Biologie rostlinné buňky 2. Buněčné jádro ► Objev jádra a jeho role v dědičnosti ► Objev DNA a její struktury ► Izolace jader ► Struktura jádra ► Jaderný obal, LINC a jaderné nukleární komplexy ► Jaderná lokalizace (import) a export proteinů ► Morfologie chromatinu a chromozomů ► Jadérko a tvorba ribozomů ► Objev syntézy bílkovin Produkce proteinů v eukaryotických buňkách ► Genová exprese u eukaryot ^gen DMA replication DNA repair etic recombination 5' 3' DNA ■ I. 5' RMA synthesis (transcription) RMA 5'..................... 3' protein synthesis (translation) PROTEIN! H:N- COOH amino acids Objev jádra a jeho role v dědičnosti ► Robert Brown (1831) poprvé popsal strukturu jádra v orchidejích ► as a "single circular areola, somewhat more opaque than the membrane of the cell ► Matthias Schleiden (1838) nazval jádro cytobiast, důležité pro tvorbu buněk. ► Theodor Schwann buňky a jejich struktury, byly stejně důležité pro určování vývoje a morfologie u živočichů jako u rostlin. ► Rudolf Virchow (1860) protože jádro může být v živé buňce obtížně viditelné, teprve po obarvení jádra alkalickým roztokem karmínu se ukázalo, že je v každé živočišné a rostlinné buňce. ■j , / Jádro (a) a jadérko}b) buněk cibulového parenchymu. Schwann, 1847. ► Věřilo se, že jádro a jeho kyseliny, obsahuje podstatu života ~ bioplasmu. ► Walther Flemming (1882) protože jádro bylo snadno obarveno barvivy, jeho obsah dostal název chromatin což znamená „barevngAatka"^ Fragmenty, na které se chromatin dělil, dostaly název chromatické prvky a chromozomy, což znamená „barevná tělíska". Objev jádra a jeho role v dědičnosti ► Walther Flemming (1880) popsal chromozomy epiteliálních buněk mloká jako vláknité struktury a jejich dělení dal název mitóza. ► Jádro prošlo složitým procesem dělení chromozomů a každá somatická buňka měla nejen stejný počet chromozomů, ale také identické kopie To vedlo k myšlence, že chromozomy obsahují sebezvěčňující se informace (Roux, 1883), které byly nezbytné pro stavbu organismu, dědičnosti \ ► Hugo de Vries (1889) věřil, že chromozomy nesou dědičné faktory, které nazval „pangeny". Znovuobjevil Mendelovo dílo (1865).... chromozomů (Wilson, 1895). Objev DNA a její struktury Friedrich Miescher (1868) zkoumal chemické složení nukleinu z jader, která obsahují protamin, později nazývaný histon, a nukleové kyseliny \\ Pozdější organičtí chemici (Fischer, 1902) hydrolyzovali nukleové kyseliny na puriny, adenin (A) a guanin (G), stejně jako novou třídu sloučenin pyrimidiny obsahující thymin (5-methyluracil) (T), cytosin (C) a uracil (U). ► Zapomněli na skutečnost, že mateřskou molekulou byla makromolekula... ► Jednoduché izolační postupy vedly k tomu, že nukleové kyseliny rostlin se zdály být složeny z ribonukleosidů, zatímco nukleové kyseliny živočichů byly složeny z deoxyribonukleosidů (v 50. letech se připustilo, ze rostliny mají DNA!) ► Rentgenové difrakční snímky DNA prokázaly, že čtyři nukleotidy jsou distribuovány náhodně, a proto DNA funguje jako genetický materiál. ► Rosalind Franklin (snímky z rentgenové krystalografie), James Watson a Francis Crick popsali v roce 1953 molekulární strukturu DNA jako dvojitou šroubovici. ► Watson pomohl v roce 2003 zahájit projekt Human Genome Project, rozsáhlou iniciativu zabývající se sekvenováním celého lidského genomu za účelem zlepšení lidského stavu. Je genetickým materiálem protein nebo DNA? ► Přesto si mnoho vědců, včetně Williama Astburyho, který zavedl termín molekulární biologie, stále myslelo, že protein se podílí na dědičnosti možná ve