATIKA/GRADIENT) Maximální počet píků, které lze rozdělit v rámci jedné analýzy Izokratická eluce Gradientová eluceP 5 10 VR,Z/VR,1 100 200 6 𝑛 𝑐 = 𝑡 𝑔 𝑤 14 GRADIENT V DRUHÉ DIMENZI GRADIENT V DRUHÉ DIMENZI SIF "segment in fraction" D1 D1 D2 D2 D2 D1 RP×RP RP×RP HILIC×RP D1: zwitteriontový metakrylátový monolit D2: Chromolith HighResolution FIF „full in fraction" SG „shift gradient" Tomáš Hájek, Univerzita Pardubice VÍCEROZMĚRNÉ SEPARACE Moč Káva Červené víno Fenolické látky ANALÝZA PROTILÁTEK www.chromatographyonline.com PILSNER URQUELL J. Sep. Sci. 31 (2008) 3309 – 3328. BUDOUCNOST 2D LC PRO ZÁJEMCE Peter W. Carr and Dwight R. Stoll Agilent 2015 http://www.agilent.com/cs/library/ primers/Public/5991-2359EN.pdf “Once your mind stretches to a new level it never goes back to its original dimension.“ Abdul Kalam www.clipartfest.com