2. cvičení •PCR amplifikace hsp60 (GroEL) •Měření čistoty a koncentrace pDNA •Štěpení pDNA pBlueScript •Štěpení pDNA pBlueScript + hsp60 (GroEL) 2. cvičení •PCR amplifikace hsp60 •Měření čistoty a koncentrace pDNA •Štěpení pDNA pBlueScript •Štěpení pDNA pBlueScript + hsp60 • Polymerázová řetězová reakce PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION) Zavedení PCR v roce 1983 (Kary Mullis). Metoda pro mnohonásobné zmnožení (amplifikaci) specifického úseku DNA in vitro založená na principu replikace DNA (enzymatické syntézy) . Replikace DNA in vivo vyžaduje mnoho enzymů Replikace DNA in vitro vyžaduje pouze jeden enzym – polymerázu Termostabilní DNA polymeráza (aktivní při až 98 °C). Taq Thermus aquaticus (5`-exonukleáza) Tth Thermus thermophilus (5`-exonukleáza) Pwo Pyrococcus woesei (3`-exonukleáza) 20 – 30 cyklů Teplota připojení primerů (annealing): Ta = 2(A+T) + 4(G+C) – 5 °C = Tm – 5 °C Tm – teplota tání (melting temperature), tzn. teplota roztoku v inflexním bodě Inflexní bod – okamžik, kdy je 50 % molekul denaturováno P4150101 1.Jako templát slouží ssDNA (z dsDNA po denaturaci) 2.Na něj nasedají primery: 3'-OH-konce směřují proti sobě. 3.Termostabilní polymeráza vytváří PCR produkt – (amplikon). 4.Nové vlákno DNA je vytvářeno z dNTP ve formě Na+ nebo Li+ solí 5.Mg2+ ionty tvoří rozpustný komplex s dNTP a vytvářejí substrát, který rozpoznává DNA polymeráza. 6. Teoreticky lze získat 2n řetězců (kopií). n = počet cyklů Polymerase Chain Reaction (PCR) - YouTube Základní výzkum •izolace genů nebo jejich částí •sekvencování DNA •mutageneze in vitro •modifikace konců DNA •selekce klonů z genových knihoven •příprava značených sond Aplikovaný genetický výzkum •prenatální diagnostika (detekce mutací v genech) •studium polymorfizmu genů •populační genetika • Využití v klinických disciplínách •detekce patogenních mikroorganizmů •identifikace onkogenů a typizace nádorů •stanovení pohlaví Využití v praxi •archeologie •soudnictví •kriminalistika Využití metod PCR Zásady při přípravě PCR směsi a detekci PCR produktů 1.Při přípravě PCR směsi nejlépe v PCR-boxu je nutno používat ochranné rukavice (zabránit kontaminaci vzorku). 2.Polymeráza musí být vždy na ledu (v chlazeném stojánku), ostatní reagencie se nechají roztát při 25°C. 3.Reagencie a obzvláště primery nabírat jen vhodnou sterilní špičkou. 4.Po použití musí být reagencie urychleně uschovány při teplotě -20°C. 5.Pipety a plasty k tomu určené jsou vyčleněny pouze pro PCR. 6.Nejprve se pipetuje do zkumavky voda, jako poslední polymeráza. 7.Používat PCR vodu, ta je sterilní a bez DNáz, následně rozpipetovaná do mikrozkumavek a uložena v mrazničce. 8.Vždy přidávat kontroly: pozitivní k. (známý templát), negativní k. (voda místo templátové DNA) 9.Pipetovat pod hladinu, vizuálně kontrolovat správný objem v pipetě. P5120837 -PCR box (místnost), určená pro PCR reakce, je pravidelně svícena UV zářením a pracovní plochy se omývají dezinfekčním prostředkem. -Zde nikdy nepracovat s templátovou DNA a PCR produkty (amplikony). -Detekce amplifikovaných sekvencí se provádí v jiné místnosti, vybavené pro elektroforézu. Složky reakční směsi Zásobní koncentrace Výsledná koncentrace Množství v 25 µl / 1 vzorek Množství v ….µl / X vzorků H2O pro PCR Pufr pro PCR s MgCl2 10 ´ 1 ´ MgCl2 25 mM 0 mM dNTP 2 mM 200 µM Primery: H279 H280 10µM 0,4 µM každý Taq DNA-polymeráza 5 U µl-1 1 U Templátová DNA 100 ´ řeď. 50 ng Templátová DNA: •Staphylococcus aureus 50x ředěná DNA •Negativní kontrola H2O 22 µl MM/vzorek + 3 µl DNA (řeď.) Směs pro PCR, tzv. master-mix (H2O, pufr, MgCl2, dNTP, polymeráza, primery), smíchat pro všechny vzorky, pak rozplnit do PCR zkumavek po 22 µl a přidat 3 µl dsDNA (vzorek), případně vody (negativní kontrola). Při přípravě se počítá s jedním rezervním vzorkem pro případ chyby pipetování. Protokol PCR - Amplifikace genu hsp60 (GroEL) 14,8 µl 2,5 µl 0 µl 2,5 µl 1 µl 1 µl 0,2 µl 3 µl teplota doba trvání Poč. denaturace 95°C 30s Denaturace 94°C 30s Nasedání primerů (annealing) 54°C 30s Produžování primerů (extenze) 72°C 50s Závěrečná extneze 72°C 3min 30 x What is PCR? Polymerase Chain Reaction | miniPCR bio™ - YouTube 2. cvičení •PCR amplifikace hsp60 •Měření čistoty a koncentrace pDNA •Štěpení pDNA pBlueScript •Štěpení pDNA pBlueScript + hsp60 Stanovení koncentrace a čistoty DNA SPEKTROFOTOMETRICKÁ METODA •Je to vhodná metoda pro měření vzorků nukleových kyselin, které jsou dostatečně čisté bez významného množství kontaminant. •Nukleové kyseliny absorbují UV záření s maximem absorbance v oblasti vlnové délky okolo 260 nm. •Z hodnot optické hustoty lze koncentraci a čistotu vzorku stanovit podle empirických vztahů. A = log I0 I množství světla vcházejícího množství světla propuštěného product_rtcol_nd2000 NanoDrop 2000-Spectrophotometer Výhody: -objem měřeného vzorku je pouze 2µl -šetří vzorek pro experimenty – výhoda oproti kyvetovým spektrofotometrům -xenonová výbojka stačí pro cca 30 000 stanovení Obsah obrázku snímek obrazovky Popis byl vytvořen automaticky Obsah obrázku interiér, objekt, auto, vsedě Popis byl vytvořen automaticky Obsah obrázku interiér, objekt, vsedě, počítač Popis byl vytvořen automaticky 1.Voda (očištění), otřít 2.Blank (kalibrace, pozadí vzorku), otřít 3.Vzorek (-y), otřít 4.Voda (očištění), otřít Objem vždy 2µl Obsah obrázku snímek obrazovky Popis byl vytvořen automaticky Obsah obrázku snímek obrazovky Popis byl vytvořen automaticky křivka absorbance pro různé vlnové délky hodnota koncentrace specifické poměry absorbancí Záznamy jednotlivých měření čistota vzorku •Stupeň čistoty nukleových kyselin se stanovuje z poměru absorbance při 260 a 280 nm. •Pro čistou DNA platí: A260/A280 = 1,80 až 1,85 •Pro čistou RNA platí: A260/A280 = 2,0 proteiny a aromatické látky < 1,85 < reziduum RNA Vyhodnocení naměřených hodnot Případné přečištění vzorku: •odstranění fenolu: extrakce chloroformem •odstranění proteinů: opakovaná deproteinace chloroformem, nebo enzymová degradace proteinů pomocí pronázy nebo proteinázy •odstranění RNA: enzymová degradace pomocí RNázy nebo specifické precipitační postupy 2. cvičení •PCR amplifikace hsp60 •Měření čistoty a koncentrace pDNA •Štěpení vektoru pBlueScript •Štěpení rekombinantního vektoru pBlueScript + hsp60 Štěpení DNA restrikčními endonukleázami - linearizace vektoru a úprava konců vektoru a inzertu u •sekvence