formě nukleoproteinu. \ V roce 1952 provedli Alfred Hershey a Martha Chase experiment, který potvrdil, že genetickým materiálem je DNA. DNA bakteriofága T2 označili 32P a v druhém experimentu označili jeho protein 35S. Poté, co měl označený bakteriofág dost času vstříknout do bakterií svůj genetický materiál, oddělili bakterie od fága tím, že je hodili do mixéru Zjistili, že potomstvo T2 bylo značeno 32P, ale ne 35S, což ukazuje, že genetickým materiálem byla DNA, nikoli protein. bacteriophage T2 Protein Head I Collai Tail Lc 'It's all your fault, dad - terrible genes' Je třeba mít na paměti, že zatímco některé vlastnosti závisí výhradně na sekvenci jediného genu, většina vlastností závisí na mnoha faktorech, kromě genetického pozadí, ve kterémJegen exprimován, také na prostředí!!! Izolace jader ► ► Jádra byla poprvé izolována z buněk hnisu a spermií na konci 19. století. V současné době se jádra izolují homogenizací tkáně, následuje filtrace a centrifugace homogenátu (1900 g /10 min), aby se jádra peletovala. ► Pelet se resuspenduje, navrství se na Percollový gradient a podrobí se centrifugaci s gradientem hustoty (7800 g /30 min). ► Pň posledním odstředění se Percoll odstraní. 1 Čistota a neporušenost se ověří barvením jader Feulgenovým činidlem nebo DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) a testováním aktivity DNA nebo RNA polymerázy.' ► Proteomické a bioinformatické studie charakterizovaly proteiny, které jsou v jádře a komplexu jaderných pórů. Struktura jádra ► Jádro je velká organela o průměru asi 10 u.m v rostlinných buňkách. ► V meristematických buňkách je typicky kulovité, v diferencovaných buňkách může být zploštělé a elipsoidní - morfologie závisí na jeho aktivitě a druhuI^B Tobacco leaf epidermis ■ nlsRFP* i ^FPHDEL Arabidopsis leaf epidermis nlsRFP GF^HDEL 5 Arabidopsis root apical meristem \m*S'y *•% (RAM) . ....., s. • „' • • % • * ■* * • < * * 1 V 1 nlsGFP nls = nukleárně lokalizační signál, u proteinů, které jsou translokovány do jádra Vnější jaderná membrána je přímo napojená na ER, ER lumen obsahuje proteiny s karboxy-terminální sekvencí H/KDEL. Arabidopsis lateral root primordium Jaderný obal (the nuclear envelope) ► Jaderný obal uzavírá DNA a definuje jaderný kompartment. Skládá ze dvou soustředných membrán prostoupených jadernými pórovými komplexy (NPC). Vnější membrána je napojena na ER. Vnitřní jaderná membrána obsahuje proteiny, které působí jako vazebná místa pro chromozomy a pro jadernou laminu. ► Jaderná lamina je proteinová síťovina, která poskytuje strukturální podporu obalu a vazebná místa (kotvu) pro chromozomy a cytoplazmatický cytoskelet. Uvnitř jádra je jaderné matrice ► Je zde zabudován chromatin, avšak k matrici se připojují pouze specifické oblasti DNA. Podílí se na regulaci replikace DNA, transkripce a transportu RNA. nuclear envelope perinuclear space outer nuclear membrane inner nuclear membrane ER membrane nuclear pores nuclear lamina LINC komplex (linker of nucleo- and cyto- skeletons Proteinový komplex spojený s oběma membránami jádra. Obsahuje integrální membránové proteiny KASH a SUN: ► KASH spojuje vnější membránu s cytoskeletem na cytosolové straně obalu ► SUN ve vnitřní membráně interaguje s jadernou laminou a nukleoskeletem na vnitřní straně Outer nuclear membrane Nuclear pore complex Lamin A/C Sun trímer ► Funkce komplexu KASH-SUN ► ► ► mechanická komunikace mezi cytoskeletem a jadernou matricí ovlivňuje pohyb a tvar jádra (vliv na expresi genů) a mnoho buněčných aktivit (buněčný cyklus, NPCs) Jaderné pórové