BIOCHEMIE I - SEMINÁŘ Vyučující: Doc. Mgr. Pavel Bouchal, Ph.D. Mgr. Kateřina Dadáková, Ph.D. Mgr. Zdeněk Farka, Ph.D. Mgr. Marta Pelcová, Ph.D. Mgr. Vojtěch Sedláček, Ph.D. Garant předmětu: Doc. Mgr. Pavel Bouchal, Ph.D. • Úvod, přehled aminokyselin 14.9.2021 • Acidobazické vlastnosti AK, peptidy 21.9. • Bílkoviny I 5.10. • Bílkoviny II 12.10. • Test 1 19.10. • Termodynamika enzymových reakcí 26.10. • Úvod do enzymové kinetiky 2.11. • Sacharidy a lipidy – struktura 9.11. • Test 2 16.11. • Metabolismus sacharidů 23.11. • Metabolismus lipidů, citrátový cyklus 30.11. • Respirační řetězec a fotosyntéza 7.12. • Test 3 14.12. Opravné termíny zápočtu PROGRAM SEMINÁŘE • Elektronická skripta Úlohy z biochemie, V. Mikeš • Prezentace (IS MU: Studijní materiály/Učební materiály) LITERATURA • Účast ve výuce: povolena 1 neomluvená absence (další případné absence => omluva přes studijní oddělení) • Testy (3), min. 70 % z celkového počtu bodů => zápočet v řádném termínu • V případě omluvené absence v době testu nárok na nahrazovací termín testu – jeden termín první týden v lednu • Souhrnný test z učiva celého předmětu => zápočet v 1. (2.) opravném termínu PODMÍNKY ZÍSKÁNÍ ZÁPOČTU Zdroje obrázků: Voet D., Voetová J.G.: Biochemie. Victoria Publishing Praha, 1995. Potáček, M.: Organická chemie pro biology. Masarykova univerzita, Brno 1995. Mikeš, V.: Úlohy z biochemie. Elektronická skripta. PROKARYOTICKÁ BUŇKA EUKARYOTICKÁ BUŇKA - ŽIVOČIŠNÁ EUKARYOTICKÁ BUŇKA - ROSTLINNÁ HIERARCHIE BIOLOGICKÝCH STRUKTUR C H NH2 R COOH CH3 CH2CH H3C H3C N CH2 H CH OH H3C H2N CH2 CH2 CH2 CH2 CH3 S CH2 CH2 HOOC CH2 CH2 HS CH2 CH2HOOC CH2HO C CH2 O CH2 H2N C CH2 O H2N CH H3C H3C CH2HO CH2 C NHH2N NH CH2 CH2 CH2 NHN CH2 CH2 CH2 CH2 CH NH COOH Gly Ala Val Leu Ile Trp Phe Tyr Ser Thr Cys Met Asp Glu Asn Gln Lys Arg His Pro CH2HSe SeCys CH CH2 H3C H3C PŘEHLED AMINOKYSELIN JEDNO- A TŘÍPÍSMENNÉ ZKRATKY AMINOKYSELIN I. DISOCIACE KARBOXYLOVÉ SKUPINY A AMINOSKUPINY pKa1 pKa2 R-CH-COOH  R-CH-COO-  R-CH-COO   NH3 + NH3 + NH2 II. DISOCIACE BOČNÍHO ŘETĚZCE pKa3 1. -R nedisociuje 2. -RH  -R- KYSELÉ AK: protonovaná forma je nenabitá 3. -RH+ -R BAZICKÉ AK: protonovaná forma je kladně nabitá Typ disociace bočního řetězce a jeho náboj při daném pH lze rozlišit pouze na základě znalosti jeho chemické struktury!!! DISOCIACE AMINOKYSELIN AK pKa1 pKa2 pKa3=pKa bočního řetězce • Ala 2.3 9.9 • Gly 2.4 9.8 • Phe 1.8 9.1 • Ser 2.1 9.2 • Val 2.3 9.6 • Asp 2.0 10.0 3.9 -COOH • Glu 2.2 9.7 4.3 -COOH • His 1.8 9.2 6.0 -imidazolium • Cys 1.8 10.8 8.3 -SH • Tyr 2.2 9.1 10.9 -fenol • Lys 2.2 9.2 10.8 -NH3+ • Arg 1.8 9.0 12.5 -guanidinium • Asn 2.0 8.8 • Gln 2.2 9.1 • Trp 2.4 9.4 • Leu 2.4 9.6 • Ile 2.3 9.6 • Met 2.3 9.2 • Thr 2.2 9.1 • Pro 2.0 10.6 NH2 + N CH2 C NHH2N NH2 + CH2 CH2 CH2 DISOCIAČNÍ KONSTANTY AMINOKYSELIN TITRAČNÍ KŘIVKA GLYCINU PŘEHLED MONOSACHARIDŮ VYBRANÉ DISACHARIDY UZAVÍRÁNÍ CYKLU: ALDOSY UZAVÍRÁNÍ CYKLU: KETOSY VYBRANÉ CHEMICKÉ VLASTNOSTI MONOSACHARIDŮ PŘEHLED AEROBNÍHO METABOLISMU 3 24 25 Metabolismus a biosyntéza sacharidů GLYKOLÝZA – VARIANTY A BILANCE Metabolismus a biosyntéza sacharidů hexokinasa glukosa-6-fosfát fruktosa-6-fosfát fruktosa-1,6-bisfosfát dihydroxyaceton- fosfát glyceraldehyd- fosfát 1,3-bisfosfoglycerát 3-fosfoglycerát 2-fosfoglycerát pyruvát fosfoenolpyruvát C2H5OH + CO2 CO2 + H2O + ATP fosfofruktokinasa aldolasa # glyceraldehydfosfátdehydrogenasa fosfoglycerátkinasa fosfoglycerátmutasaenolasa pyruvátkinasa glukosafosfát isomerasa anaerobní glykolýza, mléčné kvašení aerobní oxidace laktát DH GLYKOLÝZA – PRŮBĚH anaerobní alkoholové kvašení #=triosafosfátisomerasa Metabolismus a biosyntéza sacharidů GLYKOLÝZA vs. GLUKONEOGENEZE Metabolismus a biosyntéza sacharidů CORIHO CYKLUS PENTOSOVÝ CYKLUS CH3-CO-COO- pyruvát CoA + NAD+ CO2 + NADH oxidační dekarboxylace citrát- synthasa akonitasa isocitrát DH α-oxoglutarát DH sukcinyl CoA synthetasa sukcinát DH fumarát DH malát DH pyruvát DH KREBSŮV CYKLUS GLYOXYLÁTOVÁ DRÁHA Metabolismus a biosyntéza lipidů ŽLUČOVÉ KYSELINY A CHOLESTEROL Metabolismus a biosyntéza lipidů β-OXIDACE MASTNÝCH KYSELIN Metabolismus a biosyntéza lipidů BIOSYNTÉZA MASTNÝCH KYSELIN Metabolismus a biosyntéza lipidů ROZDÍLY MEZI β-OXIDACÍ A BIOSYNTÉZOU MASTNÝCH KYSELIN Metabolismus a biosyntéza lipidů ŠTĚPĚNÍ FOSFOLIPIDŮ: FOSFOLIPASY Respirační řetězec TRANSPORT ELEKTRONŮ DO MITOCHONDRIÁLNÍ MATRIX Respirační řetězec RESPIRAČNÍ ŘETĚZEC Respirační řetězec RESPIRAČNÍ ŘETĚZEC Respirační řetězec RESPIRAČNÍ ŘETĚZEC Respirační řetězec H+ RESPIRAČNÍ ŘETĚZEC – TVORBA ATP ADP + Pi ATP Fotosyntéza FOTOSYNTÉZA: 1. SVĚTELNÁ FÁZE PS 680 PS 680* PS 700 PS 700* Fotosyntéza FOTOSYNTÉZA: 2. TEMNOSTNÍ FÁZE= CALVINŮV CYKLUS (tvorba glukosy) (->glukosa…) BIOCHEMIE II - SEMINÁŘ Vyučující: Doc. Mgr. Pavel Bouchal, Ph.D. Mgr. Kateřina Dadáková, Ph.D. Mgr. Zdeněk Farka, Ph.D. Mgr. Marta Pelcová, Ph.D. Garant předmětu: Doc. Mgr. Pavel Bouchal, Ph.D. 1. Nukleové kyseliny: Nukleové báze, nukleotidy, primární struktura NK. Sekvenování DNA 2. Replikace, transkripce, translace a proteosyntéza. Genetický kód. Úvod do molekulární biologie 3. Polymerázová řetězová reakce (PCR) a její využití. Genové manipulace 4. Test 1 5. Redoxní reakce 6. Opakování a výpočty k metabolismu a biosyntéze I 7. Opakování a výpočty k metabolismu a biosyntéze II 8. Test 2 9. Metabolismus bílkovin a aminokyselin, močovinový cyklus a metabolismus dusíku 10. Metabolismus 2-oxokyselin a biosyntéza aminokyselin 11. Principy metabolických regulací 12. Test 3 Opravné termíny zápočtu PROGRAM SEMINÁŘE Vše v IS MU: Studijní materiály/Učební materiály -prezentace -skripta V. Mikeš: Cvičení z biochemie LITERATURA • Účast ve výuce: max. 1 neomluvená absence (více absencí: omluvenka v IS MUNI prostřednictvím studijního oddělení) • Testy (3), min. 70% z celkového počtu bodů => zápočet v řádném termínu • Souhrnný test z