Laboratoř neuroetologie a smyslové fyziologie Martin Vácha Volba laboratoře souvisí se specializací. Imunologie Fyziologie živočichů Vývojová biologie Jaké předměty? Imunologie Fyziologie živočichů Vývojová biologie Schéma předmětů vyučovaných na OFIŽ Chování zvířat je důležitý fenotyp. O chování živočichů se zajímá řada biologických disciplín. O chování lidí lékařské a humanitní obory. Etologie - chování zvířat a populací s ohledem na jejich prostředí, sociální vztahy a zkušenost, evoluce chování – přirozené chování je cílem výzkumu Fyziologický přístup redukuje prvky chování, používá laboratorní podmínky, sledování chování je nástrojem pochopení dějů na nižších úrovních. Behaviorální vědy Pestrá skupina laboratorních oborů - společný zájem o funkce související s nervovým a svalovým systémem, protože ty jsou za chování primárně odpovědné. Chování je vždy spojeno s pohybem zvířete, ať už jde např. o používání nástrojů, hledání cesty a orientaci, počtu určitých pohybů nebo denních rytmů aktivity... Dokonce i dočasné strnutí (freezing), tedy nedostatek pohybu, je projevem chování. Studium chování bývá součástí spektra metod u komplexních a kvalitních článků nejrůznějšího výzkumného zaměření. Biochemie, toxikologie, neurofyziologie, smyslová fyziologie, zoopsychologie nebo aplikované vědy jako je farmakologie, zootechnika, ochrana před škůdci nebo parazity a další specializace, které z popisu prvků chování získávají odpovědi pro své dílčí otázky. Behaviorální metody ve fyziologii Neuroetologie (behaviorální neurobiologie): ⚫ Syntéza etologie a neurobiologie (60.l) ⚫ Neurální podstata chování ⚫ Nástroj řešení otázek neurofyziologie CHOVÁNÍPODNĚT ŽIVOČICH A) Bezobratlí v neuroetologii: ⚫ Jednoduchý, snadno přístupný nervový systém ⚫ Larva 10 tis neuronů ⚫ „Robustní“ behaviorální projev ⚫ Laboratorní podmínky ⚫ Snadný, levný a rychlý chov ⚫ Mutantní linie Bezobratlí v neuroetologii: ⚫ Jednoduchý, snadno přístupný nervový systém ⚫ „Robustní“ behaviorální projev ⚫ Laboratorní podmínky ⚫ Snadný, levný a rychlý chov ⚫ Mutantní linie = ⚫ Mimořádný význam Bezobratlí v neuroetologii: ⚫ Sensomotorické reflexy Caenorhabditis elegans (háďátko) Bezobratlí v neuroetologii: ⚫ Sensomotorické reflexy Caenorhabditis elegans (háďátko) Bezobratlí v neuroetologii: ⚫ Sensomotorické reflexy • Motorické sekvence Clione limacina (valovka plžovitá) „Sea angel“ Bezobratlí v neuroetologii: ⚫ Sensomotorické reflexy • Motorické sekvence • Orientace Philanthus triangulum N. Tinbergen Nobelova cena 1973 Bezobratlí v neuroetologii: ⚫ Sensomotorické reflexy • Motorické sekvence • Orientace • Komunikace Bezobratlí v neuroetologii: ⚫ Sensomotorické reflexy • Motorické sekvence • Orientace • Komunikace • Učení a paměť Bezobratlí v neuroetologii: ⚫ Sensomotorické reflexy • Motorické sekvence • Orientace • Komunikace • Učení a paměť • Circadiánní rymy Bezobratlí v neuroetologii: ⚫ Sensomotorické reflexy • Motorické sekvence • Orientace • Komunikace • Učení a paměť • Circadiánní rymy • Smyslové schopnosti Bezobratlí v neuroetologii: ⚫ Sensomotorické reflexy • Motorické sekvence • Orientace • Komunikace • Učení a paměť • Circadiánní rymy • Smyslové schopnosti Bezobratlí v neuroetologii: ⚫ Sensomotorické reflexy • Motorické sekvence • Orientace • Komunikace • Učení a paměť • Circadiánní rymy • Smyslové schopnosti a dráhy • Stárnutí Bezobratlí v neuroetologii: ⚫ Sensomotorické reflexy • Motorické sekvence • Orientace • Komunikace • Učení a paměť • Circadiánní rymy • Smyslové schopnosti • Stárnutí • Sexuální orientace