komplexy (Nuclear pore complexes NPCs) TEM (transmisn í elektronová mikroskopie) mikrografy: buňky tabáku zobrazující jaderný obal a organizaci komplexů jaderných pórů 100 nm Jaderné pórové komplexy (Nuclear pore complexes NPCs) ► Perforovaný jaderný obal u všech eukaryot, usnadňuje obousměrný nukleo-cytoplazmatický transport: ► Enzymy a proteiny syntetizovány v cytoplazmě, ale fungující v jádře (DNA a RNA polymerázy a histony). \ ► Messenger RNA (mRNA), přenosová RNA (tRNA) a ribozomální RNA (rRNA) spojené se syntézou proteinů musí opustit jádro a vstoupit do cytoplazmy. ► Jaderné póry se v průběhu času mění, typicky je jich asi 11 pórů na jim2 (v rozmezí 5 až 60), mohou být rozmístěny pravidelně nebo nepravidelně. Průměr 100-150 nm, tloušťka 50-70 nm. \ ► Uprostřed N PC je vodný pór, kterým mohou pasivně difundovat malé ve vodě rozpustné molekuly a proteiny (GFP). Jaderné pórové komplexy (Nuclear pore complexes NPCs) m ► Každý NPC se skládá ze sady cca 30 různých proteinů nebo nukleoporinN 8x rotační a 2x příčná symetrii, 500-1000 proteinů v plně sestaveném stavu. ► Nukleoporiny: rodina glykoproteinů, obsahují O-vázaný N-acetylglukosaml vytvářeny na cytoplazmatických ribozomech a glykosylovány v cytoplazmé] Importiny: napomáhají translokaci prostřednictvím NPC do jádra. Exportiny: usnadnění exportu z jádra Důkaz jejich významu u rostlin\ membráně vyplývá ze studií rin9 proteins mutantů, např. vývojové vady. nuclear basket scaffold nucleoporins channel nucleoporins disordered region of channel nucleoporins cytosolJc fibrils outer nuclear membrane nuclear envelope inner nuclear membrane 50 nm Jaderná lokalizace proteinů ► Proteiny, které jsou translokovány do jádra, mají speciální nukleární importr signál nebo nukleární lokalizační signál (nls, nuclear localisation signal). ► V mnoha jaderných proteinech se signály skládají z 1 nebo 2 krátkých sekven< které jsou bohaté na kladně nabité aminokyseliny (aa) lysin a arjf/n/nl Nejkratší sekvencí, která fungovala při jaderném zacílení, měla 8 aa. nls byl poprvé identifikován v proteinu T-antigenu kódovaného virem SV40. Pro zahájení importu musí být většina nls rozpoznána jadernými importními receptory: importiny ► kódovány rodinou příbuzných genů. ► Různé importiny se váží na různé nls a tím i různé cargo proteiny. cargo protein 1 cargo protein 2 cargo protein 3 nuclear import adaptor protein cargo protein 4 nuclear import receptor nuclear localization signals nuclear import receptor Import proteinů do jádra lze regulovat fosforylací aa v targetové sekvenci. Fosforylace může ovlivnit schopnost nls rozpoznat svůj receptor. Pokud je protein transkripčním faktorem (TF), může to mít přímý vliv na genovou expresi. A tail of nucleoplasmin attached to a 20-nm colloidal gold nanoparticle, is transported into the nucleus. Jaderný export funguje jako import, ale obráceně Důležité jaderné exportní signály na proteinech a jaderné exportní receptory neboli exporty ► Exportiny se váži jak na exportní signál, tak i na proteiny, a směřují cargo skrz NPC do cytosolu. ► Strukturálně příbuzné s importiny, kódovány stejnou genovou rodinou jaderných transportních recepto cargo delivered to cytosol protein with nuclear localization signal (cargo) cytosolic fibril nuclear import receptor nuclear export receptor Ran-GDP DISSOCIATES FROM RECEPTORS Ran-GTP cargo delivered to nucleus Ran-GDP + P 1 Ran-GTP BINDS TO RECEPTORS Ran-GDP protein with nuclear export signal (cargo) (B) NUCLEAR EXPORT Ran GTPáza určuje směr transportu skrz NPC ► Jaderný import i