Haploidní techniky 10. Květ - ppt stáhnout Cíle této přednášky • Co jsou to haploidní techniky? • Jaké je jejich využití? • Jak vytvořit fertilní rostliny z haploidů? Haploidní techniky •♂ Androgeneze = regenerace haploidních rostlin ze samčího gametofytu - kultury nezralých prašníků nebo izolovaných mikrospor • •♀ Gynogeneze = regenerace haploidních rostlin ze samičího gametofytu - kultury neoplodněných vajíček • Prašníkové kultury tabáku Nicotiana tabacum L. Foto: J. Dubová Význam haploidních rostlin •detekce recesivních alel (v haploidním stavu nejsou překryty dominantní alelou) •zdvojený haploid poskytuje homozygotní linie •materiál může být použit pro somatickou hybridizaci (fůze protoplastů) – není tak indukována polyploidie Terminologie •haploid = rostlina s gametickým počtem chromozómů •monohaploid n = x •dihaploid n = 2x (haploid tetraploidních druhů) • •zdvojený haploid = doubled haploid plant • (D.H. plant) Zdvojení počtu chromosomů působením kolchicinu 2 monoploidní buňky 1 diploidní buňka Vznik haploidů u vyšších rostlin •Klasické způsoby –Působení fyzikálních faktorů (UV, X, teplotní šoky) –Působení chemických faktorů (kolchicin, maleinhydrazid) –Zásahy do procesu opylení a oplození ·kastrace a izolace ·opožděné opylování ·opylení inaktivovaným pylem ·vzdálená hybridizace - eliminace chromozómů • Vznik haploidů u vyšších rostlin •SPONTÁNNÍ frekvence 10-3 - 10-6 –Haploidní partenogeneze – Gynogeneze – Androgeneze •EXPERIMENTÁLNÍ = INDUKOVANÁ –Klasické způsoby –Explantátové metody • Vznik haploidů u vyšších rostlin •Explantátové metody · prašníkové kultury · mikrosporové a pylové kultury · kultivace semeníků · chromozomální redukce v kalusových , buněčných nebo protoplastových kulturách • Příklad haploidní techniky užívané ve šlechtitelství - Monoploidní ječmen Haploid Breeding: Development of Pure Homozygous Line : Plantlet Produkce haploidů a dihaploidů ječmene Ø mezidruhová hybridizace H. vulgare a H. bulbosum = hybridní zygota Ø eliminace chromozómů H. bulbosum = haploidní rostlinka Ø izolace hybridního embrya Ø zdvojení chromozómů působením kolchicinu diploidizovaný haploid 1. Androgeneze Tvorba haploidních regenerantů ze samčího gametofytu Lily_anther_tet2 prašný váček prašné pouzdro tetrády tapetum exothécium endothécium mezofyl konektiv nitka prašný váček stomium Řez prašníkem lilie nezralá stěna Vakuola Meióza I a II Kalóza 1. mitóza jádro veget. buňky jádro generat. buňky odvodnění pylová mateřská buňka tetráda mikrospor volné mikrospory mikrospora nezralé pylové zrno zralé pylové zrno (dvoubuněčný pyl) klíčící pylové zrno pylová mitóza migrace jádra apertura dozrávání pylu tvorba mikrospor: mikrosporogeneze tvorba gamet: mikrogametogeneze jádro spermatické buňky pylová láčka vývojová stadia vhodná pro iniciaci androgeneze As microspores complete this stage, they elongate somewhat, becoming a bit football shaped tetrad Tetrády IASPR Lilium As microspores complete this stage, they elongate somewhat, becoming a bit football shaped. tetrad.jpg Mikrospory uvolněné z tetrád microsp At this stage, microspores have an exine (outer wall of sporopollenin) but are still filling with storage materials and remain pliable for a short time. IASPR Lilium At this stage, microspores have an exine (outer wall of sporopollinin) but are still filling with storage materials and remain pliable for a short time. microsp.jpg Dvoubuněčný pyl lil-m6 Generative cells are first formed in contact with the intine (inner pollen wall), but the cells then become immersed in the cytoplasm - truly becoming "a cell within a cell". IASPR Lilium Generative cells are first formed in contact with the intine (inner pollen wall), but the cells then become immersed in the cytoplasm -- truly becoming "a cell within a cell". Lil-m6.jpg Androgeneze = vývoj rostlin ze samčího gametofytu • umožňuje manipulace se stupněm ploidie a rychlejší získání homozygotních rostlin 1.regenerace haploidních rostlin z mikrospor nebo mladých pylových zrn = mikrosporové nebo prašníkové kultury 2.zdvojení haploidního genomu = dihaploidizace získání homozygotního materiálu v kratší době ve