Biologie rostlinné buňky 5. Buněčná stěna ► Rozdíly mezi extracelulární matrix rostlinných a živočišnýchl ► Přehled struktury primární a sekundární buněčné stěny (BS) ► Přehled funkcí BS ► Izolace a analýza BS ► Model primární BS rostlin ► Chemické složení rostlinné BS ► Celulóza, hemicelolózy a pektiny ► Syntéza celulózy CESA komplexem ► Biogeneze buněčné stěny ► Mechanika buněčného růstu ► Expansiny ► Sekundární buněčná stěna ► Struktura, funkce, lignifikace ► Permeabilita BS ► Syntéza kalózy Rozdíl mezi extracelulární matrix (ECM) rostlinných a živočišných buněk V 17. století byly buňky v rostlinách snadno identifikovatelné (Hooke, 1665). Na rozdíl od živočichů, kde je stěna tenká nebo neexistující, což bylo překážkou pro poznání, ze zvířata se také skládají z buněk! Většina buněk vylučuje do okolního média makromolekuly, které se slučují do organizované struktury, která se nazývá buněčná stěna (BS), extracelulární matrix (ECM), apoplast, glykokalyx, sliz nebo buněčný obal... ► Mezi rostlinnými biology se termíny buněčná stěna a extracelulární matrix používají zaměnitelně a kontinuum buněčných stěn se obvykle označuje jako apoplast. Buněčná stěna zdůrazňuje podpůrnou roli struktury buňky. ECM zdůrazňuje živé a dynamické aspekty oblasti vně plazmatické membrány a nikdy neznamenala mrtvá část buněk, na rozdíl od termínu apoplast, což j pochází z řečtiny pro „bez formy". protoplasty 100 pm 55 pni 75 pm Diverzita buněčné stěny (A) sponge parenchyma (B) Arabidopsis trichome (C) a guard-cell pair (D) transfer cells for sugar transport (E) sieve plate (F) epidermal cells of Antitthium sp reflect light and enrich colour (G) pollen grains Přehled struktury primární a sekundární BS ► V meristémech rostlin se BS začíná tvořit během cytokineze (cell plate). ► Primární buněčná stěna (PBS) má tloušťku ~ 100 nm, je jen mírně tuhá, takže buňka může stále expandovat. PBS obsahuje ztenčeniny (primáry pit fields), kterými procházejí plasmodesmata. ► PBS se tvoří, když se buňka stále rozšiřuje, sekundární stěna se vytváří po ukončení expanze. Růst stěny je však kontinuální proces, takže mezi PBS a SBS nedochází k zřetelnému oddělení. ► BS má význam v textilním, papírenském, potravinářském, stavebním průmyslu; výroba celulózových bi opáliv! PCW of lea mays showing a pit field through which the plasmodesmata traverse, x 15,000 Přehled struktury primární a sekundární BS ► Sekundární buněčná stěna (SBS) se začíná ukládat buď ztluštěním PBS (intususcepce) a/nebo apozicí, což je ukládání nových vrstev materiálu stěny o tloušťce ~ 10 \xm mezi plazmatickou membránu a PBS (směrem dovnitř buňky!). SBS se specializuje na mechanickou podporu, často jsou buňky ve zralosti mrtvé. SBS tracheid, cévních prvků a vláken obsahuje lignin: ► zesíťované (cross-linked) polymery složené z derivátů polypropanoidní dráhy. ► dělá celulózu vodotěsnou (waterproof), takže si zachovává tuhost a umožňuje vedení vody. Suberin, další voskovitá látka, která se spolu s ligninem vyskytuje v kořeni, tzv. Casparův proužek (Casparian strip): ► zajišťuje vodotěsnost a také to, že voda a rozpuštěné látky pronikají do stéle (střední válec kořene) přes symplast. S3 -S2 S1 Middle lamella Primary cell wall tracheidy ^02777^7364677 Přehled funkcí BS ► ► ► Tlustá BS brání rostlinám v pohybu! Ale je to velmi dynamická struktura!!! BS se podílí na mnoha aspektech buněčné