export proteinů prostřednictvím NPC vyžaduje energii uloženou v koncentračním gradientu GTP-vázané formy monomerní GTPázy Ran. Ran (GTPáza) je molekulární přepínač (molecular switch), který může existovat ve dvou konformačních stavech: GTP nebo GDP vázaný Dva regulační proteiny specifické pro Ran spouštějí konverzi mezi dvěma stavy: ► GTPase activating protein (GAP) spouští hydrolýzu GTP ► guanine exchange factor (GEF) podporuje výměnu GDP za G" Ran-GAP Ran-GAP se nachází v cytosolu a je importován do jádra vlastním receptorem Ran-GEF se/ nachází v jádře, kde je ukotven ke :hromatinu Morfologie chromatinu ► ► ► Molekuly DNA jsou vysoce kondenzované v chromozomech. Chromatin je komplex proteinů a nukleární DNA, v eukaryotických buňkách Proteiny, které se váží na DNA za vzniku chromozomů, se dělí do dvou tříd: histony a nehistonové proteiny (např. replikace DNA, oprava DNA, genová exprese). Histony jsou zodpovědné za základní jednotku balení chromozomů = nukleozonH short region of DMA double helix "beads-on-a-string" form of chromatin chromatin fiber of packed nucleoiomes chromatin fiber folded into loops entire mitotic chromosome linker DMA T 11 i core histories of nucieosome \ " be ad s-o n- a-stri n g" form of chromatin t )0 n 1 nucieosome includes ^200 nucleotide pairs of DNA a Zea mays root cells. Bar/5O0 hny 30 nm T POOi 1 700 nm centromere T Id 00 n m 1 NET RESULT: EACH DMA MOLECULE HAS BEEN PACKAGED INTO A MITOTIC CHROMOSOME THAT IS 10,000-FOLD SHORTER THAN ITS FULLY EXTENDED LENGTH Morfologie chromatinu se v průběhu buněčného cyklu mění. V interfazi je chromatin buď\ \ 1 ► vysoce kondenzovaný = heterochromatin, ► méně kondenzovaný zbytek je euchromatii folded chromatin fiber looped domain Histone acetylation histone- modifying enzymes chromatin remodeling complexes RNA polymerase proteins farming chromosome scaffold high-level expression of genes in loop INTERPHASE MITOSIS INTERPHASE telomere replication origin centromere CELL DIVISION + = i_i portion of replicated mitotic spindle chromosome duplicated chromosomes in separate daughter cells chromosome Eukaryotická DNA je zbalená do chromozom Každý chromozom v eukaryotické buňce se skládá z jediné, enormně dlouhé lineární molekuly DNA a proteinů. Chromozomy nesou geny (kódující sekvence = exony; introny). Každý lineární chromozom má centromeru a dvě telomery. Během interfáze se chromozomy replikují, přičemž dvě repliky zůstávají pohromadě jako pár sesterských chromatid. Vysoce kondenzované chromozomy v dělící se buňce jsou známé jako mitotické chromozomy. centromere I_I chromatid Během mitózy se jaderný obal rozpadá nuclear póre lamins DNA complex < M nuclear envelope inner nuclear membrane outer nuclear membrane FUSION OF ENVELOPED CHROMOSOMES nuclear pore complex proteins nuclear envelope fragment LATE TELOPHASE PROPHASE FUSION OF NUCLEAR ENVELOPE FRAGMENTS DEPHOSPHCRYLATION OF LAMINS EARLY TELOPHASE Figure 12-18 The breakdown and reformation of the nuclear envelope and lamina during mitosis. Phosphorylation of the lamins triggers the disassembly of the nuclear lamina, which initiates the nuclear envelope to break up. Jadérko je továrna na ribozomy ► ► Jadérko je místo pro zpracování rRNA molekul a jejich seskupení spolu s polypeptidy, které pocházejí z cytoplazmy do ribozomů. Ribozom je velký komplex složený ze dvou třetin RNA a jedné třetiny proteinu. rRNAs jsou zodpovědné za celkovou strukturu ribozomů! Jadérko není obklopeno membránou. Jadérko se vytváří na konci mitózy a v profázi opět mizí. Mnoho kopií ribozomálních