Metody transformace I. Agrobacterium tumefaciens Bi8670 Principy rostlinných biotechnologií Geneticky modifikované plodiny ´ovlivnění vlastností rostlin: ´velikost (výnos), textura, sladkost… ´odolnost proti suchu ´rychlost růstu v různých půdních podmínkách ´závislost na hnojivech ´odolnost vůči škůdcům a nemocem ´ ´Dříve pomocí selektivního šlechtění. Jak vytvořit transgenní rostlinu? Obecné schéma transformace §příprava rekombinantní DNA (konstrukt) §vnesení DNA do rostlinné buňky (přímo nebo pomocí vektorů) §test exprese vnesených genů §demonstrace stabilní integrace DNA do rostlinného genomu Genetická modifikace ´Potřebujete: ´znát DNA sekvenci genu, který vás zajímá (gene of interest, GI) ´do blízkosti GI vložit snadno identifikovatelný markerový gen ´oba dva geny vložit do jaderného genomu rostliny ´dobrý zobrazovací postup pro nalezení úspěšné inzerce 20_03MakingRecombinantDNA Tvorba transgenu CODING SEQUENCE INTRON poly A signal PROMOTER Plant Transgene bacterial genes •antibiotic marker •replication origin Plant Selectable Marker Gene Plasmid DNA Construct ON/OFF Switch Makes Protein stop sign Klonování do plasmidu PLASMID The plasmid carrying genes for antibiotic resistance, and a DNA strand, which contains the gene of interest, are both cut with the same restriction endonuclease (EcoRI - EcoRI (pronounced "eco R one") is a restriction endonuclease enzyme isolated from species E. coli The plasmid is opened up and the gene is freed from its parent DNA strand. They have complementary "sticky ends." The opened plasmid and the freed gene are mixed with DNA ligase, which reforms the two pieces as recombinant DNA. Plasmids + copies of the DNA fragment produce quantities of recombinant DNA. This recombinant DNA stew is allowed to transform a bacterial culture, which is then exposed to antibiotics. All the cells except those which have been encoded by the plasmid DNA recombinant are killed, leaving a cell culture containing the desired recombinant DNA. Jak dostat DNA do buňky? Metody transformace (vnášení DNA) přímé nepřímé - pomocí vektorů lipozómy uzavírající DNA elektroporace mikroinjekce DNA do jádra bombardování mikroprojektily vakuová infiltrace s použitím nanovláken Agrobacterium (plazmidy) rostlinné viry modifikovaný bakteriofág L Copyright © 2010 ASM Press American Society for Microbiology 1752 N St. NW, Washington, DC 20036-2904 Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA, Fourth Edition Bernard R. Glick, Jack J. Pasternak, and Cheryl L. Patten Chapter 18 Genetic Engineering of Plants: Methodology asm press logoBW Table 18.1 Glick_ch18 Agrobacterium tumefaciens Půdní bakterie Pseudomonas, Corynebacterium Agrobacterium, Rhizobium, Bradyrhizobium Agrobacterium tumefaciens Agrobacterium rhizogenes nádory kořínky Ti plasmid Ri plasmid T-DNA File:Agro1.JPG http://microbewiki.kenyon.edu/index.php/Agrobacterium Agro_rhizo „crown gall“ „hairy roots“ na segmentu kořene mrkve Transformace rostlin Ti plasmidem Agrobacterium tumefaciens ´A. tumefaciens je gramnegativní půdní bakterie, která přirozeně transformuje rost. buňky, výsledkem jsou nádory „crown gall“ ´Tvorba nádorů je výsledkem přenosu, integrace a exprese genů na specifickém segmentu plasmidu A.t. (T-DNA – transferová DNA) ´ T-DNA je součástí velkého Ti plasmidu(tumor indukujícího) T-DNA Ti plasmidu (WT) 1.geny pro biosyntézu auxinů (iaaM tryptofan monooxygenáza a iaaH indolyl-3-acetamid hydroláza) a cytokininů (ipt izopentenyltransferáza) = dediferenciace buněk a vznik nádorů („crown gall“) 2.geny pro syntézu nádorově specifických látek, tzv. opinů (bazické aminokyseliny: oktopin, nopalin, manopin, agropin, histopin, kukumopin) = zdroj dusíku, uhlíku a energie pro bakterie odzbrojené vektory – odstraněné původní bakteriální geny a vloženy tzv. geny zájmu CrownGallhome Clarence I. Kado University of California, Davis iaaM = tryptofan monooxygenáza iaaH = indolyl-3-acetamid hydroláza Infekce rostliny Agro2 The infection process: 1.Wounded plant cell releases phenolics and nutrients. 