morfologie, fyziologie a vývoje. Tloustnutí BS umožňuje buňce generovat vnitřní hydrostatický tlak (turgor) (0,1-1 *j ► poskytuje buňce tuhost a mechanickou pevnost („exoskeleton"), rostliny mohou růst do výšky a š ► transpirační proudění vody v xylému vyžaduje mechanicky pevné stěny, které odolávají zhroucení BS se podílí na organizaci cytoskeletonu (aktinu a mikrotubulů), dělení buněk, tvorbě embryí, vnímání gravitace, vnímání buněčné integrity. Bariéra proti patogenům ► Fragmenty CW, fungující jako elicitory, signalizují buňce, aby vytvořila antiseptické sloučeniny (fytoalexiny). Kutikula, která obsahuje kutin a vosk, brání napadení patogeny, vodotěsnost BS. ► Mnoho fascinujících strukturálních specializací BS vede k mimořádným barvám rostlin (rýhovaná kutikula v okvětních lístcích, funguje jako difrakční mřížka a vytváří barvy). Sclerenchyma Phloem Cortex Pru řez stonkem buttercup (Ranunculus repens), ^qq zobrazující buňky s různoumorfologU stěny v různých typech kořenových pletiv Izolace a analýza BS ► Pletivo se homogenizuje a BS se buď zpeletuje centrifugací (250-1000 g ľ 5-20 min) nebo se přefiltruje přes síto s póry o průměru 5-10 um. ► Složení a struktura BS může být charakterizována: hmotnostní spektrometrií (MS, AAALDI-TOF) ► nukleární magnetickou rezonancí (NMR) high-performance liquid chormatogaphy (HPLC) ► elektroforézou, pomocí microarrays Model primárni buněčné stěny rostlin ► Mikrofibrily celulózy (poskytují pevnost BS) uložené v gelovité matrici hemicelulóz a pektinů (viskoelastické vlastnosti BS) a proteiny. ► ► Middle j— Lamella 1_ Primary Cell Wall ' Plasma Membrane Pectin Cellulose Microfibril Hemicellulose Soluble Protein Rostlinná BS obsahuje obecně asi 60 % vody a sušinu, která se skládá především z polysacharidu, včetně celulózy, hemicelulóz a pektinů. Celulóza je nejrozšířenější makromolekula na Zemi! Složení BS závisí na typu buňky! (její struktuře a funkci...) A Střední lamela ► Tenká vrstva nacházející se na rozhraní, kde se dotýkají stěny sousedních buněk. ► Její původ lze vysledovat na buněčnou destičku (cell plate) vytvořenou během buněčného dělení, další materiál je nabírán do této vrstvy, když buňky expandují. ► Obohacená o pektiny, které mohou být v komplexu s glykoproteiny bohatými na hydroxyprolin. ► Klíčovou funkcí je, že slouží jako pružná adhezivní vrstva mezi buňkami. Middle lamella Primary walls \—íi—li Konformační struktury cukru běžně se vyskytujících se v BS rostlin (A) Hexoses CHjOH^O, H ß-D-Galactose (Gal) CH-.OH ^JX OH OH H ß-D-Glucose (Glc) CH.OH ^0, ß-D-Mannose (Man) {B) Pentoses -Ov OH H ß-D-Xylose (Xyl) ^O. a-L-Arabinose (Ara) .0, HOCH OH a-D-Apiose (Api) (C) Uronic acids o: (D) Deoxy sugars H OH OH ot-D-Galacturonic acid (GalA) H OH A ■'■ J— X.H HO^- OH H a-D-Glucuronic acid (GIcA) OH a-L-Rhamnose (Rha) H CHar±^ OH HO OH "y-OH H a-L-Fucose (Fuc) (E) Cellobiose CH,OH ^Ov OH H H CH oH Glucosyl Glucose Celobióza: (1,4)-ß-D- vazba mezi dvěmi molekulami glukózy , Celulóza: microfibrily (mikrovlákna) (1,4)-ß-D-glucan Chemické složení rostlinné BS - celulóza Celulóza (cca 20-30 % sušiny, dry weight DW) je dlouhý lineární řetězec nejméně 500 molekul glukózy spojených dohromady p-1,4 glykosidickými vazbami. Sousední molekuly celulózy jsou drženy pohromadě vodíkovými vazbami (můstky). Přibližně 18-24 molekul stejné polarity drží pohromadě, aby vytvořily celulózové vlákno (mikrofibril) ~ 