genů (geny rRNA) sídlí v shluku chromozomální DNA, známém jako organizátor jadérka. •nlsRFP GFPhdel I dying cell?! 5 |j.m Zpracování 45S rRNA prekurzoru na tři samostatné rRNA 5' PPP- 45S precursor rRNA 13,000 nucleotides 3' - OH degraded regions of nucleotide sequence 18S rRNA incorporated into small rJbosomal subunit CHEMICAL MODIFICATION CLEAVAGE 5.8S rRNA 2SS rRNA 5S rRNA made elsewhere incorporated into large ribosomal subunit Každý gen rRNA produkuje stejný primární transkript, prekurzor 45S rRNA, jeho štěpením se získá 1 kopie každé rRNA: 28S, 18sV Tvorba ribozomů vyža| čtvrtou rRNA, 5S rRNA| transkribovanou mimo jadérko a importovanou Transkripty 28S, 5.8S a se kombinují s asi 50 polypeptidy za vzniku velké ribozomální podjednotky 60S ■ Transkript 18S se spojí s a] 30 polypeptidy za vzniku malé ribozomální podjednotky 40S. 60S a 40S jsou transportoval z jádra. Poslední krok, který dokončuje ribozom 80S, se odehrává v cytoplazmě. Eukaryotická buňka musí syntetizovat asi 10 milionů kopií každé molekuly rRNA aby vytvořila 10 milionů ribozomů, které bude během svého života potřebov TranslocoiV SRP receptor Objev syntézy bílkovin George Gamow přemýšlel, jak lze informace kódované v DNA ve formě sekvence 4 různých bází přeložit do sekvence 20 aa, které tvoří protein. V roce 1954 navrhl trojitý kód, nebylo jasné, zda se kód překrývá nebo ne. Gamow a Ycas (1955) použili počítač v Los Alamos k provedení statistické analýzy a došli k závěru, že existuje trojitý kód, který se nepřekrývá. V 50. letech se předpokládalo, že RNA v ribozomech poskytuje templát pro syntézu proteinů. Hypotéza „jeden gen - jeden ribozom - jeden protein". Crick (1966) popsal degeneraci kódu ve své hypotéze kolísání, která uvedla, že „zatímco standardní páry bází mohou být použity spíše přísně v prvních dvou pozicích tripletu, může docházet ke kolísání při párování třetí báze." V roce 1968 Nobelova cenu za rozluštění genetického kódu Marshallu Nirenbergovi, Gobindu Khoranovi, Robertu Holleymu, kteří použili syntetickou mRNA k jeho rozluštění a určili, která aminokyselina (aa) byla kódována 64 možnými kodony. 5' 3' , CUC 11 A G C iGUU i ACC i AU -Leu -Ser -Val- -Thr- Cj^jc^j^n^^ ^c^j — Ser- -Ala- -Leu Pro — CUnCAGiiCGU iiUAC nCAU — Gin - Arg - -Tyr- •His — Figure 6-49 The three possible reading frames in protein synthesis. Í.RNA wobble position AGA UUA AGG UUG GCA CGA GGA CUA GCC CGC GGC AUA CUC GCG CGG GAC AAC UGC GAA CAA GGG CAC AUC CUG AAA AGC AGU CCA UCA ACA GUA CCC UCC ACC GUC UUC CCG UCG ACG UAC GUG GCU CGU GAU AAU UGU GAG CAG GGU CAU AUU CUU AAG AUG UUU CCU UCU ACU UGG UAU GUU UAA UAG UGA Ala Arg Asp Asn Cys Glu Gin Gly His lie Leu Lys Met Phe Pro Ser Thr Trp Tyr Val stop ARDNCEQGH I LKMFPSTWYV CG-box —110 _\ TATA box Transcription (if present): start sl,e Genová exprese u eukaryot ATG (translation start site) Translational STOP J Transcription ends here Intron 1 Intron 2 Exon 1 Exon 2 TAA TAG TGA 10-20 bp Exon 3 TAA ATT AATAAA 3' Coding strand -/- Regu BRE' (if present) atory promoter (aka c/s-acting sequence) Core promoter region DPE (if present): ~ +30 5' UTR I FUE' 5' m7G cap AUG Introns removed UAA UAG UGA Y Nucleus Coding DNA sequence (CDS) Cytoplasm Translation into protein Modification UStoQ Protein Degradation (e.g., via 26S proteasome) Retention for long-term function T t Poly-A Poly-A signals (cleavage site) "\-5' Template strand Y 3' UTR AAAAAW 3' Regulace transkripce regulačními promotorovými sekvencemi, enhancery a trans-regulačními faktor Enhancer Enhancer (downstream) Reportérové