učiva celého semestru => zápočet v 1. (2.) opravném termínu PODMÍNKY ZÍSKÁNÍ ZÁPOČTU 49 PRIMÁRNÍ STRUKTURA NUKLEOVÝCH KYSELIN G Provede se štěpení před: G (DMS/T) G+A (H+/T) C (hydrazin, 5M NaCl) C+T (hydrazin) Příklad: 5´ 3´ 32P-TGTAGGAGCT Štěpení před G (DMS/T) vede ke vzniku fragmentů: 32P-TGTAGGAGCT 32P-TGTAGGAGCT 32P-TGTAGGAGCT 32P-TGTAGGAGCT K jiným souborům fragmentů povedou štěpení před G+A, před C a před C+T. MAXAM-GILBERTOVA METODA SEKVENOVÁNÍ NUKLEOVÝCH KYSELIN MAXAM-GILBERTOVA METODA SEKVENOVÁNÍ NUKLEOVÝCH KYSELIN DETEKCE FRAGMENTŮ SEPAROVANÝCH ELEKTROFORÉZOU NA FOSFORIMAGERU (detekce radioaktivity - vizualizovány jsou pouze 32P značené fragmenty) G+A G C+T C ________________________________ start ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ Biochemie nukleových kyselin Biochemie nukleových kyselin Biochemie nukleových kyselin GENETICKÝ KÓD mRNA U PROKARYOT RESTRIKČNÍ ENDONUKLEASY • štěpí dsDNA v místě určité sekvence – původně ochrana bakterií proti bakteriofágům – namethyluje si určité sekvence vlastní DNA pomocí specifické methyltransferasy, produkuje restrikční endonukleasu, která štěpí v dané sekvenci, pokud není methylována – což u bakteriofága není – jeho DNA bude poškozena • typ II užitečný pro genové inženýrství – štěpí v místě „své“ sekvence dlouhé 4 – 8 bazí (typy I a II štěpí dále od cílové sekvence) – vznikají tak „lepivé“ konce; dnes známo 4000 těchto enzymů a popsáno 270 cílových sekvencí, komerčně dostupné – název dle produkující bakterie / serotypu a číslo – kolikátý to je • BamHI G↓GATCC Bacillus amyloliquefaciens H • EcoRI G↓AATTC Escherichia coli RY13 • EcoRII ↓CC(T/A)GG Escherichia coli R245 • EcoRV GAT↓ATC Escherichia coli J62 pLG74 • HaeII RGCGC↓Y Haemophilus aegyptius • HindIII A↓AGCTT Haemophilus influenzae Rd • PstI CTGCA↓G Providencia stuartii 164 Genové manipulace PALINDROM • rozpoznávané sekvence restriktas jsou typicky palindromické – čtou se stejně z obou konců dsDNA • EcoRI G↓AATTC • tím vznikají částečně přečnívající jednořetězcové konce – lze je spojit s jinými fragmenty DNA, připravenými pomocí stejné restriktasy • slouží při klonování pro vpravení cílové DNA do vektorů • získá se rekombinantní DNA; spojení kovalentní vazbou – DNA ligasa Genové manipulace GENOVÉ INŽENÝRSTVÍ • úseky DNA mohou být klonovány reprodukovány v hostitelském organismu – klonování – produkce mnoha identických jedinců odvozených z jediného společného výchozího předka – ovce Dolly – naklonovaná technikou přenosu jádra ze somatické buňky • rekombinantní DNA technologie dokáže změnit geny pro produkci proteinů nebo vytvářet transgenní organizmy – molekulární klonování či genové inženýrství – umožnily izolovat, zmnožit a měnit specifické DNA sekvence Genové manipulace AMPLIFIKACE ÚSEKU DNA • určitý fragment DNA vytvořený štěpením restrikčním enzymem, PCR amplifikací nebo chemickou syntézou • fragment vnesen do pomocné DNA molekuly – vektoru: plasmidy – kruhové DNA molekuly od 1 po 200 kb z bakterií nebo kvasinek – molekulární „paraziti“: využívají replikační aparát buňky (i eukaryotické) – hostiteli mohou dodat užitečnou funkci, např. rezistenci k antibiotikům u bakterií, čehož se využívá při molekulárním klonování – konstrukce v laboratoři – rel. malé, snadná replikace, geny pro selekci pomocí antibiotik, restrikční místa pro vpravení DNA fragmentů, komerčně dostupné viry – pro infekci buněk cizorodou DNA (např. plasmidem) – lentiviry, adenoviry – pro infekci eukaryotických buněk – bakuloviry - pro infekci hmyzích buněk – bakteriofágy – pro infekci bakterií umělé chromosomy z bakterií (BACs) či kvasinek (YACs) – pro velmi dlouhé DNA • modifikovaný vektor s vloženou DNA inkorporován do buněk, ty po selekci kultivovány a vektor replikován • vektor může sloužit také k získání RNA a produkci proteinu PLASMID (PŘÍKLAD) • klonovací vektor pUC18 (E. coli) pro DNA do 10 kb – (pUC .. plasmid Universal Cloning) • 13 restrikčních míst, polylinker – tam se vpraví úsek DNA • ampR gen rezistence k ampicilinu • lacZ gen kódující β-galaktosidasu • transformace bakterie = vstup plasmidu do bakteriální chemokompetentní buňky (teplotní šok) • v přítomnosti antibiotika přežijí pouze transformované bakterie (díky vektorem vneseným genům rezistence) • detekce inkorporace úseku DNA: inkorporací úseku do polylinkeru se přeruší gen pro galaktosidasu, který pak produkuje nefunkční enzym, pro ověření se provede test aktivity se substrátem X-gal: – aktivní – modré zbarvení – DNA se neinkorporovala – neaktivní – bílé kolonie – DNA se inkorporovala a inaktivovala tak β-galaktosidasu Genové manipulace „MODROBÍLÝ“ SCREENING • chromogenní substrát pro Gal EXPRESE KLONOVANÝCH GENŮ • expresní vektor je podobný klonovacímu, ale navíc obsahuje sekvence nutné pro transkripci a translaci v hostitelské buňce – promotor pro RNA polymerasu, vazebné místo pro ribosom, terminační sekvence – inducibilní systémy: vektor obsahuje promotor indukovatelný isopropylthiogalaktosidem (IPTG), kterým lze spustit expresi cílového genu – následuje transkripce vloženého genu na mRNA a její translace • vytvářený protein (až 30% podíl) může buňky negativně ovlivnit a je tudíž často ukládán do inkluzních tělísek – bakterie tak inaktivuje cizorodé proteiny • problém exprese eukaryotických proteinů v bakteriích: chybí posttranslační modifikace (např. glykosylace) - exprese v kulturách hmyzích či živočišných buněk • využití: produkce proteinů, funkční studie proteinů (transfekce) Genové manipulace PURIFIKACE REKOMBINANTNÍCH PROTEINŮ • do genu daného proteinu se na konec přidá sekvence kódující „tag“: např. „oligohistidine tag (H6)“ – snadná izolace metaloafinitní chromatografií – chelát s Ni2+ ionty vázanými na nosné matrici (afinitní chromatografie na kolonce, magn. částicích, …) RNAi (interference) • přirozený mechanismus regulace genové exprese • dsRNA blokuje