3 nm v průměru (obrázek AFM). Vodíkové můstky uvnitř a mezi sousedními glukanovými řetězci. Syntéza celulózy pomocí CESA komplexu ► Celulózové mikrofibrily jsou syntetizovány z uridindifosfátu (UDP)-glukól na buněčném povrchu membránově vázanými komplexy obsahujícími celulózovou syntézu A (CESA). ► Komplexní rozetovité struktury tvořené 6 podjednotkami, každá obsahuje 3-6 CESA ► Superrodina celulózové syntázy CESA a CSL genů (cellulose-synthase like CSL genes). Outside of cell Plasma membrane Cytoplasm CESA complex 2.5 nm ESmBH (A) Xytoglucan I HQ- X -/~ I 1 ^*s/ Hl v> v> v> '?> '€> (1,4)|3-D-Gk-(1,4)p-D-Glc-(1,4)|J-D-Glc-(1,4)p-D-Glc-(1,4)p-D-Glc-(1,4)p-D-Glc ,<5 Chemické složení rostlinné BS - hemicelulóz Hemicelulózy (cca 15-20 % sušiny) jsou heterogenní skupinou rozvětvených polysacharidu složených z lineárního hlavního řetězce (3-1,4- vázaného homopolymeru cukru (např. glukózy), na nějž se váží krátké postranní řetězce jiných cukrů (např. xylóza, galaktóza, fukóza). Hemicelulózy zahrnují: ► xyloglukany ► arabi noxy lany Hlavní řetězec hemicelulóz se pevně, ale nekovalentně váže na povrch každého celulózového mikrovlákna, čímž je propojuje vodíkovými vazbami. Parciální struktury hlavních hemicelulóz: Hi. (C) Glucuronoarabinoxylan (GAX) Ferulic och3 acid ester .oh ŕ ° v / w ""JÍL ""fV^oh (1,4)p-D-Xyl-(1,4)p-D-Xyl-(1,4)p-D-Xyl-(1,4)p-D-Xyl-(1,4)p-D-Xyl-(1,4)p-D-Xyl (D) Glucomannan HOCH; HO HOCH; "'O* HO- HO-^^ HOCHj ] HO^k HOCH; hoch; ho-^^ i— o-ch; HOCH; ^n' —4)(i-D-Glc-(1,4)|5"D-Glc-(1,4)p-D-Glc-(1,4)p-D-Qlc-(1,4)p-D-Man-(1,4)|i-D-Man-(1,4)|3-D-Man-(1,4)p-D-Man-(1,4)p-D-Man-(1^ Chemické složení rostlinné BS - pektiny Pektiny (cca 35 % DW) jsou heterogenní skupinou molekul, které obsahují hlavní řetězec z mnoha a-1,4-vázaných zbytků kyseliny galakturonové (GalA),\\ např. Rhamnogalakturonan I a II. (A) ^ L-Aceric acid ( ) Galacturonic acid Q Borate ^2) D'Apiose Q Glucuronic acid £ D-Dha ^2) L-Arabinose O Kdo L-Fucose (^) L-Rhamnose (3 D-Gaiactose L-G a lactose (3 D-Xylose • Acetyl group # Methyl group Rhamnogalacturonan I (RG !) Homogalacturonan (HG) Rhamnogalacturonan II (RG II) Nevětvené homopolymery GalA jsou aniontové (negativně nabité) a snadno váží Ca2+za vzniku tuhého gelu s texturou želé Uelly). Pektiny se váží na celu lóžové mikrofibrily esterovými vazbami a navzájem se váží pomocí vápníkových můstků nebo glykosidických vazeb. (B) Ionic bonding of pectin network by calcium 0"=C 1 0H \ / I H07 / HO^ / / 0 f \ 0 HO j C=0 HO / 0" Chemické složení rostlinné BS - proteiny Proteiny (5-10 % DW), z nichž mnohé jsou glykoproteiny a mají vysoký podíl navázaných cukrů (např. arabinogalaktan). Nejznámějším proteinem je extensin (žádný vztah k buněčné extenzi!), který může být vyžadován jako lešení pro pektiny. ► Asi 30 % aminokyselin extensinu a příbuzných proteinů je hydroxyprolin, jeho hydroxylová skupina, stejně jako ty v serinu a threoninu, může být glykosylována v Golgiho aparátu za vzniku glykoproteinů. BS také obsahuje mnoho nestrukturálních proteinů: glykosidázy (budování a restrukturalizace BS) metylesterázy pektinu (transformace methyl esterifikovaných pektinů na aniontové pektiny) ► expansiny (cell wall loosening) ► yieldiny proteiny podílející se na interakci s plazmatickou membránou... Syntéza - depozice - montáž - modifikace jednotlivých polymerů BS ► Existují stovky enzymů, které se podílejí na