Biologie rostlinné buňky 8. Mitochondrie a peroxizómy ► Objev mitochondrií a jejich funkce ► Struktura mitochondrií ► Izolace mitochondrií ► Složení mitochondrií ► Respirační procesy rostlin ► Bioenergetika respirace v mitochondriích ► Citrátový (Krebsův) cyklus ► Elektronový transportní řetěz a syntéza ATP l ► Genetický systém mitochondrií I ► Transport proteinů do mitochondrií B ► Biogeneze mitochondrií B ► Peroxizómy jsou muItifunkční organely ► Objev, vznik, složení, typy v rostlinách, funkce ► Olejová tělíska Fotosyntéza a respirace jsou komplementární procesy v živém světě PHOTOSYNTHESIS C02 + H20 02 + SUGARS CELLULAR RESPIRATION SUGARS + 02-+ H20 + C02 H20- o2 co2 aJ PLANTS T ALGAE 1 SOME BACTERIA ENERGY OF SUNLIGHT SUGARS AND OTHER ORGANIC MOLECULES co2 I J MOST LIVING ORGANISMS USEFUL CHEMICAL-BOND ENERGY Objev mitochondrií a jejich funkce Robert Boyle v roce 1662 na základě svých experimentů dospěl k závěru že vzduch je nezbytný pro dýchání, aby zvířata přežila... ► Stephen Hales (1727) navrhl, že vzduch může být důležitý i pro rostliny; po jejich spálení dospěl k zjištění, že se skládají ze vzduchu... ► Antoine Lavoisier (1789), zakladatel moderní chemie, věřil, že dýchání a spalování jsou analogické reakce, které potřebují 02 a kalorické (spotřebují C, H) k výrobě C02 a H20 a generování tepla - hlavní účel Na konci 19. století bylo jasné, že dýchání probíhá v každé buňce! strukturální studie mitochondrií začaly v mnoha typech buněk 1899, cytoplazmatické vláknité granule s názvem „mitochondrie' ► m/ŕos z Řečtiny, znamená vlákno (threa ► chondrin z Řečtiny, znamená malé zrnko (a small grain) často mylně považovány za artefakt preparace, nikoli za skutečnou organelu. Kingbury (1912) navrhl, že mitochondrie ^Jg^J^ggg byla dýchacím centrem buňky "Elementary organisms" v buňkách slizu žaludku kočky fixované směsí osmia Altmann, R., 1890. schopnost mitochondrií oxidovat a redukovat různá barviva Struktura mitochondrií ► Studie z elektronového mikroskopu ukázaly, že mitochondrie membránou uzavřené organely; ultrastrukturu mitochondrií i živočichů a prvoků popsal George Palade v 1950 letech. Struktura mitochondrií ► U živočichů: (A) 3D ► U rostlin: (B) elektronová tomografický snímek mikrofotografie 0.5 |jm 0.5 |jm Struktura mitochondrií Krátká, bakterii podobná tělíska o průměru 1-3 um ► Velmi dynamická (pohyblivá) a plastická (neustále měnící tvar, dělení a fúze) Umístění H+-ATPáz zapojených do syntézy ATP na vnitřní membráně ntermembrane space Outer membrane Inner membrane Intermembrane space Outer membrane Inner membrane Matrix Cristae 1 urn Izolace mitochondrií Pletivo se homogenizuje, přefiltruje a centrifuguje při nízké rychlosti (10 000g/2( min) a poté při 75 -100 000 g/ 2-4h v hustotním gradientu. Po obarvení se kontroluje neporušenost a čistota světelným mikroskopem. Pomocí laserové pinzety (laser tweezers) lze izolovat jednu mitochondrií. ■ ► Mitochondrie v živých buňkách lze snadno pozorovat pomocí vitálních fluorescenčních barviv (např. Rhodamin 123 a MitoTracker) a GFP • * * • • CFP Golgí \. GFP mitochondria YFP ER merge - Movie - Alberts 14-1 Plant Phys 12.3 Web ei,sa^ Složení mitochondrií Proteomická analýza ukazuje přítomnost 3 000 proteinů souvisejících s respirací ► Vnější membrána ~ 7 % a vnitřní membrána ~ 30 % celkových proteinů Fosfolipidy tvoří až 90 % celkových mitochondriálních lipidů ► ► Vysoká koncentrace fosfatidylcholinu (PC), fosfatidylethanolaminu (PE) a také difosfatidylglycerolu (DPG = kardiolipin, lipid endemický pro mitochondrie) ► kardiolipin se také nachází v PM bakterií (což podporuje hypotézu, že mitochondrie se vyvinuly z bakterií), přítomný pouze ve vnitřní membráně Lipidové složení vnitřní a vnější membrány je odlišné: ► např. vnější membrána více nasycených lipidů; vnitřní více PE a méně PC ► fosfolipidy rostlinných mitochondrií jsou mnohem méně nasycené než ty ze savčích mitochondrií (existují a fungují při 37°C). Mitochondrie zaujímají až 20% cytoplazmatického objemu eukaryotické buňky. ► Typicky stovky až tisíce mitochondrií v rostlinné buňce, ne náhodně uspořádané; např. v listech vedle peroxisomů a chloroplastů; u rostoucícrj^ pylových láček obohacené na špičce; seskupené kolem jádra CYTOSOL Respirační procesy rostlin PLASTID Storage, phloem transport Aerobní respirace > je biologický proces, při' kterém jsou redukované organické sloučeniny nzene oxidovány a uvolněna energie je přechodně uložena v ATP. ► Citrátový (Krebsův) cyklus ► Oxidatívni fosforylace ► Glykolýza (cytosol) !► Oxidative Pentoso-fosfátová dráha (cytosol a plastidy) Pentose phosphate pathway Lipid breakdown GLYOXYSOMES Bioenergetika respirace v mitochondriíc Citrátový cyklus v matrici mitochondrií produkuje NADH a FADH2 Krysty vnitřní membrány obsahují mechanismus elektronového transportu a syntézy ATP C12H22O11+ 1202^ 12C02 + 11H20 Maximální výtěžnost ATP v cytosolu z úplné oxidace molekuly sacharózy na C02 prostřednictvím aerobní glykolýzy a citrátového cyklu je 60 molekul ATP. FOOD MOLECULES FROM CYTOSOL r fatty acids pyruvate - CO; inner mitochondrial membrane outer mitochondria! membrane Citrátový cyklus v rostlinách Malic enzyme can decarboxylate malate to pyruvate. In combination with malate dehydrogenase, this enables plant mitochondria to oxidize malate to C02. 0 II O CH, —C — c 3 \ OH Pyruvate ► ► Jedinečné vlastnosti: Malátový (jablečný) enzym malate + NAD+-> pyruvate + C02 + NADH Succinate dehydrogenase Isocitrate dehydrogenase ATP Succinyl-CoA synthetase v^DP One molecule of ATP is synthesized by a substrate-leve phosphorylation during the reaction catalyzed by succinyl-CoA synthetase. 2-Oxoglutarate dehydrogenase Jablečný enzym a PEP karboxyláza poskytují rostlinám metabolickou flexibilitu ► Malic enzyme (A) 1 Pyruvate 1 Oxaloacetate 1 Citrate ^ 2 Malaie T From cytosol: 1 Ma I ate 1 Isocitrate ~7~ ■IB) 1 Pyruvate From cytosol: [ 1 Qxaloacetate 1 Citrate > T lk.J-i1 2 Malate T Citrate 2 Isocitrate 7 ► přeměňuje malát na pyruvát a umožňuje mitochondriím oxidovat malát (A) a ci (B) na C02 bez pyruvátu z glykolýzy PEP carboxylases ► přeměňuje glykolytický PEP na 2-—exoglutarát používaný pro asimilaci di to Nitrogen assimilation Organizace elektronového transportního