2.Phenolics and nutrients cause chemotaxic response of A. tumefaciens 3.Attachment of the bacteria to the plant cell. 4.Certain phenolics (e.g., acetosyringone, hydroxyacetosyringone) induce vir gene transcription and allow for T-DNA transfer and integration into plant chromosomal DNA. 5.Transcription and translation of the T-DNA in the plant cell to produce opines (food) and tumors (housing) for the bacteria. 6.The opine permease/catabolism genes on the Ti plasmid allow A. tumefaciens to use opines as a C, H, O, and N source. Struktura Ti plasmidu Glick4e_18 Mechanismus přenosu T-DNA Ti plasmidu intermediární vektor Agro_infekce Tinland, TIPS 1996 Dnes se intermediární téměř nepoužívá – složitější příprava a relativně méně efektivní než binární vektor = plasmid s T-DNA + pomocný plasmid zajišťující virulenci The binary Ti plasmid system involves using a small T-DNA plasmid and a disarmed (i.e., no T-DNA) Ti plasmid in A. tumefaciens Fig4 Protože nemá vir oblast (ta je na jiném plasmidu), tak je menší a celkově se s ním lépe pracuje, proto oblíbenější Agrobacterium tumefaciens upravený binární vektor LhGR DNA agrobakteria část plazmidu kódující virulenci upravený plasmid Šámalová 2005 Jak dostat GZ do Agrobacterium? E. coli Agrobacterium Plasmid s GZ se integruje do Ti plasmidu homologní rekombinací Rekombinantní Agrobacterium (intermediární vektor) Infekce rostlinných buněk - elektroporace, „freeze/thaw“ metoda, triparentální konjugace Konjugace s Agrobacterium GZ Elektroporace nejúčinější, „freeze/thaw“ metoda neúplně jasný princip, asi vliv narušení buněčné stěny, čímž se umožní průnik plasmidu, triparentální konjugace – jedna E. coli s plasmidem, který umožňuje vytvoření „můstku“ mezi E. coli a Agrobacterium, se konjuguje s E. coli s plasmidem s GI a vzniklá E. coli (se dvěma plasmidy) se konjuguje s Agrobacteriem. Příklady způsobu transformace pomocí Agrobacterium ´Arabidopsis floral dip ´ ´ ´ ´c ´ Výsledek obrázku pro floral dip transformation Výsledek obrázku pro floral dip transformation Agrobacterium rhizogenes geny pro syntézu opinů (manopin, agropin a kukumopin) = zdroj dusíku, uhlíku a energie pro bakterie 2 fragmenty: TL a TR – mohou být vloženy do rostlinného genomu nezávisle na sobě T-DNA Ri (hairy-root inducing) plasmidu (WT) Výsledek obrázku pro Ri plasmid http://slideplayer.com/slide/11366596/ Agrobacterium ´ ´Funguje dobře pro většinu dvouděložných, ale ne tak dobře pro jednoděložné rostliny ´ ´ ´ jiné metody pro transformaci Jak poznám, že došlo k úspěšné inzerci genu? Selekční a signální markery 1. rezistence vůči antibiotikům kanamycin hygromycin gentamycin a cytostatikům (antimetabolika) methotrexát 3. Transgen pro luciferázu. Využívají se cDNA ze světlušky Photinus pyralis nebo kódující sekvence Vibrio harvei. Po dodání substrátu (luciferin, ATP) k rostlinnému extraktu nebo do kultivačního media dochází k emisi záření měřitelného luminimetrem, scintilačním počítačem, CCD kamerou. Luciferin špatně proniká do pletiv, substrát je drahý. 2. Transgen pro beta-glukuronidázu – GUS (Zatím nejúspěšnější reportérový transgen. Vhodné substráty mění na modré produkty nebo fluoreskující látky) Signální (reportérové) geny rostlin - Expresi těchto genů lze snadno detekovat a kvantitativně stanovovat a mohou tudíž sloužit jako měřítko exprese transgenů různými promotory, s různou strukturou, v různých genotypech, různých pletivech a za různých podmínek. 