Harmonogram výuky čtvrtek 13:00 – 16:50 D36/216 Původ klonované DNA: •izolovaná z donorového organizmu (restrikční štěpení, PCR) •komplementární (cDNA připravená zpětnou transkripcí z mRNA) •připravená uměle chemickou syntézou spojené molekuly cizorodé DNA = rekombinantní DNA vektor obsahující inzert cizorodé DNA = rekombinantní vektor rekombinantní DNA určená ke klonování se nazývá klonovaná DNA Transgenní organizmy obsahují cizorodé geny a vyznačují se novými vlastnostmi. Způsoby přenosu DNA Transformace: Přímý přenos DNA izolované z donorové buňky přes cytoplazmatickou membránu do bakteriální recipientní buňky, v jejímž fenotypu se může vnesená genetická informace projevit. Transdukce: Přenos DNA prostřednictvím bakteriálního viru z buňky donorové do recipientní, v jejímž fenotypu se může vnesená genetická informace projevit. Transfekce: Přenos DNA do živočišných buněk. Pomocí virů eukaryot (adenoviry, retroviry), elektroporací, chemickými činidly (polyaminy, lipidy), mikroinjekčně. amplikon hsp60 T4 ligáza X-gal – chromogenní substrát - 5-bromo-4-chloro-indolyl-β-D-galaktozid IPTG - induktor tvorby β-galaktozidázy - izopropyl- β -D-tiogalaktozid Ampicilin – selekce Inaktivace syntézy β-galaktozidázy amplikon hsp60 T4 ligáza inzert : vektor (molární poměr) inzert : vektor (hmotnostní poměr) 5:1 60 ng inzert + 50 ng vektor 3:1 35 ng inzert + 50 ng vektor 1:1 12 ng inzert + 50 ng vektor Příprava kompetentních buněk Pozor na správné pipetování ! Obsah obrázku jídlo, stůl, interiér, hrníček Popis byl vytvořen automaticky TRANSFORMACE V mikrozkumavce na ledu je 200 µl kompetentních buněk 1.Vzorek opatrně promíchat s KB, nechat stát na ledu 30 min 2.Teplotní šok 42 °C/60-90s 3.Na ledu přidat 1 ml LB bujonu a nechat 2 min stát 4.Inkubace 37°C/45-60 min Vzorky naředíme tak, aby v 50 µl roztoku bylo 50 ng DNA, tj. c = 1 ng/ µl 3 vzorky: A: 50 ng neštěpeného vektoru - každý B: 50 ng rekombinantního vektoru - každý C: 50 µl vody (negativní kontrola) – 2x na sem. sk. A: vektor B: rek. vektor C: voda (50 ng) (50 ng) (50µl) odlít supernatant resuspendovat sediment buněk ve zbytkovém médiu (cca 100 µl) suspenzi vyočkovat na LBA + AMP + IPTG + X-gal misky dopředu popsat na dno! nechat vsáknout inkubovat dnem vzhůru při 37 °C/24 – 48 hod centrifugace při 12 000 rpm/ 1 min Titry: Titr KB: Kompetentní buňky vysety ve 100 µl => titr (CFU/ml) = počet buněk × obrácená hodnota ředění × 10 Titr transformantů: Kompetentní buňky v počátečním objemu 200 µl => titr (CFU/ml) = počet buněk × 5 CFU – colony forming unit B/ rekombinantní vektor C/ voda A/ neštěpený vektor Hodnocení •1. stanovení titru kompetentních buněk CPM/ml • •2. odečet kolonií transformantů a stanovit jejich titr: CPTA /ml • CPTB /ml • CPTC /ml • •3. Transformační index pro poměry 5:1 a 3:1 a kontrolu C vyjádřen poměrem titru transformantů k titru kompetentních buněk: • Ti = CPT : CPM = N,d × 10-e • Zápis do protokolu Titr buněk: 7,3 ×109/ml - správně 726 × 107/ml - nesprávně Tindex Ti1:1 = N,d × 10-e - správně Ti1:1 = N % - nesprávně Inzerční inaktivace genu pro rezistenci k antibiotiku: •Po vložení inzertu do genu pro rezistenci k ampicilinu je tento gen nefunkční •Transformované buňky jsou necitlivé k tetracyklinu •K ampicilinu jsou necitlivé jen buňky bez inzertu – s funkčním genem ampR •Hledáme kolonie rezistentní k tetracyklinu, ale citlivé k ampicilinu •razítkovací metoda Razítkování Úlohy k vypracování – sam. práce Procentuální koncentrace může mít tři základní vyjádření: Hmotnostní procenta (w/w): množství látky (v gramech) ve 100 g výsledného roztoku. Objemová procenta (v/v): počet mililitrů látky na 100 ml výsledného roztoku. Hmotnostně-objemová procenta (w/v %): počet gramů látky na 100 ml výsledného roztoku. Výpočty pro skupiny 01_1, 01_2, 02_1: 1.Určete množství lysozymu o koncentraci 50 mg/ml, které se přidá do reakční směsi o objemu 100 µl tak, aby byla jeho výsledná koncentrace 500 µg /ml. 1 µl 2.Určete, jaké množství zásobního roztoku ampicilinu o koncentraci 100 mg/ml se musí přidat do 20 ml LB bujonu, aby byla jeho výsledná koncentrace 100 µg/ml. 20 µl 3.Kolika procentní roztok (w/v %) představuje 10M HCl (Mr = 36)? Popište, jak byste z hlediska bezpečnosti postupovali v přípravě tohoto roztoku. 36% 4.Kolik g sacharózy a kolik vody je třeba k přípravě 20 g 10% roztoku (w/w=hmotnostní procenta)? 2g sach + 18g voda 5.Kolik g NaCl (Mr= 58,0) použijete na přípravu 50 ml 2M roztoku NaCl? 5,8g