řetězce a syntéza ATP na vnitřní membráně mitochondrií cytosol pH 7 5 INTERMEMBRANE SPACE External rotenone-insensitive NAD(P)H dehydrogenases can accept electrons directly from NADH or NADPH produced in the cytosol. The ubiquinone (UQ) pool diffuses freely within the inner membrane and serves to transfer electrons from the dehydrogenases to either complex III or the alternative oxidase. Cytochrome c is a peripheral protein that transfers electrons from complex III to complex IV. Uncoupling protein (UCP) transports H+ directly through the membrane. NADH Complex I NADH dehydrogenase MATRIX P H 8 Complex II Succinate dehydrogenase Internal rotenone-insensitive NAD(P)H dehydrogenases exist on the matrix side of the membrane. Alternative oxidase (AOX) accepts electrons directly from ubiquinone. Complex V ATP synthase ► ► Mitochondriální e' transport a syntéza ATP ► Elektronový transportní řetězec katalyzuje tok e" z NADH a FADH2 na 02\\ Spřažen s enzymovými komplexy a transportem H+ přes vnitřní mitoch. Membránu Generování elektrochemického gradientu pro syntézu a export ATP ► Protonové (A) h* h* 0 [ h' h+ (B) F0 rotor ~X ring centra stator (O CRISTA SPACE MATRIX peripheral stalk ATPase stator pumpy, ATPazy F-typu, jsou starobylého původu \ 3D struktura F1Fo ATP-syntázy\ (určena rentgenovou krystalografií) Sá skládá z Fo části v membráně aL velké katalytické hlavy F1 v matici. Nefosforylující e' transport snižuje rekuperaci energii ► Elektronový transportní řetězec má doplňkové větve: \^^| ► NAD(P)H dehydrogenáza a alternativní oxidáza (nenachází se u zvířat) ► Vázaný na vnitřní membrány, nepumpují protony, proto se uvolněná energie neuchovává jako ATP, ale uniká ve formě tepla... (P336 piant PhyS) NADH dehydrogenase NADH + H+ NAD+ Alternative oxidase 02 H20 Inner mitochondrial membrane Di-iron center Intermembrane space Shrnutí Sucrose Nucleic acids ADP ATP NAD NADP -<- FMN CoA Cytokinins Nucleotides 4- Pentose phosphate Pentose phosphate pathway -Hexose phosphate- Glycolysis Alkaloids Flavonoids Lignin Indoleacetic acid (auxin) Tryptophan <- Tyrosine <- Phenylalanine Erythrose 4-phosphate - , Glyceraldehyde 3-phosphate — Shikimic acid -<- Proteins Alanine Aspartate — ► Citraťový cyklus, glykolýza a pentózo-fosfátová dráha vy tvářejí prekurzory pro mnoho biosyntetických drah. Při glykolýze se sacharidy z různých zdrojů přeměňují v cytosolu na pyruvát, ATP (prostřednictvím substrátové fosforylace pomocí kinázy) a NADH. Oxidační pentózo-fosfátová dráha: oxidace 6C (glukóza-6-fosfátu) na 5C (ribulóza-5-fosfát). ► stavební bloky pro biosyntézu (např. nukleové kyseliny) a reduktant NADPH (ne NADH!) Phosphoenol pyruvate Pyruvate Citric * acid Acetyl-CoA cycle Oxaloacetate Citrate Malaie jciti J Isocitrate Fumarate 2-Oxoglutarate Succinate Chlorophylls Phycocyanins Phytochrome Cytochrome Catalase Cellulose D i hyd roxyaceton e phosphate Glycerol 3-phosphate Lipids and related substances ► Fatty acids Gibberellins Carotenoids Sterols Abscisic acid Proteins Glutamate Other amino acids Genetický systém mitochondrií ► ► ► ► ► ► Mitochondrie, obsahují kompletní genetický systém včetně DNA, enzymu pro syntj DNA, ribozomů (70S), rRNA, tRNA a proteinů. 