4. GFP („green fluorescent protein“ gen z medúzy Aequorea victoria). Protein GFP přeměňuje modré světlo na zelené. Má schopnost emitovat zelené světlo po ozáření modrým světlem (440-480 nm). Je to jediný protein, který má schopnost fluoreskovat bez dodání substrátu nebo kofaktorů. Zachovává si schopnost fluoreskovat, i když je fúzován s jiným proteinem, a to jak na C-, tak i A-konci. Mutacemi byl změněn chromofor, takže fluoreskované světlo může mít různou vlnovou délku. Původní gen se dobře exprimuje i v živočišných buňkách (lépe jak v rostlinách). V rostlinných buňkách je přítomen v jádře více než v cytoplazmě. Existuje i fúzní protein GFP-GUS, který má obě signální aktivity. U A. thaliana bylo prokázáno, že po ozáření rostlin UV světlem lze fluorescenci pozorovat pouhým okem. Vysoká exprese transgenu však může ovlivňovat životaschopnost rostlin nebo schopnost regenerace. Selekční a signální markery Some plant cell reporter and selectable marker gene systems Enzyme activity Selectable marker Reporter gene Neomycin phosphotransferase (kanr) Yes Yes Hygromycin phosphotransferase (hygr) Yes Yes Nopaline synthase No Yes Octopine synthase No Yes b-glucuronidase (GUS) No Yes Firefly luciferase No Yes b-galactosidase No Yes Bromoxynil nitrilase Yes No Green fluorescent protein (GFP) No Yes selectable marker: A gene, such as one encoding resistance to an antibiotic, that can be used to identify (and select) cells that contain recombinant DNA from among a large population of untransformed cells. reporter gene - characteristics they confer on organisms expressing them are easily identified and measured = screening (no selection, like antibiotics) Bromoxynil nitrilase – hericid bromoxynil, selektivní marker je rezistence k němu (rozkládá ho) Princip rezistence vůči antibiotikům bakteriální gen nptII – neomycinfosfotransferáza - Kóduje protein, který inaktivuje fosforylací širší spektrum aminoglykosidových antibiotik (např. kanamicin, neomycin) https://ka-perseus-images.s3.amazonaws.com/6ce673289a1608e8f6b63ed115bca6395536e508.png - Na médiu s antiobiotiky zůstanou živé pouze bakterie s vneseným plasmidem s genem pro rezistenci Výsledek obrázku pro resistance antibiotics transformation gene nptII je pravděpodobněji nejčastější selektivní marker používaný při transformacích Alternativy ke genů pro resistenci k antiobiotikům -Rostlinný původ genů rezistence k antibiotikům -Geny rezistence k herbicidům -„positivní“ selekční markery - podpora růstu transformovaných rostlin (pěstování na médiu, které má pro netransformované rostliny toxický nebo smrtící efekt nebo schopnost autonomní produkce hormonů nutných pro regeneraci rostlin) -„negativní“ selekční markery – smrtící efekt, změna netoxického substrátu na toxický nebo přímá produkce toxické látky; obvykle zároveň s pozitivní selekcí, např. pro odstranění nežádoucích genů (např. selekční) -Reportérové geny – vizualizace (např. luciferáza, GFP…) -Odstranění markerových genů -Analýza genů po transformaci pomocí PCR pro kontrolu, zda rostliny obsahují transgeny (bez použití selekčních nebo signálních genů) - (Breyer et al. 2014) Nevýhoda transgeneze ´sice umožňuje vložit určitou známou vlastnost ´ale stále neumí přesně lokalizovat vložení transgenu do genomu = je dílem náhody, kam se do genetické mapy vnášený gen zařadí („off-site“) ´vznikají tak náhodné inzerční mutace = mohou způsobovat poškození nebo změnu akivity genu, do kterého se transgen zařadil tento problém řeší nové biotechnologie