Biotechnologie, transformace rostlin, GMO úvod metody využití Biotechnologie = technologický přístup k přírodě § biotechnologie - metoda využívající organismy ve prospěch člověka a současně pozměňuje jejich vlastnosti tak, aby byly co nejlépe využitelné lkvašení - snahy konzervovat rychle se kazící potraviny a krmiva •kvašení mléka - sýry, kefír, kumys, jogurty •víno, pivo - bible, Egypt •boza - kvašené proso (Balkán, Orient) •saké - japonský nápoj z kvašené rýže •pombe - africký nápoj z kvašeného tropického ovoce •kvašené zelí •siláže lvýroba enzymů - praní, příprava ovocných šťáv, výroba škrobu… lfarmaceutický průmysl – sekundární metabolity rostlin lbioremediace - biologické čištění vody, ropné produkty v půdě, toxické kovy... Definice podle protokolu o biodiverzitě ØLMO = living modified organism § organismus se změněnou genetickou informací, kterou je schopen předávat do další generace (polyploidizace, konjugace, transdukce) ØGMO = genetically modified organism § získaný zavedením cizorodé DNA (metody rekombinantní DNA) § genové nebo genetické inženýrství „Klasické“ a „moderní“ biotechnologie §klasické šlechtění LMO lpřirozené mutace a jejich křížení lindukované mutace •ozařování UV nebo ionizující záření •chemomutageneze vysoké výtěžky antibiotik, produkce enzymů, sladovnický ječmen Nevýhoda = metody jsou „slepé“ = vyvolává se poškození a následně se čeká, zda náhodou nevznikne výhodná změna. Navíc nevíme, kolik genů se změnilo a jak. Příklady odrůd rostlin odvozených mutačním šlechtěním plodina jméno kultivaru metoda použitá k mutaci rýže Calrose 76 gama paprsky pšenice Above azid sodný Lewis neutrony oves Alamo-X X-paprsky grapefruit Rio Red neutrony Star Ruby neutrony Cynodon dactylon Tifeagle gama paprsky Tifgreen II gama paprsky Tift 94 gama paprsky Tifway II gama paprsky salát Ice Cube ethyl methansulfonát Mini-Green ethyl methansulfonát fazol Seafarer X-paprsky Seaway X-paprsky šeřík Prairie Petite neutrony ječmen Diamant gama paprsky „Klasické“ a „moderní“ biotechnologie Ømoderní biotechnologie - umožňují cílený postup - vnášení pouze žádaného genu beze změny ostatních genů GMO Øje možný přesun vlastností mezi organismy, které se jinak nemohou ani potkat Ømohou ale existovat i nechtěné následky požadavek regulace a správného zacházení s GMO Cíle moderních biotechnologií Øzvýšení výnosů plodin, produkce dobytka i ryb Øzvýšení nutriční hodnoty, snížení ztrát produkce Øzlepšení chuti, kvality a trvanlivosti potravin Øomezení používání pesticidů a chemických látek (hnojiva, postřiky) Øzískat organismy přežívající za stresových podmínek Øzískat obnovitelné a ekologické zdroje pro výrobu Øprodukovat léčiva + vakcíny ekonomicky a bezpečně Øvyvinout nové způsoby čištění vod a půd Øpřipravit enzymy nových vlastností - snížení energetické náročnosti výroby a ekologických rizik Obecné schéma transformace Øpříprava rekombinantní DNA (= konstrukt) Øvnesení DNA do rostlinné buňky (přímo nebo pomocí vektorů) Øtest exprese vnesených genů Ødemonstrace stabilní integrace DNA do rostlinného genomu „Tradiční“ metody transformace (vnášení DNA) přímé nepřímé - pomocí vektorů lipozómy uzavírající DNA elektroporace mikroinjekce DNA do jádra bombardování mikroprojektily vakuová infiltrace s použitím nanovláken Agrobacterium (plazmidy) rostlinné viry modifikovaný bakteriofág l plazmidy Intermediární (jeden malý plazmid) Binární (dva plazmidy: s virulentní oblastí a s T-DNA) Transformace zprostředkovaná liposomy liposom liposom protoplast liposom + DNA 1. 