1 Typicky 5-10 molekul DNA (kruhové nebo lineární) v mitoch. Matrix. ► např. DNA játrovky (Marchantia) 150-2500 kbp (10-100x větší než živočišná mitoch. DNA) U některých rostlin se génom organizoval do kruhových „chromozomů". ► mitochondriální DNA asociovaná s proteiny podobnými histonům Tendence mitoch. genů časem se přesunout do jádra např. coxll (Cytochrom oxdidase) Inhibován stejnými antibiotiky, která inhibují růst bakterií (e.g chloramphenicol, Tet) Cytoplazmatická dědičnost mitoch. DNA. Syntetizované proteiny závisí na rostlinném orgánu ► genová exprese je regulována vývojem Některé mitoch. DNA mají introny! Většina mitoch. proteinů ► kódované jadernou DNA, ► syntetizované na cytoplazmatických ribozomech, trk ► importovány prostřednictvím translokonů dovnitř DARkfDNA sepcif.) barvení kořenového QC ^Vělké šipky mitochondrie, malé plastidy Transport proteinů do mitochondrií ► Záleží na targetující doméně (presequence) a importním aparátu B Outer membrane Intermembrane space Inner membrane Matrix © © © Biogeneze mitochondrií ► Mitochondrie se se rozmnožují dělením ► Před rozdělením se kulovitá mitochondrie prodlouží, zaškrtí a nakonec se oddělí. ► Studie mitoch. exprimujících FP (GFP, RFP) ukazují, že mitochondrie mohou také fúzovat! Ärabícl&pfô epidermis mtOFP bar 1um frames 2s Mitochondrie jsou sice semiautonomní, ale jejich aktivity a počty musí být koordinovány s aktivitami zbytku buňky. Proteiny kódované jadernými geny vstupují do speciálních oblastí, nazývaných kontaktní místa, kde se vnitřní a vnější membrány dotýkají = translokační A komplexy ► Pro translokaci proteinu do mitochondrií postačuje sekvence 12 aa na N-konci proteinu. ► Mitochondriální tranzitní peptid se váže na receptor v kontaktním místě a následně je sekvence štěpena mitochondriální signální peptidázou. ► Je vyžadován membránový potenciál přes vnitřní membránu a hydrolýza ATP. Objev peroxizómů ► Poprvé pozorovány elektronovou mikroskopií v letech 1950 ► pojmenovaná mikrotělíska (microbodies) 0,2-1,5 \xm (příliš obecné ► po objevení jejich funkce přejmenovány na peroxizómy ► také známé jako cytosomes, phragmosomes, spherosomes, glyoxysomes ,■ : ••• r*S m er mb • V Mikrotělíska (mb) v cytoplazmě jaterních buněk krysy, er, ergastoplasm; m, mito-choondrie. Z RouiHer a Bernhard, 1956. Peroxizóm vedle lipidového tělíska (L, lipid body) v buňce děložního listu rajčete. Všimněte p^jak peroxizóm nalevo uzavírá mitochorídrii. Evoluce peroxizómů ► Peroxizómy jsou přítomny ve všech eukaryotech kromě Archaezoa. ► Peroxizómy se mohly vyvinout endosymbioticky. ► Alternativně podobně jako ER, se mohly vyvinout invaginací oblastí membrán, které obsahovaly enzymy zapojené do peroxizomálních drah. ► Původně se myslelo, že peroxizómy byly vytvořeny přímo z ER procesem pučení (viditelné na 2D obrázcích), ale postrádají proteiny ER. Sériové řezy buněk ukazují, že peroxizómy skutečně existují jako "peroxisomal reticulum" ale zdánivé vazby na ER jsou propojení mezi samotnými peroxizómy (peroxules)... 