modifikaci polymerů BS ► Carbohydrate-Active enZYmes Database (www.cazy.0r5) ► Např.: působením xyloglukan endotransglukosylázy (XET) dojde nejdříve k rozštěpení a pak spojení xyloglukanových polymerů do nových konfigurací: BS je extrémně složitá „makromolekula" zapojená do sběru informací, jejíž aktivita se mění s uspořádáním monomerů.... BS liší se od buňky k buňce, z jedné strany buňky na druhou a mění se během vývoje a vlivem prostředí. Donor xyloglucan GCOCQOOOOOOOOOOOO Xyloglucan endotra nsg lucosylase (XET) Step 1 ooooooocj^) Xyloglucan-enzyme complex OOOOOOOOO Leaving group oooocccoo Acceptor xyloglucan Step 2 OOOOOOOOOOOOOOOOO Hybrid product Biogeneze buněčné stěny ► Endomembránový systém je zásadní při syntéze a dodávání komponent BS. ► Matricové polymery (hemicelulóza a pektiny) jsou syntetizovány v Golgiho aparátu (GA) a vylučovány vezikulami (sekreční dráhou). ► Mnoho enzymů (100-1000) potřebných pro syntézu hemicelulózy je v GA) ► Proteiny, které tvoří centra syntetizující celulózu, procházejí GA. Proteiny BS jsou syntetizovány na ribozomech, po navázání SRP (signál recognision particle) vstupují do sekreční dráhy a postupují přes ER, do GA, (proteiny jsou glykosylovány), sekrečních vezikul a do BS. Konečné sestavení BS probíhá v samotné BS, kde jsou přítomny potřebné enzymy. Cellulose Major hemicelluloses Xyloglucan Arabinoxylan Major pectin domains Rhamnogalacturonan I Homogalacturonan Arabinan Rhamnogalacturonan II Borate ester link f * * * ~ _ Mikrotubuly orientují depozici BS ► Většina dat dává přednost jedné hypotéze, že mikrotubuly řídí komplex celulóz-syntézy a orientují mikrofibrily, protože orientace mikrotubulů je paralelní s orientací celulózových mikrofibril. Obrázky CESA a mikrotubulů naznačují, ze mikrotubuly řídí trajektorii pohybu CESA v plasmatické membráně.] _L h- V Další důkazy: ► Narušení kortikálních mikrotubulů má za následek dramatický nárůst radiální expanze buněk a současné snížení prodloužení (viz. oryzalin). ► Činidla, která inhibují polymeraci nebo organizaci mikrotubulů, ovlivňují také orientaci mikrofibrilů. Control (no drug (A) treatment) 1 (j/W Oryzalin Orientovaná depozice BS řídí rust rostlinnýc ► Orientace mikrotubulů je paralelní s orientací celulózových mikrofibril. cellulose microfibril being added to preexisting wall connector protein microtubule attached to plasma membrane 0.1 urn Orientace nově uložených celulózových mikrofibril ovlivňuje směr buněčné expanze: ► Náhodně orientované (izotropní růst) např. meristémy. ► Příčná orientace má za následek podélnou expanzi buněk (anizotropní růst). (B) Transverse cellulose microfibrils "A Buněčný povrch se rozpíná různě (A) Tip growth ~ typické pro pylové láčky, kořenové vlásky Marks on cell surface Cell expansion (B) Diffuse growth ~ většina buněk v mnohobuněčných rostlinách ► "mezi (In between)" ~ např. interdigitální buněčný růst pavement cells (Arabidopsis leaf epidermis) ► laloky a zářezy jsou regulovány ROP (Rho-like from plants) GTPázami a jejich aktivačními proteiny (RIC), které organizují cytoskeleton. Biomechanické vlastnosti BS BS jako hydratovaný polymerní materiál má viskoelastické vlastnosti (mezi pevnou látkou a kapalinou). Jeho pevnost může být kvantifikována modulem pružnosti a pevností v ta ► Pevnost v tahu je množství napětí potřebného k přetržení materiálu 1 ► Pevnost v tahu umožňuje rostlinným buňkám