1 Elektroforetické metody Princip Rozdělení proteinů (nejčastěji krevních bílkovin) na základě jejich pohyblivosti v elektrickém poli. Po tomto kroku většinou navazují další metody založené na reakci antigen – protilátka. Důležité je, že bílkoviny se dělí podle povrchového náboje. K realizaci elektroforetických metod je nutný zdroj stejnosměrného elektrického proudu, speciální elektroforetické vany, vhodný pufr a vhodný nosič. Jako nosič se v minulosti používal papír, acetatcelulózová membrána nebo agar, dnes se prakticky výlučně používá agaróza nebo polyakrylamidový gel. Rozdíl mezi agarózou a agarem spočívá v tom, že agar je nehomogenní směs polysacharidů získaných z mořských řas, zatímco agaróza je homogenní, po chemické stránce se jedná o polymer složený z disacharidových jednotek – agarobiózy. Agaróza se pro elektroforézu používá v koncentraci 0,5 – 2 %. Při této koncentraci tvoří gel, který vyhovuje požadavkům, pouze je křehký, což mírně komplikuje manipulaci. Polyakrylamid je homogenní, hydrofilní, má výborné mechanické vlastnosti, nízkou elektroosmózu a nízkou absorpci. Lze ho připravit v různé hustotě, zkoumané látky se potom dělí nejen podle náboje, ale i podle velikosti molekul. Nevýhodou je pouze toxicita základního monomeru. Imunoelektroforéza: jedná se o elektroforetickou separaci následovanou imunoprecipitací rozdělených proteinů specifickými protilátkami, většinou v prostředí agarózy. V této metodě je tedy obsažena i imunologická reakce antigen – protilátka. Metoda imunoelektoforéza (imunoelfo) byla poprvé publikována v roce 1952 a od té doby našla rozsáhlé uplatnění v imunologickém výzkumu i diagnostice. V současnosti se nejvíce používá při stanovení paraproteinu (čili neúplných řetězců imunoglobulinů) při monoklonálních gamapatiích. Výhody a nevýhody: metoda imunoelektroforézy je nenáročná na čas i vybavení, není drahá. Pouze proces odečítání a interpretace výsledků je do značné míry závislý na zkušenostech pracovníka, o složitosti této problematiky svědčí fakt, že o imunoprecipitaci proteinů existují celé samostatné monografie. Imunofixace: je modifikací imunoelektroforézy; spočívá v tom, že po elektroforéze se na agarózový gel položí maska s výřezy. Otvory se naplní příslušnými protilátkami anti IgG, anti IgA, anti IgM, anti kappa, anti lambda. Vzniklé precipitační linie se pak porovnávají se standardním sérem a lze tak posuzovat odchylky ve smyslu poklesu nebo nárůstu jednotlivých tříd protilátek, resp. lehkých řetězců. Využití elektroforetických metod: - orientační vyšetření bílkovin krevní plasmy: zde se nejčastěji posuzují linie odpovídající albuminu, α1 α2 β a γ globulinu. Při imunologických vyšetřeních lze touto metodou zachytit zvýšení, resp. snížení γ globulinové frakce. - rozdělení antigenů pro imunoblotting - obecně dělení bílkovin v experimentálních studiích ÚLOHA 10: Raketová elektroimunodifuze podle Laurella Princip Zkoumaný antigen je stejnosměrným elektrickým proudem unášen po gelu s protilátkou. Vazbou antigenu a protilátky vznikají imunokomplexy, které se projeví jako precipitát v podobě tzv. raket. Podstatou techniky je putování antigenu a tvorba imunokomplexů až do vzdálenosti, ve které je veškerý antigen ze vzorku vyvázán protilátkou v gelu. Jde o jednu z nejpřesnějších kvantitativních elektroimunodifuzních metod. Výhody a nevýhody Metoda je poměrně přesná a jednoduchá na provedení. Vyžaduje však nákladné přístrojové vybavení. Je také nutné počítat s nejméně hodinovou rezervou při elektroforetické fázi a vyhodnocení výsledku je možné až po určité době. Chemikálie a roztoky 1. Komerční lidské sérum obsahující IgG pro kalibraci Obsah IgG je 23 g/l. 2. Protilátka - sérum s anti-IgG protilátkami 3. Fyziologický roztok 4. Agaróza v práškové formě 5. Borát-fosfátový