3D rekonstrukce peroxizómů z mazových žláz myší ► Mezi funkcemi peroxizómů a mitochondrií existují podobnosti. i ► Obecně se zdá, že mitochondrie převzaly funkce peroxizómů, ale v některých případech je to naopak! (v průběhu evoluce) ► Morfologická i biochemická diverzita peroxizómů v různých druzích Peroxizómy jsou samoreprodukující se organ ► K růstu peroxizómů dochází inkorporací nového proteinu a lipidu do již existujících peroxizómů a jejich počet se zvyšuje štěpením (by fission). Pex19 specific proteins that catalyze protein import peroxisomal precursor vesicle peroxisomal precursor proteins endoplasmic reticulum GROWTH BY UPTAKE OF SPECIFIC PEROXISOMAL PROTEINS AND LIPIDS FROM CYTOSOL daughter peroxisomes Peroxizomální targetující sekvence (importní signál) je typicky SKL (serine-lysine-leucine) na C-konci matričních proteinů nebo arg-leu/gln/ile-X5-his-leu na N-konci. Zajímavé je, že některé pqlypeptidy neobsahují targetující sekvence, jsou přeneseny do peroxizómů jako oligomery (což naznačuje, že proteiny-translokující póry jsou relativné velké). ► Jiné vstupují do peroxizómů nepřímo prostřednictvím specializovaných vezikul odvozených z ER (posttranslačně vložených do ER). ► ► ► Peroxizómy jsou multifunkční organely ► Obklopeny pouze jedinou membránou, neobsahují DNA ani ribozomy, ► všechny jejich proteiny jsou kódovány v buněčném jádře. ► Obsahují asi 100 proteinů, vysoký obsah fosfolipidů (složení podobné ER a PM) ► Specializují se na provádění oxidačních reakcí pomocí 02 a H202 ► Téměř všechny obsahují katalázu a různé oxidázy (v závislosti na jejich funkci) ► Oxidázy provádějí oxidační reakce pomocí kyslíku za vzniku peroxidu vodíku, který využívají pro oxidační účely: RH2 + 02 —► R + H202 ► Catalázy využívají generovaný H202 k oxidaci řady dalších substrátů a také ke zničení jeho přebytku: 2H202 —► 2H20 + 02 Účastní se rozmanitého souboru biochemických reakcí včetně: ► p-oxidace mastných kyselin, glyoxylátový cyklus St fotorespirace ► Respirace na bázi H202, počáteční reakce v biosyntéze ether-glycerolipidů, syntéza cholesterolu a dolicholu, glyoxylátový cyklus, syntéza kyseliny jasmonové, oxidace alkoholu, transaminace,^É katabolismus purinů a polyaminů, syntéza oxidu dusnatého, biosyntéza antibiotiky houbách... Důkaz spolupráce různých organel při realizaci biochemických drah. Pohybují se uvnitř buněk (podél mikrofilament) na místa, kde jsou třeba... Peroxisomy odumírají v důsledku poškození H202 a v době omezení živin. Jsou ztráveny v procesu hromadné recyklace známém jako pexophagy. Dva typy peroxizómů v rostlinných buňkách ► Jeden typ je přítomen v listech, kde se účastní fotorespirace. ► Druhý typ je přítomen v klíčících semenech, kde přeměňuje mastné kyseliny uložené v lipidech semen na cukry potřebné pro růst mladé rostliny. ► Protože tato přeměna tuků na cukry je prováděna reakcemi známými jak( glyoxylátový cyklus, tyto peroxizómy se také nazývají glyoxyzóm^ ► první glyoxyzómy izolovány z fazolí (castor beans) Vztah mezi peroxizómy a glyoxyzómy ► Původně se předpokládalo, že existují 2 samostatné populace mikrotělísek, nicméně glyoxyzómy se