Bezobratlí v neuroetologii: ⚫ Sensomotorické reflexy • Motorické sekvence • Orientace • Komunikace • Učení a paměť • Circadiánní rymy • Smyslové schopnosti • Stárnutí • Sexuální orientace • Agresivita Bezobratlí v neuroetologii: ⚫ Sensomotorické reflexy • Motorické sekvence • Orientace • Komunikace • Učení a paměť • Circadiánní rymy • Smyslové schopnosti a dráhy • Stárnutí • Sexuální orientace • Agresivita • Působení drog a farmak Bezobratlí v neuroetologii: ⚫ Sensomotorické reflexy • Motorické sekvence • Orientace • Komunikace • Učení a paměť • Circadiánní rymy • Smyslové schopnosti • Stárnutí • Sexuální orientace • Agresivita • Působení drog a farmak • Ochota riskovat, emoce atd… B) Podmiňování jako klíč k funkci NS a smyslů Vytvoření podmíněného spojení je důkazem plasticity NS a základem paměti a učení. Pavlov Podmiňování jako klíč k funkci NS a smyslů Vytvoření podmíněného spojení je důkazem plasticity NS a základem paměti a učení. von Frish Aplysia – zej „mořský zajíc“ Aplysia Eric Kandel Nobelova cena 2000 Vytvoření podmíněného spojení může být: cílem výzkumu paměti a učení Trénink a test Vytvoření podmíněného spojení může být: cílem výzkumu paměti a učení Vytvoření podmíněného spojení může být: nástrojem výzkumu smyslových schopností Odměna nebo trest při tréninku Vytvoření podmíněného spojení může být: nástrojem výzkumu smyslových schopností Richard Axel Nobelova cena 2004 za objevy podstaty čichu Vytvoření podmíněného spojení může být: nástrojem výzkumu smyslových schopností Richard Axel Nobelova cena 2004 za objevy podstaty čichu C) Magnetorecepce – výzva smyslové fyziologii Kompas: Všudypřítomné vodítko Geomagnetické pole doprovází život od jeho počátku Schopnost je vnímat je dnes již dobře doložený fenomén. Od 60’ do dneška: Zájem badatelů neklesá. Heslo „magnetoreception“ horizontal component verticalcomponent inclination K čemu dobrá recepce? Užitečné orientační vodítko. a N S 1. Udržet azimut Kompasový smysl K čemu dobrá? N S EW K čemu dobrá? 2. Lokalizovat pozici - Mapový smysl - navigace “GPS systém“ zvířat – závisí na souřadné síti dvou gradientů Z inklinace se dá zjistit geografická šířka… …a lokalizovat severo-jižní pozici. Potřebujete ale speciální kompas. Z intenzity se dá zjistit geografická délka http://geomag.org/models/EMAG2/Looking_NW_at_Spain.jpg 3. Lokální anomálie mohou sloužit jako místní vodítka. Kompas nebo mapa? Karety mají mapu Používají magnetické parametry jako majáky k orientaci. Lohmann, K. J., Cain, S. D., Dodge, S. A. and Lohmann, C. M. F. (2001). Regional magnetic fields as navigational markers for sea turtles. Science 294, 364-366. Mladé karety v systému cívek simulujícím lokální pole. Lohmann, K. J., Cain, S. D., Dodge, S. A. and Lohmann, C. M. F. (2001). Regional magnetic fields as navigational markers for sea turtles. Science 294, 364-366. Ernst, D. A. and Lohmann, K. J. (2016). Effect of Magnetic Pulses on Caribbean Spiny Lobsters: Implications for Magnetoreception. J Exp Biol doi:10.1242/jeb.136036. Langusta karibská mapu používá také http://www.geophysik.uni-muenchen.de/observatory/geomagnetism/daily-magnetograms 4. Z denních variací je možné zjistit čas Neznáme: ▪ Mechanismus recepce ▪ Lokalizaci receptoru ▪ Adaptivní význam ? Magnetit? Důkazy pro magnetitový kompas : Nezávislý na světle Rozeznává polaritu pole (S od J) Citlivý na silný magnetický pulz Necitlivý na slabé RF oscilace Fotochemická reakce? GMF vektor může modulovat procesy transdukce světla… Solov’yov, I. A., H. Mouritsen, and K. Schulten. 