2. liposom fúze membrán protoplastu a liposomu Elektroporace vyžaduje použití protoplastů po aplikaci el.pulsu se vytvoří dočasné póry v membránách, které umožní průniku DNA electropor BioRad Laboratories electropor různé typy pulsů Mikroinjekce DNA do jádra inject použito u protoplastů rostlin, ale častější u živočichů bombard2 Biolistické metody BioRad Laboratories bombard2 Biolistické metody bombardment krystal W s DNA regenerace rezistentních rostlin T0 Agrobacterium tumefaciens, A. rhizogenes Půdní bakterie: Pseudomonas, Corynebacterium Agrobacterium, Rhizobium Agrobacterium tumefaciens Agrobacterium rhizogenes nádory kořínky Ti plasmid Ri plasmid T-DNA T-DNA Ti plasmidu (WT) 1. geny pro biosyntézu auxinů (iaaM, iaaH) a cytokininů (ipt) = dediferenciace buněk a vznik nádorů („crown gall“) 2. geny pro syntézu nádorově specifických látek, tzv. opinů (bazické aminokyseliny - oktopin, nopalin, manopin) = zdroj dusíku, uhlíku a energie pro bakterie odzbrojené vektory (T-DNA, ze které jsou zachovány jen krajní sekvence 25 bp nezbytné pro začlenění do rostlinného genomu, jinak neobsahují žádnou DNA pocházející z Agrobacterium) iaaM = tryptofam monooxygenáza iaaH = indolyl-3-acetamid hydroláza Agrobacterium tumefaciens Agrobact_SEM2 Agrobact_SEM3 Nádor „Crown gall“ crowngall vytvořený po infekci Agrobacterium tumefaciens Agro_rhizo Agrobacterium rhizogenes indukce tvorby kořenů na segmentu kořene mrkve Mechanismus přenosu T-DNA intermediární vektor Agro_infekce Agrobacterium tumefaciens upravený binární vektor LhGR DNA agrobakteria část plazmidu kódující virulenci upravený plasmid s vloženým genem Šámalová 2005 Postup transformace - disková metoda 1. příprava kultury agrobakteria - křížový roztěr na LB médium s antibiotiky + agar 2. příprava listových segmentů - předkultivace na MSH - s auxinem a cytokininem + agar (2 - 3 dny v kultiv. místnosti) 3. příprava suspenze agrobaktéria pro kokultivaci (LB médium) 4. kokultivace listových segmentů v suspenzi - 1 min. 5. osušení segmentů a přenos na povrch MSS média - svrchní stranou dolů 6. pravidelná pasáž na médium MSSa ( s antibiotiky) regenerace kalusů a rostlinek 7. indukce zakořeňování regenerovaných prýtů MSRa Transformace Arabidopsis vakuovou infiltrací Sarah J. Liljegren a Martin F. Yanofsky Dept of Biology, Center for Molecular Genetics, University of California at San Diego, La Jolla, CA 92093-0116, USA Selekční a signální markery 1. rezistence vůči antibiotikům kanamycin hygromycin gentamycin 4. GFP („green fluorescent protein“ gen z medůzy Aequorea victoria) cytostatikům (antimetabolika) herbicidům methotrexát 3. luc luciferáza (z mořského planktonu Photinus pyralis, katalyzuje ATP dependentní oxidativní dekarboxylaci substrátu = luciferin za produkce světelné emise 562 nm) 2. iudA glukuronidáza – GUS (z E. coli ) glyfosát § §transgenní rostliny mají vložený gen pro dihydrofolát reduktázu (DHFR) z myší, která není citlivá na methotrexát §do média pro selekci transgenních organismů se přidává methotrexát sterilně (0,5 g/l) až po vysterilizování média Využití methotrexátu pro selekci transgenních organismů vysev04_05 vysev04_01 vysev04_03 kontrola bez myší DHFR na MS médiu s MTX heterozygotní transgenní tabák na MS médiu heterozygotní transgenní tabák na MS médiu s MTX Kopie Gus1 apex karafiátu substrát = 5-Br-4-Cl-3-indolyl-b-D-glukuronid (X-gluc) Indigogenní metoda detekce glukuronidázy Gus_anther_specif Broadly_expr Arabidopsis Princip indigogenní metody: detekce aktivity glukosidázy Transformované rostlinky kasavy z embryogenní