vyvinout turgorový tlak. \ 1 Stresová relaxace BS umožňuje snížit turgor a vodní potenciál a absorbovať více vody pro expanzi buněk... Length (strain) v; B elastic elastic i plastic CW STRAINS scoelastic/plastic viscoelastic Force (stress) JL Rozvolnění BS (CW loosening) má za následek relaxaci tahového napětí, což vede k expanzi buněk. Elastická deformace (vratná) J^B Plastická deformace evratné ^ prodloužení) Lokalizace expansinů do BS Promoter EXPA AtEXPA pEXPU: :EXP14:mCherry ■ v. 1 pEXP f 0: :EXP f O.mCherry Expansiny a „teorie kyselého růstu" "Acid growth theory" říká, že prodlužování rostlinných buněk je podporováno auxinem stimulovanou acidifikací BS (Cleland, 1971; Hager et al., 1971\» ► Cílem jsou H+-ATPázy v plazmatické membráně, které vylučují protony H+ do BS. EXPANSINy jsou aktivovány sníženým pH apoplastu (McQueen-Mason et al., 1992). ► V Arabidopsis je 36 expansinů, dělí se na dvě hlavní rodiny a- (EXPA) a (3- (EXPAB). EXPANSINy nemají hydrolytickou ani jinou enzymatickou aktivitu: narušují nekovalentní vazby mezi polysacharidy BS, čímž rozvolňují BS a umožňují prokluz celulózových mikrofibril a asociovaných polysacharidu (xyloglukanů). Crosslinking gtycan (e.g. xyloglucan) Wall-loosening enzyme CeílLilose Cellulose microfibrils Extenze izolovaných BS indukovaná nízkým ► Měřeno v extenziometru (prof. Daniel Cosgrove) ► Vzorek BS z teplem usmrcených buněk se upne v přístroji a napne. ► Extenziometr měří délku pomocí elektronického převodníku. Etiolated cucumber seedling Freeze, thaw, abrade Excise growing region Inactivate with heat Apply protein to wall Homogenize. Collect and wash walls. Extract walls to solubilize the protein expansin. (B) Heat-inactivated stem Wall specimen Electronic transducer measures extension 20 01 10 c 0 Expansin : v added -pH4.5 \ bL^fer^J, Control i Constant force 30 60 Time (min) 90 ► Při nízkém pH se BS nevratně prodluží (it creeps). ► "Creep" označuje časově závislé nevratné prodloužení.. Jak rostou rostlinné buňky? Zásadní role polymerů BS BS je pevná, aby odolala turgoru, a přesto flexibilní, aby umožnila nevratnou expanzi. (A) Model tethered-network navrhuje, že xyloglukany se ve velké míře váží na celulózové povrchy a tvoří příčné můstky, které paralelní mikrofibrily spojují dohromady. (B) Nový alternativní model naznačuje, že xyloglukan není nosným a extenze BS a mechanika jsou řízeny na omezených biomechanických "hot spots" Xyloglucan ■ Microfibril (b) Bíomechankal "hot spot" Biomechanický "not spot" je oblast, kde se celulózové mikrofibrily dostávají do těsného kontaktu s pomocí zachyceného xyloglukanu (červené šipky). Struktura sekundární BS ► Hierarchická struktura sestavená zevnitř PBS ► Strukturální zesilující role ► Často vysoce lignifikovaná ► Celulózu sekundární BS syntetizují 3 CESA komplexy, ale liší se od PBS! Hemicelulózy sekundární BS majíxylanové a (gluko-) mannanové hlavní řetězce s několika substitucemi (postranní řetězce) ► různé vlastnosti BS (rozpustnost, vazba celulózy) Různá orientace celulózy v každé vrstvě (S1-S3....) S2 y Secondary wall Primary wall Middle lamella Funkce sekundární BS ► Buňky sekundární BS jsou ve zralosti často mrtvé, např. tracheidy, xylémové cévy, vlákna v drevnatých pletivech, ► interfascikulární vlákna floemu, kamenné a epidermální buňky (vlákna bavil Collenchyma cell thickening of PCW in the cornes. MÍ VIJ ; A Annular