pufr (pH 6,8) 6. Roztok Coomassie blue - malé množství rozpuštěné v dH2O 7. Barvící roztok 225 ml CH3OH + 25 ml CH3COOH + 0,25 g amidočerni 10B 8. Odbarvovací diferenciační roztok CH3OH : CH3COOH - 10:1 Vzorek: Komerční lidské sérum obsahující neznámé množství IgG (Orion Diagnostica) Vystupuje jako antigen. Přístroje a pomůcky Skleněné plotny 5x5 cm, skleněná pipeta, korkovrt na vysekávání jamek, vývěva, zdroj napětí, elektroforetické komory, Petriho misky na vlhkou komůrku, filtrační papír. Skleněné plotny s agarózovým gelem: 1. Vyvážíme podložku na nalévání do vodorovné polohy. 2. Skleněnou plotnu (5x5 cm) očistíme alkoholem a necháme oschnout. 3. Připravenou skleněnou pipetu několikrát propláchneme horkou vodou. 4. Na plotnu naneseme skleněnou pipetou 2,4 ml 1% roztoku agarózy v borát-fosfátovém pufru s anti-IgG sérem. 5. Gel necháme několik minut zatuhnout na kalibrované vodorovné ploše. 6. Z Petriho misky a vlhkého filtračního papíru připravíme vlhkou komůrku. Do ní umístíme skleněnou plotnu s agarózou, aby tato nevyschla. Postup (vlastní práce) - pracujeme ve dvojicích 1. Ze zásobního komerčního séra o známé koncentraci IgG si připravíme další ředění. a) do zkumavek 2. a 3. napipetujeme 10 μl fyziologického roztoku b) do zkumavky 1. napipetujeme 20 μl séra se známou koncentrací IgG c) ze zkumavky 1. přenášíme 10 μl do zkumavky 2., důkladně promícháme a přeneseme 10 μl do zkumavky 3. d) do další zkumavky si připravíme směs 10 μl ze zkumavky 3. a 10 μl roztoku coomassie blue Označení zkumavky 1. 2. 3. 4. Coomasie Blue - - - 10 µl Fyziologický roztok - 10 µl 10 µl Antigen (sérum) 20 µl - - Ředění: - 2x 4x 8x Koncentrace [g/l]: Celkový objem: 10 µl 10 µl 10 µl 20 µl 2. Podle šablony vysekáme do gelu s protilátkou řadu pěti jamek. Do jamek naneseme: a) do prvních čtyř jamek 5 μl ze zkumavek 1-4 b) do páté jamky 5 μl séra o neznámé koncentraci 3. Do elektroforetických komor nalijeme borát-fosfátový pufr, na hranici mezi katodou a anodou položíme připravená sklíčka a ze dvou protilehlých stran (od katody a anody) přiložíme na kraj gelu filtrační papír nasátý borát-fosfátovým pufrem za účelem vedení elektrického proudu. 4. Každou komoru obsahující tři sklíčka zakryjeme a zapojíme elektrický obvod tak, aby do každé elektroforetické komory vedl proud o velikosti 60 mA (20 mA na sklíčko). Elektroforéza bude probíhat cca 1 hodinu, přičemž její průběh budeme sledovat na séru označeném roztokem Coomassie blue. 5. Po skončení elektroforézy pereme skla nejvýše 2 minuty ve fyziologickém roztoku, zabalíme je do chromatografického papíru navlhčeného fyziologickým roztokem a přes noc sušíme při pokojové teplotě. 6. V dalším cvičení sejmeme ze sklíček papír, skla opereme pod tekoucí vodou a barvíme barvícím roztokem do dostatečného obarvení linií. Pozadí odbarvíme diferenciačním roztokem. Nakonec opereme v destilované vodě a usušíme bez papíru. 1 : 8 1 : 4 1 : 2 konc. Ukázka raketové elektroimunodifuze 10 µl 10 µl 10 µl Hodnocení Plocha popř. výška raketky po odečtení startovací jamky je úměrná koncentraci antigenu. Hodnoty výšky/plochy precipitačních útvarů (cm2) u prvních tří jamek vyneste do bodového grafu proti hodnotám koncentrace séra v příslušné jamce a vyneste kalibrační křivku s rovnicí regrese a hodnotou spolehlivosti Hodnotu výšky/plochy precipitačního útvaru u čtvrté jamky (lidské sérum o neznámé koncentraci IgG) dosaďte do rovnice regrese a vypočítejte koncentraci IgG. Výstup 1) Tabulku s hodnotami výšky/plochy precipitačních útvarů různých koncentrací kontrolního séra a vzorku. 2) Kalibrační graf závislosti výšky/plochy precipitačních útvarů na koncentraci kontrolního séra s rovnicí regrese a hodnotou spolehlivosti. 3) Výpočet koncentrace IgG ve vzorku lidského séra. + - 1. 2. 3. 4. coomassie blue vzorek