kultury, signální gen = luciferáza lucifer2 lucifer3 rostlinky vizualizace luciferázy- postříkáno luciferinem a měřeno luminometrem Osamu Shimomura – objevitel GFP Osamu aequorin http://www.conncoll.edu/ccacad/zimmer/GFP-ww/shimomura.html 2008 Nobelova cena za chemii (Osamu Shimomura, Marty Chalfie a Roger Tsien) Modifikace GFP Roger Tsien bact 600px-FPbeachTsien tsienSm tsien2 Potraviny a GMO flavr První povolená transgenní plodina Rajče Flavr-Savr schváleno v USA v roce 1994 obrácená orientace genu pro enzym polygalakturonasu, která normálně degraduje pektin v buněčných stěnách a vede k měknutí plodů od jeho pěstování se již upustilo 2010 - v Indii se vrací k tématu - využili RNA interference, aby potlačili u zrajícího ovoce tvorbu alfa-mannosidázy a beta-D-N acetylhexosaminidázy, které mají „na svědomí“ dozrávání: možné použití také u banánů, papáji, manga a dalšího ovoce ke snížení posklizňových ztrát. Transgeny pro toleranci k herbicidům §výhody – možnost použít herbicidy až postemergentně §jsou biodegradovatelné §mechanismus účinku ldo rostliny je vnesen gen kódující enzym necitlivý k herbicidu ltransgen přímo herbicid rozkládá l §nevýhody lvznik herbicid rezistentních plevelů lNadměrné používání herbicidů (hlavní kritika odpůrců GMO) l lNěkteré poslední studie ukazují, že došlo k velkému nárůstu používání herbicidů především u rostlin, které nemají GM odrůdy Herbicid tolerantní plodiny (HTP) §transgenní plodiny tolerující herbicidy §umožňují získat prakticky čistou monokulturu = kritika z hlediska biologické rozmanitosti §rizikem je vznik plevelů tolerujících herbicid podobně jako transgenní plodina - mohou vznikat jak přirozenými mutacemi, tak přímým přenosem transgenu podmiňujícího necitlivost (v případě křížitelnosti a vzniku plodného potomstva) – u nás je rizikem řepka. §zprávy z USA a Argentiny o plevelech necitlivých na glyfosát, což se klade za vinu pěstování RR sóji (Roundup Ready) vyvolávající potřebu opakované aplikace glyfosátu u nás je není povoleno pěstovat, ale bez dovozu RR sóje z Jižní Ameriky by se zhroutila naše živočišná výroba Bt-plodiny resistence vůči škůdcům zavíječ kukuřičný - Ostrinia nubilalis je jedním z nejvýznamnějších škůdců kukuřice, který snižuje výnosy a kvalitu zrna zvyšuje lámavost stébel, což znamená sklizňové ztráty u poškozených obilek se navíc zvyšuje obsah afaltoxinů 220px-Corn_borer 300px-Ostrinia_nubilalis01 produkují d-toxin z Bacillus thuringiensis Bt-kukuřice MON810 § §první GM plodinou autorizovanou v EU (1998) §v Evropě v roce 2008 byla pěstována přibližně na 110 tisících ha, v 6 zemích EU včetně Česka §Nyní nic §odolná vůči zavíječi kukuřičnému Danaus plexippus, danao stěhovavý „Monarch“ imago a housenka monarch2 -Pyl z Bt kukuřice je toxický pro housenky -nicméně nebyl prokázán žádný dlouhodobý vliv Bt kuřice na úbytek motýlů, např. Sears et al. (2001) Zlatá rýže §podle WHO každý rok na světě oslepne zhruba čtvrt až půl milionu lidí, protože nemají v potravě dostatek vitaminu A, téměř polovina z nich pak zhruba do dalšího půlroku zemře §Možným řešením by mohla být GMO zlatá rýže – obsahuje 4 geny, které zvyšují obsah vitamínu A v zrnu §mezinárodní nezisková organizace vyvázala tento produkt ze všech patentových závazků §hlavní výzkumný program převzala nekomerční instituce, tedy International Rice Research Institute (IRRI) na Filipínách §finance poskytla Rockefellerova nadace, později (až dodneška) Nadace Billa Gatese a firma Syngenta http://opatrny.bigbloger.lidovky.cz/c/404055/Ryze-Zlata-trikrat-pozehnana.html