expresi genů sekvenčně-specifickým způsobem („gene silencing“) • dicer – RNA nukleasa (RNasa) třídy III se váže na dsRNA a štěpí ji na malé fragmenty siRNA – (small interfering, 22 až 25 nt) • ty potom vytvoří komplex RISC s dalšími proteiny (RNA-induced silencing complex), naváží se na mRNA se sekvencí odpovídající siRNA a degradují ji • využití ve výzkumu: umlčení exprese genů ve funkčních studiích proteinů Genové manipulace CRISPR/Cas9 • pro cílené editování genomu libovolného organismu – „clustered regularly interspaced short palindromic repeats“ – jednoznačné určení místa zásahu, efektivní funkce, snadné, cenově dostupné • používá „ short guide RNA“ pro přesné navedení Cas9 nukleasy k místně specifickému rozštěpení dsDNA (vybraného genu) – pro štěpení je nezbytný protospacer adjacent motif (PAM): 3-nt motiv 5´-NGG-3´ bezprostředně na konci cílové oblasti – vzniklý dvojřetězcový zlom DNA je pak buňkou opraven pomocí jednoho z následujících mechanismů: NHEJ (non-homologous end joining DNA repair) vede k inzerční / deleční mutaci – posun čtecího rámce – vyřazení genu (gene knock-out); HDR (homology directed repair) může vložit sekvenci dle dodaného opravného templátu Genové manipulace sgRNA (short guide RNA) obsahuje cílově specifickou crRNA a pomocnou trans-aktivační trancrRNA (váže Cas9 nukleázu) Genové manipulace MOŽNOSTI CRISPR/Cas9 • editace genomu – inaktivace vybraných genů • inhibice / aktivace (CRISPR interference) – použití „mrtvé“ dCas9 eliminuje štěpení DNA, ale zachová schopnosti zacílit požadovanou sekvenci – lze přidat různé regulační faktory k dCAS9 a tak zapnout / vypnout gen či nastavit úroveň jeho aktivity – CRISPRi inhibuje geny reverzně (podobné RNAi) • tvorba modelových organismů - napodobují onemocnění nebo nesou fenotypové znaky způsobené utlumením genu či jeho mutací – na úrovni zárodečné linie pro vytvoření jedinců se změněným genem ve všech buňkách – nezárodečné linie buněk - lidské pluripotentní kmenové buňky, zavádění cílených mutací • biomedicína - zacílení virulent. faktorů, genů rezistence na antibiotika – nová forma antimikrobiální terapie, manipulace bakteriální populace. – omezení replikace herpes virů, odstranění DNA viru Epstein-Barrové (virová deplece) Genové manipulace GENOVÁ TERAPIE • transfer nového genetického materiálu do buněk jednotlivců pro léčebné účely – aby byla změna trvalá, musí se inkorporovat do genomu úspěchy: • posílení nebo fakticky obnovení funkce dětského imunitního systému – „bubble boy syndrome“ – život v izolaci – do buněk kostní dřeně pacienta vnesen gen pro γ-C cytokinový receptor, léčba SCID-X1 (severe combined immunodeficiency disease) – cytokiny – signalizační peptidy produkované v různých buňkách, v imunitním systému, tam ovlivňují růst, diferenciaci a chování buněk • Leuberova kongenitální amaurosie – vzácná forma slepoty • X adrenoleukodystrofie – defektní membránový protein – poškození mozku • β-thalasemie – forma anemie • problémy – vektor – typicky retrovirus – může ovlivnit imunitní systém, náhodné včlenění může vést až ke zhoubnému bujení – 2 děti vyléčené na SCID-X1 dostaly leukemii.. Genové manipulace ETICKÉ ASPEKTY • 1970 – počátky genového inženýrství, o bezpečnosti experimentů málo poznatků – moratorium do vzniku regulačních pravidel a legislativy • zakázány jasně nebezpečné pokusy – vložení genu pro toxin do E. coli – ze symbionta lidského organismu by se stal nebezpečný patogen • hrozba úniku potenciálně nebezpečných GMO do volného prostředí – mnohé potřebují k životu velmi speciální podmínky či živiny a mimo laboratoř nepřežijí • nicméně řada experimentů napodobuje přirozené procesy – mutace a selekce – šlechtitelství probíhá po staletí • nové aspekty – růstový hormon se rutinně dává dětem s malým vzrůstem; má se dávat také atletům či jiným výkonostním sportovcům pro zvětšení výšky a výkonnosti? – léčba geneticky podmíněných onemocnění přijímána jasně pozitivně – má se odstranění poruchy ale přenést i na potomky? – použít výsledky genetických testů pro výběr studia, selekci uchazečů, nastavení pojistných podmínek, …? Genové manipulace PŘEHLED AEROBNÍHO METABOLISMU MECHANISMY DEAMINACE TRANSAMINACE E: ALT … alaninaminotransferasa, AK + E --------> 2-oxokyselina + E-NH2 AST … aspartátaminotransferasa,… 2-oxoglutarát + E-NH2 --------> E + glutamát glutamát + oxalacetát --------> 2-oxoglutarát + aspartát OXIDAČNÍ DEAMINACE NAD(P)+ NAD(P)H +H+ glutamát ----------------> 2-oxoglutarát + NH4 + glutamátdehydrogenasa DALŠÍ MECHANISMY DEAMINACE AK + FAD + H2O --------> 2-oxokyselina + NH4 + + FADH2 FADH2 ---------> FAD + H2O2 MOČOVINOVÝ CYKLUS METABOLISMUS 2-OXOKYSELIN Metabolismus bílkovin a aminokyselin MOČOVINOVÝ CYKLUS Metabolismus bílkovin a aminokyselin METABOLISMUS AMINOKYSELIN A JEJICH 2-OXOPRODUKTŮ Metabolismus bílkovin a aminokyselin METABOLISMUS AMINOKYSELIN A JEJICH 2-OXOPRODUKTŮ (II) AMINOKYSELINY V ROLI BIOLOGICKÝCH PREKURZORŮ • z Gly+acetátu: hem hem > žlučová barviva • fyziologicky aktivní aminy z Tyr: adrenalin (hormon) noradrenalin (hormon) dopamin (neurotransmiter) z Trp: serotonin (neurotransmiter) z Glu:γ-aminomáselná kyselina (GABA) (neurotransmiter) z His: histidin -----> histamin (alergie) PLP-dependentní histaminkarboxylasa inhibitory: antihistaminika Metabolismus bílkovin a aminokyselin AMINOKYSELINY V ROLI BIOLOGICKÝCH PREKURZORŮ • koenzymy biotin: přenos C1 štěpů v rámci karboxylační reakce oxalacetát > pyruvát tetrahydrofolát: podobná funkce součástí THF je: skupina odvozená od p-aminobenzoové kyseliny podvodná analoga (terapeutický přístup): metotrexát (cytostatikum) sulfonamidy (antibakteriálně působící chemoterapeutika) Metabolismus bílkovin a aminokyselin HEMOGLOBIN (Hb) • přenos kyslíku v krvi – nepolární – málo rozpustný (3,2 ml na 1 l krve) • hemoglobin = hlavní přenašeč O2 z plic do tkání a CO2 z tkání do plic • v krvi 