Masarykova univerzita Přírodovědecká fakulta Laboratorní cvičení z molekulární biologie Vyučující: Mgr. Lucie Kuntová, Ph.D. Ústav experimentální biologie Harmonogram výuky čtvrtek 13:00 – 16:50 D36/216 Zápočet •aktivní účast na experimentech •absolvování všech úloh (1 absence - omluvená!) •vypracování souhrnného protokolu vč. správně zodpovězených otázek Organizace praktického cvičení Bezpečnost práce při praktických cvičeních z MB •pracuje se v plášti a v přezůvkách. Na pracovních stolech jsou pouze pomůcky určené k provádění zadaných úkolů, bez potravin, nápojů apod. (pracujeme s infekčním materiálem!) • •před a po cvičení desinfikovat pracovní povrchy! • •během cvičení je zákaz kouření, konzumace poživatin, pití a rušení hlukem ostatních spolupracovníků (vypnout vyzvánění mobilu). • •je třeba dbát pokynů vyučujícího, aby nedošlo ke kontaminaci a poškození pomůcek a zařízení a znehodnocení chemikálií. 5 •při práci s žíravinami a mutageny používat rukavice • •při práci s UV zářením používat ochranné brýle/štít s UV filtrem. • •při práci s hořlavinami dbát na to, aby nedošlo k požáru a ublížení na zdraví. Po ukončení práce s kahanem zamezit úniku plynu. • •použitý materiál důsledně třídit a likvidovat dle pokynů vyučujícího. • •po ukončení pokusu uklidit pracovní stoly a pomůcky uložit do skříní v prostorách laboratoře. • •je třeba pracovat s ohledem na vlastní bezpečnost a na prevenci kontaminace pracovních pomůcek. uPoleptání oka - ihned provést výplach vodou (od vnitřního koutku k vnějšímu) a zajistit odbornou pomoc. u uPoleptání kůže - odstranit potřísněný oděv, poleptaná místa ihned omýt dlouhodobě prudkým proudem vody. Pak možno neutralizovat: u a. při poleptání kyselinou cca 5% roztokem uhličitanu sodného u b. při poleptání zásadami 3% roztokem kyseliny citronové nebo octové. u Poleptanou kůži je třeba krýt sterilním obvazem. u uPopálení - postižené místo je třeba co nejrychleji ochladit studenou vodou. Na popálenou plochu se nic neaplikuje. Po ochlazení se kryje postižená plocha sterilním obvazem. 6 První pomoc při úrazech v laboratoři uOtevřené poranění - zastavit krvácení a zabránit infekci rány. Drobné rány (pořezání sklem) omyjeme proudem vody a sterilně ošetříme. uPři nadýchání škodlivých látek - postiženého je nutno přemístit na čerstvý vzduch, uvolnit oděv a v případě potřeby zahájit dýchání z plic do plic (jen pokud dostatečně nedýchá). Může být třeba omytí očí, úst a nosu. I po úspěšném ošetření je nutno zavolat lékařskou pomoc. uPožití škodlivých látek - V tomto případě je nutno vypít cca 0,5 l vody a vyvolat zvracení. Zvracení se vyvolává do 4 hodin, pokud nebyla požita žíravina, rozpouštědlo či pěnivá látka, a postižený je při vědomí. Při požití žíraviny vypláchneme ústa a dáme postiženému malé množství vody. Je nutno zajistit lékařské ošetření. Práce v laboratoři •Jednorázové plastové pomůcky (špičky) likvidovat do plastových nádob (nebo PVC sáčků), skleněné pomůcky (kádinky a zkumavky) odložit do dekontaminačního roztoku v kbelíku. •Při práci s nastavitelnými automatickými pipetami je třeba dbát toho, aby byly nastaveny v rozmezí povolených hodnot objemů. Ke každé pipetě použít vhodnou plastovou špičku. •Některé roztoky používané pro izolace nukleových kyselin je třeba připravit čerstvé (např. 70 % ethanol) a některé je třeba uchovávat při 4 °C a těsně před a během použití je chladit, nejčastěji na ledu. •Je třeba zkontrolovat koncentraci zásobních roztoků a spočítat jejich spotřebu v pracovních postupech. • •Zásobní roztoky enzymů se uchovávají při –20 °C a při použití je