Zlatá rýže nese geny pro tvorbu b-karotenu lykopenu (provitamin A) pod kontrolou endosperm-specifického promotoru pěstování zlaté rýže by mělo ohromný význam pro zlepšení výživy, především u obyvatel Asie Ingo Potrykus - Zurych Peter Beyer - Freiburg 220px-Golden_Rice psy (phytoene synthase) z narcisu Narcissus pseudonarcissus crtI z půdní bakterie Erwinia uredovora bakteriální gen funguje jako katalyzátor dokončení biosyntézy lykopenu http://en.wikipedia.org/wiki/Golden_rice 2022 – povoleno ke konzumaci a pěstování na Filipínách Amflora – GM brambor §1996 podána žádost o schválení Amflory §Evropská agentura pro bezpečnost potravin (EFSA) při několika příležitostech v průběhu schvalovacího procesu opakovaně zdůraznila bezpečnost Amflory pro lidi, zvířata a životní prostředí §Ludwigshafen, Německo - 2. březen 2010 – Evropská komise povolila Amfloru, geneticky modifikovanou bramboru (BASF) s optimalizovaným obsahem škrobu, pro komerční použití v Evropě §odrůda této brambory se s úspěchem testovala pro výrobu průmyslového škrobu i v ČR §2013 – ústup od pěstování (BASF odchází z Evropy do USA) Amflora Brambor rezistentní vůči plísni bramborové §2007 - BASF vysadil geneticky vylepšené brambory "Fortuna" odolné vůči plísni bramborové §2012 - po letech bojů o povolení pěstování této odrůdy v Evropě se BASF vzdal a přesunul veškerý svůj výzkum rostlin do Severní Karolíny §2014 - John Innes Centre (Norwich) -"Desiree„ - s genem pro odolnost vůči plísni bramborové z blízce příbuzného jihoamerického druhu lilku §na zkušebních polích se ukázalo, že brambory jsou vůči plísni doopravdy odolné a že oproti běžným bramborám dosahují dvojnásobné úrody §díky evropským restrikcím Jones a spol. licencovali své brambory společnosti Simplot, se sídlem v Boise, Idaho § § § § § § § http://www.gate2biotech.cz/geneticky-vylepsene-brambory-opet-vystvany-z-evropy/ 640px-Phytophtora_infestans-effects Nové metody šlechtění „NEW PLANT-BREEDING TECHNIQUES“ odstraňují nevýhodu všech způsobů vzniku transgeneze, tj. cílí na přesné místo na molekule DNA, kde buď vyvolá mutaci, nebo umožní vložení genu §cisgeneze = vkládání genu jako při transgenezi, ale jde o gen vlastního druhu, nebo druhu, se kterým se odrůda kříží §Intrageneze = gen vlastního druhu, jen nové kombinace díky in vitro manipulaci funkčních genetických jednotek §ODM - oligonukleotidem řízená mutageneze §Agro-infiltrace §Reverse-breeding §gene editing, tj. editace, úprava genů (Zinc-finger, TALEN, CRISPR) § Výsledek obrázku pro reverse breeding (Cardi et al. 2017) CRISPR/Cas9 §segmenty nahromaděných pravidelně rozmístěných krátkých palindromických repetic (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) §jsou to úseky prokaryotické DNA obsahující krátké repetice nukleotidů. Každá z repetic je následována krátkými segmenty tzv. spacer DNA, získanými při předchozích setkáních s příslušnými bakteriálními viry nebo plazmidy. §prokaryotický imunitní systém, zajišťující rezistenci vůči cizím genetickým elementům, jako jsou plazmidy nebo fágy § Cas9 je nukleáza, enzym, specializovaný pro stříhání DNA §gRNA je naváděcí RNA se sekvencí nukleotidů odpovídající sekvenci na DNA, kterou chceme upravit Výsledek obrázku pro crispr Doporučené adresy §BIOTRIN je nezisková organizace vytvořená vědeckými pracovníky pro šíření informací o moderních biotechnologiích. § http://www.biotrin.cz/ §vydávají internetový bulletin SVĚT BIOTECHNOLOGIÍ, Bílá kniha §Gate2Biotech – vše o českých biotechnologiích na jednom místě: § http://www.gate2biotech.cz/