140-180 (m) / 120-160 g/l (ž), kapacita 220 ml O2 na 1 l krve – ostatních proteinů v plazmě je pouze 50-80 g/l – reprezentuje podstatnou část pufrační kapacity krve • tetramer, 2 podjednotky α (lehké řetězce, 141 AK) a 2 podjednotky β (těžké řetězce, 146 AK) • symbolicky jako α2β2 • označuje se HbA (adult) – ev. HbA1 pro odlišení od minoritního (2,5%) HbA2 o složení α2δ2 • jiné přenašeče O2 – myoglobin – v cytoplasmě, monomerní, bezobratlí Principy metabolických regulací STRUKTURA Hb • v každé podjednotce je vázán jeden hem jako prosthetická skupina • koordinační vazba Fe2+ na zbytky His • přímo na proximální His 93, zprostředkovaně na distální His 64, tam se alternativně váže molekula kyslíku Principy metabolických regulací HEM • 4 spojené pyrolové cykly spojené methinovými můstky = protoporfyrin IX, plus centrální atom železa (FeII) pak tvoří hem • planární struktura, zapadá do hydrofobní kapsy proteinové části • oxidací železa na FeIII vzniká hemin, Hb se mění na methemoglobin • páté koordinační místo železa se váže na His (F8, osmá AK v helikálním segmentu F), proximální His - 93 • šestá pozice Fe slouží k vazbě O2, také zde vzdáleně působí další His (E7) – distální - funkce závory regulující vstup O2 Principy metabolických regulací VAZBA O2 • tak vzniká oxyhemoglobin • kyslík se neváže ideálně kolmo k rovině hemu v Hb, ale pod úhlem asi 120o – platí pro Hb – stericky brání His E7; u volného hemu se kyslík váže kolmo • vratný proces Hb + O2 = Hb.O2 • má to význam – snížit pevnost vazby dalších možných molekul – oxid uhelnatý CO • volný hem má k CO 25 000x vyšší afinitu než k O2, nutnost k šikmé vazbě CO u Hb to sníží „jen“ na 250x, i tak je ale CO velmi nebezpečný a otravy jsou celkem běžné; Hb.CO – karbonyl-Hb • výrazné spektrální projevy • Hb bez kyslíku … deoxyhemoglobin Principy metabolických regulací PŘENOS O2 • fyziologickou funkcí Hb je přenos kyslíku v krvi – z plic ev. žaber do tkání • stupeň nasycení Hb kyslíkem – poměr [HbO2]/([HbO2] + [Hb]) závisí na jeho parciálním tlaku pO2 v okolním prostředí – červená křivka (torr = 133 Pa) • Hb se sytí kyslíkem v plicích, uvolňuje ho v tkáních • interakce Hb (tetramer) s kyslíkem je kooperativní - vyšší efektivita procesu • navázáním první molekuly kyslíku na jeden hem dochází ke konformační změně vedoucí ke zvýšení afinity zbylých vazných míst pro kyslík – proti monomernímu myoglobinu, ten je bez kooperativity, modrá – křivka Principy metabolických regulací • oxygenovaná forma Hb – dojde k pootočení αβ protomer o 15o, a tím se přiblíží β podjednotky – základem efektu změna konformace vyvolaná vazbou O2 na FeII jedné z podjednotek – Fe za sebou táhne His 93 a s ním celé raménko (úsek) F příslušného řetězce, které pak jako páka způsobí konformační změnu celé molekuly hemoglobinu ALOSTERICKÉ CHOVÁNÍ Hb oxy-Hb deoxy-Hb KONFORMAČNÍ STAVY • změna se přenese na ostatní podjednotky a molekula Hb přechází z těsnější konformace T (tense) s nízkou afinitou ke kyslíku do uvolněné R (relaxed) s vyšší afinitou • toto chování je jedním z typů allosterie • detailní interakce na rozhraní α-β podjednotek při alosterii • na alosterické chování Hb mají vliv i metabolity – 2,3-bisfosfoglycerát (BPG) který se váže na deoxy-Hb • objeveno tak, že purifikovaný („stripped“) Hb se chová ke kyslíku jinak než Hb v krvi – kde jsou přítomny CO2, BPG, také vliv pH Principy metabolických regulací VLIV BPG NA Hb • váže se pevně na deoxy-Hb, ale jen slabě na oxy-Hb, snižuje afinitu Hb ke kyslíku • fyziologicky důležité – zvýšení kapacity pro přenos – v arteriální krvi (pO2 100 torr), Hb je na 95% saturován O2, ale ve venosní krvi (pO2 30 torr) je pouze 55% saturace • průchodem přes kapiláry tedy Hb předá 40% vázaného O2 – bez BPG by se vázaného O2 uvolnilo jen velmi málo, protože afinita Hb k O2 by byla zvýšená díky posunu saturační křivky k nižším hodnotám pO2 Principy metabolických regulací VLIV pH A CO2 • kromě pH je patrný také vliv CO2 • množství využitelného kyslíku se zvýší o dalších asi 11% • Hb je slabší kyselinou než HbO2 • vazba 1 molekuly O2 tedy vede k uvolnění asi 0,6 H+ • naopak zvýšení pH v plicích dále stimuluje vazbu O2 - Bohrův efekt • význam i pro transport CO2 • v metabolismu vznikající CO2 reaguje velmi pomalu na hydrogenuhličitan: CO2 + H2O == H++ HCO3 • reakci významně zrychlí karbonátanhydrasa v erytrocytech • v kapilárách se uvolnění H+ váže na Hb při přechodu na T formu • v plicích je hodně kyslíku, Hb přechází na R formu, H+ se zase uvolní a podpoří vznik CO2 a jeho uvolnění Principy metabolických regulací BOHRŮV EFEKT • také to pomáhá u velmi aktivních svalů rychlé uvolňování laktátu – snížení pH u procházející krve ze 7,4 na 7,2 – k dalšímu posunu saturační křivky a uvolnění trochu více kyslíku • CO2 se může u krevních proteinů vázat na terminální NH2: R—NH2 + CO2 == R—NH—COO- + H+ • T forma Hb váže CO2 více než R forma, a uvolněné protony opět trochu (5%) přispějí k uvolnění kyslíku Principy metabolických regulací FETÁLNÍ HbF • vyšší afinita HbF pro kyslík umožňuje jeho přečerpávání z placentární krve do krve plodu • HbF – α2γ2 • slabší afinita k BPG – vyšší afinita ke kyslíku – His 143 nahrazen Ser • regulace syntézy podjednotek - po porodu kyslík – syntéza β Principy metabolických regulací PATOLOGICKÉ Hb • mutace v řetězcích Hb, například HbS: • záměna Glu-6 za Val vytváří nepolární oblast • místo tetrameru řetízkové aglomeráty • projev změna tvaru erytrocytů na srpkovité • sickle cells (… anemia) Principy metabolických regulací SRPKOVITÁ ANEMIE • fysiologický projev – 10 odvozených poruch • nedokonalý transportu kyslíku – odtud název • nevhodný tvar, životnost jen 20 dní (120 u normálních), blokování cév • komplikace – malá výkonnost; ale také výhoda – odolnost proti malárii (Plasmodium falciparum) • korelace výskytu genu s rozšířením malárie Principy metabolických regulací