srovnání s klasickou genetickou metodou Faktory ovlivňující pylovou embryogenezi •zahrnují vnitřní fyziologický stav výchozí rostliny a její genetické zvláštnosti - druhová specificita •Druh rostliny, genotyp •Fyziologický stav výchozí rostliny (ontogenetické stáří, fotoperioda, výživa, použití herbicidů) •Stadium vývoje pylu •Předpůsobení na poupata a izolované prašníky (snížená teplota, centrifugace) •Předpůsobení mikrospor nebo pylu (centrifugace,hladovění, kolchicin) •Kultivační podmínky ·aktivní uhlí ·železo Mateřská rostlina Optimální fyziologický stav mateřské rostliny je pro prašníkové kultury velmi důležitý ontogenetické stáří - prašníky by se měly odebírat z poupat ze začátku období kvetení výživa, dostupnost vody teplota - u některých druhů se výnos haploidních embryí zvyšuje při předpěstování mateřských rostlin při nízké teplotě (5°C) fotoperioda - vyšší výnosy haploidních embryí byly získány při pěstování donorových rostlin při krátkém dni a vysoké světelné intenzitě Typy androgeneze přímá androgeneze na prašníku tabáku Nicotiana tabacum L. Foto: J. Dubová Typy regenerace v prašníkových a mikrosporových kulturách produkce haploidních rostlinek indukcí embryogeneze opakovaným dělením mikrospory nebo mladého pylového zrna 1. přímá androgeneze 2. nepřímá androgeneze získání haploidního kalusu a z něj regenerace haploidních rostlin obnovení diploidního stavu působením kolchicinu fertilní homozygoti plant_2 přímá androgeneze nepřímá androgeneze Tissue%20Culture%20Lecture[1].ppt (prezentace z webu) Předpůsobení Stres nízkou nebo vysokou teplotou 2-30 dny při teplotách 3-10°C (Nicotiana, Datura, Brassica) nebo 35°C (Capsicum) může stimulovat embryogenesi máčení oddělených květenství ve vodě po několik dnů stres hypoxický centrifugace prašníků aplikace vakua změny uspořádání mikrotubulů aplikace kolchicinu hladovění změna polohy jádra anth_tob1 anth_tob2 Androgeneze u tabáku prašník s embryoidy řez embryoidy 7 dní anth_tob5 anth_tob6 Androgeneze u tabáku prašník s embryoidy řez embryoidy 21 dní Prašníkové kultury a regeneranti transgenní tabák – se Zmp60.1+MTX® Anther_tob13 2-T3-3 2-T4-2 kvetoucí, ale sterilní haploidní rostlina • v prašníkových kulturách často nedochází k indukci dělení mikrospor vlivem inhibičních látek z prašníku nebo nedostatečným kontaktem s živinami • u prašníkových kultur se může vyskytnout rychlá proliferace diploidního pletiva stěny prašníku, nežádoucím výsledkem je pak heterozygotní diploid • výsledkem mikrosporové kultury je vždy homogenní populace homozygotních rostlin • u mikrosporových kultur je větší nebezpečí infekce Výhody mikrosporových kultur oproti kulturám prašníkovým Nejdůležitějším faktorem pro získání haploidů je určité vhodné vývojové stadium v době odběru materiálu do kultury. U některých krytosemenných rostlin mohou být selektována poupata, která obsahují prašníky v různých vývojových stadiích. Pyl může být frakcionován centrifugací na percollovém gradientu. U druhů s určitým počtem prašníků ve květu je nutno testovat celou sérii pupenů, aby byla zřejmá vývojová stadia. Některé snadno rozlišitelné znaky se potom používají pro charakteristiku žádaného vhodného stadia (délka poupěte, poměr délek květních obalů: např. u tabáku - koruna je jen o něco málo delší než kališní ušty; stadium 2). Vývojová stadia Co je to percollový gradient Vývojová stadia poupat tabáku Nicotiana tabacum L. 1 2 3 4 5 6 2. Gynogeneze Tvorba haploidních regenerantů ze samičího gametofytu Pestík, vajíčko a oplození •Tvorba haploidních rostlin z neoplozené vaječné buňky (samičí partenogeneze) •Embryo tak obsahuje pouze mateřské chromosomy, protože nedošlo k fůzi spermatické buňky s buňkou vaječnou • většinou náročnější než androgeneze •tvorba haploidů tam, kde nejde androgeneze (např. samčí sterilita) Gynogeneze Najít něco podrobnějšího Poznámka na závěr •Žádná z metod pro získání haploidů není univerzální pro všechny druhy. •Všechny dosud užívané cesty k haploidii je možné využít (indukovat) pouze v omezeném = krátkém vývojovém stadiu života rostliny. Přehled haploidních technik • Figure 1. Overview of doubled haploid technology.