rozpoznávané restrikčními enznymy leží v polylinkeru (MCS = multiple cloning site) •polylinker obsahuje několik restrikčních míst pro různé restrikční endonukleázy •v tomto místě dochází k rozštěpení a následné ligaci s lineárním inzertem, jehož konce jsou štěpeny stejnými restriktázami jako vektor •po ligaci se recirkularizuje rekombinantní vektor u= vektor + inzert • • u Působení restrikčních enzymů - Typy RE: I, II, III a IV N-glykosidická vazba RE působí na fosfodiesterovou vazbu v molekule DNA Přirozená funkce: •odbourávání cizorodé DNA (např. fágy, plazmidy) (ochrana vlastní DNA pomocí metylace) Název: rod/druh/kmen/serotyp EcoRI (Escherichia coli kmen R, pořadové číslo 1) Původ: produkty bakterií •závislá na teplotě •závislá na typu substrátu •závislá na čase •závislá na chemických faktorech (druh pufru) •závislá na koncentraci (U) Aktivita enzymu je …… RE-fragmenty dsDNA 3 typy RE-fragmentů: a) s tupými konci b) přesahujícími 5`- konci c) přesahujícími 3`- konci Návrh primerů s adaptory pro RE https://www.addgene.org/protocols/pcr-cloning/ Forward primer: 1. Návrh primeru (18-21 bp, začíná iniciačním kodónem ATG) 5'-ATGTGGCATATCTCGAAGTAC-3‘ 2.Výběr vhodné restriktázy (Addgene: Analyze Sequence) 3. EcoRI restriction site (GAATTC) 5'-GAATTCATGTGGCATATCTCGAAGTAC-3‘ 3.Přidat volné nukleotidy pro optimální štěpení (3-6 nt) (Cleavage Close to the End of DNA Fragments | NEB) 4. TAAGCA 5'-TAAGCAGAATTCATGTGGCATATCTCGAAGTAC-3‘ 3. Reverse primer: 1.Návrh primeru (18-21 bp, začíná stop kodónem TAA) 2. 3‘ - GCATGCCAGGAATGATGTAA - 5‘ reverzně komplementárně http://reverse-complement.com/ 5'- TTACATCATTCCTGGCATGC-3‘ 1. 2.Výběr vhodné restriktázy + přídatné nukleotidy EcoRI restriction site (GAATTC) přídatné nukleotidy TAAGCA reverzně komplementárně 5‘- TGCTTAGAATTCTTACATCATTCCTGGCATGC-3‘ (5‘-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3‘ …. reverzně komplementárně http://reverse-complement.com/ Klonování do plazmidového vektoru pomocí restriktáz https://media.addgene.org/data/easy-thumbnails/filer_public/cms/filer_public/1f/b4/1fb44bf4-0944-46 80-8569-c68985dd2612/pcr-based-subcloning-2_1.gif__900.0x268.0_crop_subsampling-2_upscale.png vektor inzert https://www.addgene.org/protocols/pcr-cloning/ Cloning With Restriction Enzymes - YouTube Overview of Traditional Cloning - YouTube Příprava štěpící směsi – dsDNA pBluescript Postup: 1. do sterilní Epp. zkumavky připravit 20 µl štěpící směsi 2. mžiková centrifugace 3. inkubace při 37 °C / 2 hod. 4. zastavit reakci 70°C / 10 min. 16 µl DNA (c = 300 µg/ml) 2 µl restrikčního pufru 2 µl EcoRI 3 U/µl 20 ml Jednotka enzymu (U) = množství RE, které rozštěpí 1 µg dsDNA (obvykle DNA fága λ) za 1 hod. při optimální teplotě a optimálních podmínkách uvedených pro každou RE Mapování DNA genomu pomocí restrikčních endonukleáz = znázorňuje počet restrikčních fragmentů DNA, získaných štěpením různými restriktázami, a jejich uspořádání v genomu Na mapě jsou vyznačená místa štěpení restriktázami a poloha jednotlivých restrikčních míst v genomu Vzdálenost RE míst je dána velikostí fragmentu DNA (v bp) mezi dvěma sousedními RE-místy Restrikční mapa fága 3A Postup a konstrukce RE mapy