2010. Acuity of a cryptochrome and vision-based magnetoreception system in birds. Biophysical Journal 99: 40-49. … a tvořit viditelné obrazce (?) Fotochemický model: Základní teze: Biochemická reakce může být ovlivněna GMF. Nepárové elektrony mají svůj magnetický moment, který interaguje s okolním polem Nepárové elektrony najdeme v radikálových párech. Ty vznikají např. po dopadu fotonu (chlorofyl, fotolyázy) Fotochemický model: Fotosensitivní molekulou s takovými vlastnostmi je nejspíše Kryptochrom Nalezené v rostlinách Příbuzné fotolyázám Řídící vnitřní hodiny Tvořící radikálové páry Schulten, K., & Windemuth, A. (1986). Model for a Physiological Magnetic Compass. In G. Maret, J. Kiepenhauer & N. Boccara (Eds.), Biophysical Effects of Steady Magnetic Fields (pp. 99-105). Berlin, Heidelberg, New York, London, Paris, Tokyo: Springer-Verlag. Fotochemický model: Citlivost Cry k GMP leží ve „hře“ s elektrony mezi proteinem a kofaktorem FAD. Mechanická analogie. I nepatrná energie magnetického pole může ovlivnit to, kterým směrem se systém mimo rovnováhu překlopí. Hore, P. J. and Mouritsen, H. (2016). The Radical-Pair Mechanism of Magnetoreception. Annu. Rev. Biophys. doi: 10.1146/annurev-biophys-032116-094545. Metody výzkumu Blacksburg VA, Oldenburg DK Kývalka u Brna CZ S Pláž na Lachmanově mysu Y- osa azimut 50-90° Vrtulovna Vrtulovna Tomanová K, Vácha M. 2016. Magnetic orientation of Antarctic amphipod Gondogeneia antarctica is cancelled by very weak radiofrequency fields. J Exp Biol. Laboratorní experiment zůstává nejjistějším standardem. Člověk? Metody práce naší laboratoře: Sledujeme pohybovou aktivitu zvířat. Laboratoř je vybavena videosystémy pro záznam a vyhodnocování pohybů. Mus musculus Blatella germanica Pyrhocorris apterus Metody práce v magnetobiologické laboratoři: Velké cívky umožňují nastavit libovolné GMP. Velké cívky ve stíněných komorách v suterénu D36. Neuroetologické metody smyslové fyziologie Spontánní a podmíněné reakce Magnetically induced restlessness (MIR) sf rf sf rf Neuroetologické metody smyslové fyziologie Podmiňování: Trénink a test Trénink Drosophila Světlo jako atraktivní stimul Cirkulární diagramy orientace 0 0,5 1 1,5 2 2,5 Bodyturnsperanimal Bodyturnsperanimal Time 0 2 4 6 8 10 12 14 Magnetically induced freezing (MIF) Steady Rotating Aversively conditioned temporary immobility. Stíněné komory v kampusu Umožňující odfiltrovat co nechceme a nastavit GMP, jaké chceme. Stíněné komory v kampusu Umožňující odfiltrovat co nechceme a nastavit GMP, jaké chceme. Máme k dispozici laboratorní testy magnetorecepčního chování u hmyzu. Díky tomu aplikujeme: ▪Metody funkční genetiky (knockoutovaní jedinci, vypnutí určitých vytypovaných genů, RNAi, crispr) ▪Fyzikální faktory (parametry světla a magnetického pole) SW analyzující obraz … a periodicitu chování …ale i myši Pohybová aktivita myší – pozice těla, počet pohybů Cirkadiánní rytmy Fedele, G., Edwards, M. D., Bhutani, S., Hares, J. M., Murbach, M., Green1, E. W., et al. (2014). Genetic Analysis of Circadian Responses to Low frequency Electromagnetic Fields in Drosophila melanogaster. PLOS Genetics, 10(12), e1004804. Fedele, G., Green, E. W., Rosato, E., & Kyriacou, C. P. (2014). An electromagnetic field disrupts negative geotaxis in Drosophila via a CRY-dependent pathway. Nature Communication, DOI: 10.1038/ncomms5391. Nejen orientace a směr. Magnetické pole ovlivňuje prostřednictvím Cry cirkadiánní rytmy Dokonce i buňky v tkáňové kultuře ví, kolik je hodin Naše výsledky: Dokonce i slabé RF zpomaluje rytmus – ale takto slabá pole jsou docela bežná! Bartos, P., Netusil, R., Slaby, P., Dolezel, D., Ritz, T., & Vacha, M. (2019). Weak radiofrequency fields affect the insect circadian clock. Journal of the Royal Society Interface, 16(158), 20190285. Dokonce i slabé RF zpomaluje rytmus – ale takto slabá pole jsou docela bežná! Resume a výhledy do budoucna Cryptochromy a jejich úlohy. Chaves I, Pokorny R, Byrdin M, Hoang N, Ritz T, Brettel K, Essen L-O, Horst GTJvd, Batschauer A, Ahmad M. 2011. The Cryptochromes: Blue Light Photoreceptors in Plants and Animals. Annu Rev Plant Biol 62:335–364. • Hodiny Fogle KJ, Baik LS, Houl JH, Tran TT, Roberts L, Dahm NA, Cao Y, Zhou M, Holmes TC. 2015. CRYPTOCHROME-mediated phototransduction by modulation of the potassium ion channel β-subunit redox sensor. • Hodiny • Změna membránového potenciálu Resume a výhledy do budoucna Cryptochromy a jejich úlohy. Eisele, Lewin, et al. "Combined PER2 and CRY1 expression predicts outcome in chronic lymphocytic leukemia." European journal of haematology 83.4 (2009): 320-327. • Hodiny • Změna membránového potenciálu • Kontrola buněčného cyklu Resume a výhledy do budoucna Cryptochromy a jejich úlohy. Dierickx, Pieterjan, Linda W. Van Laake, and Niels Geijsen. "Circadian clocks: from stem cells to tissue homeostasis and regeneration." EMBO reports 19.1 (2018): 18-28. Narušení hodin mění úlohu hodinových genů v řízení proliferace Exprese Cry je markrem chronické lymfocytární leukémie. Eisele, Lewin, et al. "Combined PER2 and CRY1 expression predicts outcome in chronic lymphocytic leukemia." European journal of haematology 83.4 (2009): 320-327. http://bioforces.blogspot.cz/2011/06/human-cryptochrome-exhibits-light.html Resume a výhledy do budoucna Cryptochromy a jejich úlohy. • Hodiny • Změna membránového potenciálu • Kontrola buněčného cyklu • Magnetorecepce • Možná všechny dráhy, kde je přítomenCry, jsou citlivé na světlo a magnetická pole ! http://bioforces.blogspot.cz/2011/06/human-cryptochrome-exhibits-light.html Resume a výhledy do budoucna Cryptochromy a jejich úlohy. K čemu je takový výzkum dobrý? • Základní výzkum – nikdy nevíte... • Nejslabší známá interakce mezi biologií a mag. polem. • Výzkum posouvá hranice mezi biologií, „kvantovou biologií“ a fotochemií. • Praktické aplikace v oblasti ochrany zdraví, kvality spánku, interakcí s technickými zařízeními atd. Rozbíhající se projekty (ne všechny behaviorální) : • Buňky, organoidy, světlo a magnetické pole • Cirkadiánní rytmus myší a magnetické pole. • Včely a EMG pole Rozbíhající se projekty : DAPI Rhodopsin CRY2 mag ctrl DAPI Rhodopsin CRY2 DAPI PSD95 PER1 DAPI PSD95 PER1 mag DAPI PSD95 PER1 DAPI PSD95 PER1 ctrl A B C D • Cirkadiánní rytmy na modelu organoidů sítnice Tomáš Bárta Dosavadní granty: ▪ Ověření magnetorecepce potemníka moučného. GAČR 2001- 2003 ▪ Analýza magnetorecepčního chování laboratorních druhů hmyzu. GAČR 2005-2008 ▪ Neurální podstata magnetorecepce hmyzu. GAČR 2007-2010 ▪ Fyziologická a funkčně genetická analýza magnetorecepce na hmyzím modelu GAČR 2013-2015. ▪ GAMU 2019-2021 ▪ Spolupráce s Molekulární chronobiologickou lab. ČB, Marburg, Oxford, Lund, Vídeň https://www.sci.muni.cz/ofiz/vacha/ Témata Bc prací zde řešených: https://www.sci.muni.cz/ofiz/vacha/ https://is.muni.cz/auth/rozpis/tema?fakulta=1431;obdobi=7584;balik=29838 Web laboratoře a nová témata: Naučíte se: Co to znamená analyzovat chování zvířat v laboratoři. Ve spolupráci metody m.b. Uplatnění? Kristína Briediková Juraj Markuš Děkuji za pozornost! vacha@sci.muni.cz