Tracheary elements of Zinnia elegans. Lignifikace sekundární BS ► Transformuje sekundární BS na hydrofobní strukturu odolnou proti dekonstrukci (tlaku). Lignifikace začíná během tvorby sekundární BS a může pokračovat i po buněčné smrti metabolickými příspěvky sousedních živých buněk. ► Monolignoly jsou hlavními stavebními kameny ligninu ► H, G, S jednotky ligninového polymeru se liší počtem methoxy-substituentů ve fenolovém kruhu. (B) OH MeO^/L.OMe HO^"y^ OH O - p-O-4, p-ether - p-p, resinol - 8-5. phenylcoumaran - S-O-4, biphenyl ether - Cinnamyl alcohol endgroup 5 Syringyl G Guaiacyl ^ OH HO-\^ OMe MeO p-Coumaryl alcohol H3CO Coniferyl alcohol p-Hydroxyphenyl (H) units (minor amounts) Guaiacyl (G) units H3CO OH Syringyl (S) units OCH3 Sinapyl alcohol Tvorba ligninu zahrnuje spojení monolignolů v BS zprostředkované oxidačními radikály, katalyzované peroxidázami a lakázami, za vzniku náhodného ligninového polymeru^ O HO OMe OH s r g r OMe 0^oh HOsA^ OMe Ä" MeO^j^OMe Ox HO OH Permeabilita BS ► BS není pouze pevná a amorfní, ale obsahuje četné vodné póry: ► funguje jako síto, přes které mohou voda a polární molekuly snadno difundovl když je BS hydratovaná (její propustnost je typicky větší než u PM). ! ► Průměrná velikost pórů cca 5-10 nm, liší se od buňky k buňce a během vývoje. ► Dehydratovaná BS omezuje pohyb vody; odpařování je hnací silou pohybul Soil solution Epidermis Cortex Endodermis Xylem parenchyma Xylem tracheary elements Pathway along apoplast Casparian strip, Endodermal cell Pathway through symplast L Organizace kořenových pletj| (Arabidopsis thaliana) Zvláštní lignifikace probíhá v Caspariho proužku ► Caspariho proužek (Casparian strip) je prstenovitá modifikace BS cévních rostlin. ► V kořenové endodermis tvoří hydrofobní bariéru mezi stéle a kůrou. ► Selekce živin, ochrana před patogeny... ► Obsahuje suberin, ale také lignin! ► CASP1 klíčový protein, řídící syntézu NADPH oxidáza vytváří H202 peroxidázi ► ESB1 (Enhanced Suberin 1) je nezbytný pro správnou lignifikaci v úzké oblasti. ► Člen rodiny DIRIGENT proteinů s dirigentní doménou, která může řídit stereochemii. (A) Cell wall Cytoplasm Plasma membrane \ • Casparian strip membrane domain (B) CC) Casparian strip l— CASP1 Ť Monolignol NADPH oxidase (j ) Monolignol transporter © ESB1 1 i Peroxidase Lignin Syntéza kalózy (callose) a Ca2+ signalizace Integrita PM je důležitá pro syntézu celulózy: ► udržuje nízkou koncentraci Ca2+v cytosolu, která je nezbytná pro syntézu celulózy. Zvýšení koncentrace Ca2+ inhibujte syntézu celulózy a stimulujte syntézu kalózy (p-1,3 glukan). ► Koncentrace Ca2+ funguje jako součást signálního řetězce, signalizující útok, buňka se může odizolovat od zbytku rostliny kalózou Tvorba kalózy při poranění rostliny (Ca2+ funguje jako secondary messanger). Ukládání kalózy kolem plasmodesmat může být také důležité pro oddělení jedné buňky od druhé. Genetické důkazy naznačují, že kalózová syntáza (Glucan Synthase-Like gene, GLS) a celulózová syntáza pocházejí z nezávislých genů: ► horizontální přenos genů syntetizujících celulózu z eubakterií do jádra eukaryotických rostlinných buněk v evoluci suchozemských rostlin. endoplasmic reticulum plasma membrane 4 \Při inkompatibilní reakci je růst pylových láček\ zastaven a současně dochází k bobtnání špiček \ pylových láček a tvorbě kalózových zátek (barvení anilinovou modří, anilline blue)