třeba je mít uložené na ledu nebo v chladícím stojánku. • •Zmražené zásobní roztoky enzymů (lysozym, RNáza) se musí nejprve rozpustit v celém objemu a pak teprve provést náběr vždy novou sterilní špičkou. • •Při přípravě pracovních roztoků nemísit navzájem koncentráty, ale postupně přidávat do vodného roztoku a nakonec doplnit vodou do výsledného objemu. • • Pomůcky nezbytné na laboratorním stole •Nádobka se sterilními mikrozkumavkami a špičkami •Nádobka/sáček k odložení použitého plastového materiálu •Nádobka k odložení nespalitelných použitých pomůcek (sklo, kovové uzávěry apod.) •Těkavé tekutiny v digestoři •Zmrazené enzymy a (ATB) po rozmrazení a použití ukládat k ledu či do chladícího boxu •Rukavice použít jen v případě ohrožení kontaminací a poleptání rukou • •molární roztoky - převody 1M na 1mM •objemy 1 ml na 1 µl Fyzikální veličiny, převody jednotek a výpočty m = c × V × Mr Kolik g NaCl (Mr = 58,0) použijete na přípravu 50 ml 2 M roztoku NaCl? m = 2M × 0,05 L × 58 m = 5,8 g Navážku 5,8 g NaCl rozpustit ve vodě a doplnit vodou na výsledný objem 50 ml •objemy 1 ml na 1 µl •koncentrace (% ní w/v ) roztoky •koncentrace (% ní v/v) roztoky •směšovací pravidlo (zásobní) V1× c1 = V2 × c2 (výsledný) Kolik ml 5% roztoku NaCl použijete pro přípravu 100 ml 2 % roztoku NaCl? V1× 5 = 100 × 2 V1 = 40 ml ….doplnit do 100 ml •ředění roztoků/suspenzí (10-1; 10-2; 10-3 …….10-6) • •hodnocení kultivace: titry buněk = CFU (colony forming unit)/ml Zobrazit zdrojový obrázek 1. cvičení uIZOLACE PLAZMIDOVÉ DNA u Plasmid Dna Stock Photo - Download Image Now - iStock DNA v bakteriální buňce What are genomic DNA and plasmids? - Quora uDNA tvoří genom buněk typu prokaryotického, eukaryotického a některých virů. uIzolace závisí na výchozím materiálů (bakteriální buňky, rostlinné b., atd.) uCelogenomová DNA/ plazmidová DNA (vektory pro klonování) Izolace plazmidové DNA 1. Lyze buněk Roztok A (TEGLU): u u25mM Tris-HCl (pH 8,0) u u10mM EDTA - je inhibitor nukleáz a vychytává (váže) dvojmocné ionty Mg2+, které působí jako kofaktory nukleáz u u50mM glukóza u enzymatické ošetření Fig 1 Lysozym 2. Lyze buněk a denaturace Roztok B (lyzační): u u0,2M NaOH (zvyšuje pH směsi na 12- 12,5, nevratná denaturace LdsDNA, plazmidová CdsDNA denaturuje částečně a reverzibilně. ) u u 1% SDS (iontový detergent) dokončuje lyzi degradací membrán a účastní se odstranění proteinů (solubilizace membránových proteinů, rozrušení protein-proteinových vazeb) - není vhodné pro izolaci velkých plazmidů ! u u 3. Renaturace Roztok C (renaturace): u u5M octan draselný, pH = 5,2 uneutralizuje hydroxid, denaturovaná pDNA renaturuje, fragmentovaný bakteriální chromozom tvoří komplex s proteiny a vysráží se. 4. Odstranění proteinů Fenol:chloroform (1:1) u denaturace a odstranění proteinů. u chloroform zvyšuje hustotu směsi a usnadňuje tak tvorbu fázového rozhraní. Medical Genetics3.pptx by joy_chobits_chi on emaze 5. Odstranění lipidů a fenolu Sevageova směs u chloroform-izoamylalkohol 24:1 u odstraňuje lipidy a fenol. 6. Precipitace a purifikace DNA 3M octan sodný u sodné kationty neutralizují záporný náboj DNA => ztráta hydrofilní povahy => srážení DNA u 96% etanol u DNA je v > 70% etanolu nerozpustná, udržuje vysráženou DNA. u 70 - 75% etanol u ve zbytkové vodě se rozpustí zbytky solí 7. Rozpuštění DNA TE pufr u Tris-EDTA u 10 mM Tris-HCl (hydroxy-metyl-aminometan) u 1mM EDTA (Disodium ethylene diamine tetraacetate) u Izolace plazmidu z kmene E. coli DH5a alkalickou lyzí 26 Vektor (plazmidová DNA) Odkaz: Addgene: Vector Database - pBlueScript II SK (+)