během vývoje mění na peroxizómy, během zelenání děložních lístků: ► Na začátku klíčení přeměňují glyoxyzómy tuk na sacharidy prostřednictvím p-oxidace a glyoxylátového cyklu. ► Po zezelenání děložních listů vytvářejí sacharidy prostřednictvím fotosyntézy a peroxizómy využívají fotorespirační dráhu anti-SGAT • Cell of a 4-day-old cucumber cotyled stained with 20-nm colloidal gold particles conjugated to an antibody directed against isocitrate lyase ICL (large arrowhead) and 10-nm against serine:glyoxylate aminotransferase SGAT (small arrowhead). \ ICL glyoxysomal enzymes A SGAT peroxisomal enzymes ía alvc Je zajímavé, že během stárnutí listů se peroxizómy transformují zpět na glyoxyzómy: pojmenované gerontozómy odpovědné za recyklaci mastných acylových řetězců v buňkách listu zpět do rostliny v translokovatelné formě (tj. cukry). Přeměna tuků na cukry během klíčení semen, která ukládají tuky. Redukovaný C generovaný během rozkladu lipidů v glyoxysomu je v cytosolu přeměněn na sacharidy pomocí procesu gluko- ineogeneze. Fatty acids are metabolized by p-oxidation to acetyl-CoA in the glyoxysome. Ma late is transported into the cytosol and oxidized to oxaloacetate, which is converted to phosphoenol pyruvate by the enzyme PEP carboxykinase. The resulting PEP is then metabolized to produce sucrose via the gluconeogenic pathway p-oxidace mastných kyselin ► podílí se na tvorbě sacharózy z mastných acylových řetězců a je velmi důležitá při klíčení semen a spor bohatých na olej Peroxizómy v tukových buňkách obsahují lipázy, které štěpí uložené lipidy na jejich konstitutivní mastné acylové řetězce. Mastný acyl-CoA vstupuje do peroxizómů prostřednictvím transportního proteinu ABC (ATP-binding cassette). ► Mastné acylové řetězce pak podléhají p-oxidaci, sérii reakcí, které vedou k rozpadu dlouhých mastných acylových řetězců na mnoho acetyl-CoA molekul (zapojených do aktivace a přenosu acetátových skupin mezi molekulami). ► Acetyl-CoA pro cyklus kyseliny glyoxylové ► Enzymy zapojené do p-oxidace zahrnují mastnou acyl-CoA syntetázu a mastnou acyl-CoA oxidázu (generuje peroxid vodíku). FIGURE8.66 p-OxtdatlonpathwayInperoxisomes, m each pass through the sequence, one acetyl residue Is removed tn the form of acetyl CoA from the carboxyl end of an acylCoA Seven passes through the cyck are required to oxtdtze a C Jany acid to eight molecules of ecttyl-CoA. :-:— CH;ll; — CH;—CH2 — C—S—CoA C,e3cyl-CoA Acyt-COA wIOj s* M,0 :Hj—(CHjttt—1—c—c —s—' Enoyl-CoA tiydrjtjw OH I II H O CoA fran*-A>-EiK>yt-coA >l3-(CHj)tj-A-CH;-C-S-CoA L -(i-Hydroxyacyt-CoA xHydroryacyl-CoA ^- detiydrogenase CH,— ICH,),,— C —CM, — C—S—CoA p-Ketoacyl-CoA II II O o Acyl-CoA jcetyřtransfef C: MjO V-* CHj — C—S—COA Acetyl-CoA O CH3-NC3-!CHj :.-CM; — CH, — C-5-CoA CMacy1-CoA o CH, — c—S—CoA Acetyl-CoA Acetyl-CoA AcetyvcoA Acetyt-CoA Acetyt-COA Acetyt-COA Acetyl-CoA Olejová tělíska existují v rostlinách kromě peroxisomů ► Olejová tělíska (oil bodies) jsou organely ukládající lipidy (triglyceridy). ► Vznikají jako oblasti diferenciace v rámci ER. ► Obsahují vnější membránu fosfolipidů a speciálních proteinů: