ÚLOHA 8: Turbidimetrické stanovení celkových imunoglobulinů (Celkové Ig) Princip Tato metoda využívá změny konformace a optických vlastností, ke kterým dochází při denaturaci proteinů. Tyto změny nastávají při srážení frakce proteinů ze séra, která odpovídá imunoglobulinům, vhodnou chemikálií např. síranem zinečnatým. Výsledkem této reakce je vznik zákalu, který lze detekovat spektrofotometricky. Výhody a nevýhody Poměrně spolehlivá, jednoduchá a levná metoda, která vyžaduje pouze spektrofotometr s filtrem pro určitou vlnovou délku a příslušné kontrolní sérum. Chemikálie a roztoky 1. Komerční lidské sérum s koncentrací Ig 20 g/l 2. Fyziologický roztok 3. Roztok 0,7 mM síranu zinečnatého (pH 5,8): 20,8 mg ZnSO4 . 7H2O + 100 ml dest. H2O Vzorek: Komerční lidské sérum s neznámým množstvím Ig. Přístroje a pomůcky Spektrofotometr pro viditelnou oblast schopný měřit při vlnové délce 590 nm. Postup 1. Ze zásobního komerčního séra o známé koncentraci Ig si do dvojice připravíme řadu ředění pro kalibraci a) do 1. zkumavky napipetujeme 10 μl komerčního séra b) do 2. - 3. zkumavky napipetujeme 5 μl fyziologického roztoku c) z 1. zkumavky přeneseme 5 μl do 2. zkumavky, důkladně promícháme, poté přeneseme 5 μl do 3. zkumavky Označení zkumavky 1. 2. 3. Fyziologický roztok 5 µl 5 µl Vzorek - - Antigen (sérum) 10 µl - Ředění: Konc. 2x 4x Koncentrace: 20 g/l 10 g/l 5 g/l Celkový objem: 5 µl 5 µl 10 µl 5 µl 5 µl 2. Různé ředění kalibračního séra a vzorek smícháme s roztokem síranu zinečnatého přímo na mikrotitrační destičce: a) do čtyř jamek (tři jamky pro ředěné sérum a jednu pro vzorek) jednoho sloupce na destičce napipetujeme po 150 μl roztoku síranu zinečnatého do každé jamky b) napipetujeme 2,5 μl roztoku do patřičné jamky z každé stejně označené zkumavky a důkladně promícháme. 3. Směs síranu zinečnatého a séra necháme kultivovat 0,5-2 hodiny při laboratorní teplotě. 4. Po uplynutí dané doby směs promícháme a změříme absorbanci při vlnové délce 590 nm na spektrofotometru. Hodnocení Výstupem je série hodnot v tabulce, ve které jsou uvedeny hodnoty absorbance pro každou jamku. Absorbance je bezrozměrná veličina, která udává množství pohlceného světla. Získáte 3 hodnoty absorbancí pro sestavení kalibrační křivky a hodnotu pro vzorek. Vytvořte lineární kalibrační přímku se zobrazením rovnice regrese a hodnoty spolehlivosti. Pomocí této rovnice spočítejte koncentraci imunoglobulinů ve vzorku. Výstup 1) Tabulka hodnot (koncentrace a absorbance) různých ředění kalibračního séra a vzorku. Uveďte koncentraci imunoglobulinů ve vzorku. 2) Bodový graf s proloženou lineární regresní křivkou, hodnotou spolehlivosti R a rovnicí regrese. ÚLOHA 9: Turbidimetrické stanovení protilátek třídy M (IgM) Princip Určení lidského imunoglobulinu konkrétní třídy je založeno na reakci mezi imunoglobuliny jako antigeny a specifickém antiséru jako protilátce, se kterou budou imunoglobuliny reagovat. Při této reakci vzniká nerozpustný imunokomplex antigen-protilátka tvořící zákal, který je měřen spektrofotometricky. Výhody a nevýhody Podobně jako u stanovení celkových Ig se jedná o dosti spolehlivou a jednoduchou metodu, která vyžaduje spektrofotometr s filtrem pro určitou vlnovou délku, kontrolní sérum o známé koncentraci IgM a příslušné antisérum. Chemikálie a roztoky 1. Komerční lidské sérum s koncentrací IgM 2 g/l 2. Fyziologický roztok 3. Reagent A (fosfátový pufr) 4. Reagent BC (naředěné komerční prasečí antisérum s antiHuman-IgM protilátkami (Orion Diagnostica)) Vzorek: Komerční lidské sérum s neznámým množstvím IgM. Přístroje a pomůcky Spektrofotometr pro UV oblast schopný měřit při vlnové délce 340 nm. Postup 1. Ze zásobního komerčního séra o známé koncentraci IgM si připravíme řadu ředění pro kalibraci. Označení zkumavky 1. 2. 3. Fyziologický roztok - 25 µl 25 µl Antigen (sérum) 50 µl - Ředění: Konc. 2x 4x Koncentrace: 2 g/l 1 g/l 0,5 mg/l Celkový objem: 25 µl 25 µl 50 µl 2. Smícháme antigen (řada ředění séra o známé koncentraci IgM a vzorek) s protilátkou (antisérum s anti-IgM) a reakčním pufrem a) přímo na destičku napipetujeme do čtyř jamek po 90 µl Reagent A b) poté napipetujeme do každé jamky 10 µl reagent BC c) nakonec do všech jamek napipetujeme z příslušné zkumavky 20 µl kalibračního séra nebo vzorku 25 µl 25 µl 3. Mikrotitrační destičku inkubujeme minimálně 10 minut při 37 ˚C, aby došlo k vytvoření imunokomplexů. 4. Po uplynutí dané doby ještě jednou promícháme a změříme absorbanci při vlnové délce 340 nm. Hodnocení Výstupem je série hodnot v tabulce, ve které jsou uvedeny hodnoty absorbance pro každou jamku. Absorbance je bezrozměrná veličina, která udává množství pohlceného světla. Získáte 3 hodnoty absorbancí pro sestavení kalibrační křivky a hodnotu pro vzorek. Vytvořte lineární kalibrační přímku se zobrazením rovnice regrese a hodnoty spolehlivosti. Pomocí této rovnice spočítejte koncentraci imunoglobulinů ve vzorku. Výstup 1) Tabulka hodnot (koncentrace a absorbance) kalibračních sér a vzorku. 2) Bodový graf s proloženou lineární regresní křivkou, hodnotou spolehlivosti R a rovnicí regrese