geny odhalují, KDY a KDE je ge exprimován a to je dáno promotorem ► Fluorescenční proteiny (např. GFP, RFP), GUS ((3-glucuronidase, uidA) (A) 5TARTING DNA MOLECULES normal coding sequence for protein X c/s-regulatory DNA sequences that determine the expression of gene X start site for RNA synthesis coding sequence for reporter protein Y EXPRESSION PATTERN OF GENE X cells 'A B c D E F ■ pattern of normal gene X expression cells ' A B C D E F pattern of reporter gene Y expression ► Tŕanscripční vs translační fúze s FP ► Promotor + FP Promotor + GENE + FP 46e-ll v 81b * 80e \ ' 1 třřé ... 46e-í 67e m 105d •"•TT/ • W * , 1 1 1 * * 21y Promoter EXPA nis eGFP Homologní rekombinace jako nástroj pro studiím ► genu Homologní rekombinace, integrace T-DNA molekuly do homologní sekvenj genomové DNA, má mnoho možných aplikací pro manipulaci genů ► Nevyskytuje se u krytosemenných rostlin.... (náhodná interace T-DNA do genomuť ► Popsána u mechu Physcomitrella patens (genetický model), kvasinek, hub, bal Knock-out gene mutant 1 1 i m Aku70 ~ lacks gene (Ku70) involved in the nonhomologous DNA end-joining pathway NHEJ1 \ M V rostlinách se mohou exprimovat hybridní nukleázy, které generují místně! specifické štěpení obou řetězců genomové DNA (site-directed mutagenesis) ► Výměna cílové sekvence DNA - knock-in mutant ► Narušení čtecího rámce (open reading frame, ORF) - knock-out mutant Používají se specifické enzymy, např. ZNF (zinc-finger nuclease), TALEN (transcriptional activator-li ke effector nuclease) Bakteriální systém CRISPR/Cas9 byl přizpůsoben k editaci genomu různých druhů - genetické nůžky ► Schopnost Cas9 (nukleáza) zacílit specifické místo genomové DNA 2020 Nobelova cena za chemii udělena E. Charpentier a J. Doudna Příklad použití CRISPR/Cas9 CRISPR/Cas9 guide RNA fjjy^-mm........Ki ........I I I I I I v 1 I I -i PMílsiH <•"*<•> RAM site Double-stranded DNA break 7K im 11111 m i li ........1111 i i \y Bodová NHEJ^-^*^\^ HDR h mutace TTTTTT-^^O DonorejcternülDNA III H ill IK I d 1111111111111J F111 .....'.............. CRISPR: Clustered Regularly \nterspacedl Shortpalindromic Repeats https: 11 www. youtube. com/watch?v=4YKFw2KZA5o&ab_channel=naturevideo ► narušení ORF a vytvoření KO „knock-out" mutanta _ Expected {guideRNA sequence CCCATGTGCAGGTTGTTAACACAAGAC ľ T TTATAT CACCCAT G Wl GCAGGTT GTTAAC ACAA GACGT } 00 A 70 80 91 RNA interference (RNAi) se používá k umlčování genů ..knock-down" mutanti RNA pol II DNA L Transcription Pri-miRNA I I T Pre-miRNA i-1 Nucleus HASTY (EXP0RTIN5) Ríbosome 1. Primary rniRNA (pri-miRNA) is transcribed, folds into a hairpin structure (pre-miRNA), and is processed. 2. Processed double-stranded (ds) RNA is bound to the RNA-induced silencing complex (RISC), containing the catalytic ARGONAUTE (AGO) protein. 3. One strand of the dsRNA is removed and the complex is exported into the cytoplasm, where it either degrades the target mRNA or halts its translation. The RNAi pathway in plants ► short interfering (si RNA) RNAs - exogenous ds RNA \ adB0 Mature 5ÍRNA T, ► micro-RNA (miRNA) - single-stranded RNA 1 ► endogenní, z nekódující oblasti RNA[ ► blokuje translaci gen ► destabilizuje mRNA ► artifical micro-RNA amiRNA)^ Chemicky indukovatelná genová exprese Regulovaná genová exprese genu v určitém vývojovém stádiu a po určitou dobu, pomoci chemických induktorů, např. pOpó/LhGR systém AC IV TO DNA - transcription binding d. activation d. promoter (T HSP90 omplex Tkáňově specifické promotory aktivátoru! ) X x lac TATA operators box INDUCER (dexamethasone)