9. F O T O M E T R I C K Á T I T R A C E 9.1. Standardizace 0,01M roztoku chelatonu III na navážku PbCl[2] Roztok PbCl[2] se titruje odměrným roztokem (Na[2]H[2]Y) na indikátor xylenolovou oranž. Chelát xylenolové oranže s Pb^2+ (PbInd) je tmavě červenofialový, absorpční křivka má maximum při vlnové délce 580 nm, zbarvení volného indikátoru (Ind^2-) je za podmínek titrace jasně citrónově žluté s maximem absorbance při vlnové délce 430 nm. Titrace probíhá při pH = 5 - 6 (tlumivý roztok urotropinu). PbInd + H[2]Y^2^- ® PbY^2^- + 2H^+ + Ind^2- λ = 580nm PbCl[2] + H[2]Y^2- ® PbY^2- + 2 H^+ + 2 Cl- M(PbCl2) = 278,10 g/mol 9.1.1. Příprava roztoku standardu Na analytických vahách odvážit s přesností na jednu desetinu mg přibližně 70 mg chloridu olovnatého. Navážku kvantitativně převést do kádinky o objemu 100 ml, doplnit destilovanou vodou asi na 50 ml a okyselit 2–3 kapkami 2 M HNO[3]. Takto připravený roztok zahřát (nevařit!), po rozpuštění PbCl[2] kvantitativně převést do odměrné baňky o objemu 200 ml a doplnit destilovanou vodou po rysku. 9.1.2. Výpočet předpokládané teoretické spotřeby: kde: m je hmotnost navážky PbCl[2] v mg, M je molární hmotnost PbCl[2], c je koncentrace Chelatonu III (0,01 mol.l^-1). Číslo 20 ve zlomku představuje faktor zředění, protože budeme titrovat vždy 10 ml připraveného roztoku standardu, tj. 1/20 z 200 ml. 9.1.3. Orientační titrace s vizuální indikací Do kyvety fotometru o objemu 30 ml s míchadlem napipetovat 10 ml roztoku standardu, 10 ml destilované vody, 3 kapky 10% roztoku urotropinu (tlumivý roztok) a špachtlí přidat malé množství směsi xylenolové oranže s KNO[3] tak, aby roztok byl zřetelně slabě fialový. Kyvetu s roztokem promíchat mírnými otáčkami na magnetické míchačce Pomocí mikropipety do kyvety přidávat odměrný roztok Chelatonu III po 0,1 ml a za stálého míchání vizuálně pozorovat roztok až do přechodu barvy z fialové do čistě žluté. 9.1.4. Fotometrická titrace Do kyvety fotometru o objemu 30 ml s míchadlem napipetovat 10 ml roztoku standardu, 10 ml destilované vody, 3 kapky 10% roztoku urotropinu (tlumivý roztok) a špachtlí přidat malé množství směsi xylenolové oranže s KNO[3] tak, aby roztok byl zřetelně slabě fialový. Kyvetu s roztokem promíchat mírnými otáčkami na magnetické míchačce Po přidání správné množství indikátoru je absorbance roztoku před započetím titrace při λ = 580 nm v rozmezí 0,6 až 0,9 (roztok je zřetelně světle fialový s přechodem do žlutého zbarvení). Při vlastní titraci je třeba přidávat odměrný roztok nejprve po 0,2 ml a zaznamenávat absorbanci. Po přiblížení k předpokládanému bodu ekvivalence na ±0,1 ml, je třeba snížit objem přidávaného činidla dle potřeby až na 0,01 ml (nejmenší objem, který lze dávkovat mikropipetou 10 – 100 µl). Titraci opakovat třikrát. 9.1.5 Zpracování výsledků Pro každou titraci sestrojit grafickou závislost absorbance titrovaného roztoku na objemu přidávaného činidla, kde : · na vodorovnou osu vynést objem přidávaného odměrného činidla v ml · na svislou osu odpovídající hodnoty absorbance titrovaného roztoku Graficky zjistit spotřebu odměrného činidla v bodě ekvivalence proložením jedné přímku několika body těsně před koncovým zlomem křivky a druhé přímky několika body za koncovým zlomem křivky. Z průsečíku těchto přímek spustit kolmici k vodorovné ose a odečíst spotřebu odměrného činidla. Při zjišťování bodu ekvivalence se vychází z principu, že od okamžiku dosažení ekvivalence se zbarvení roztoku nemění, proto je třeba zjistit okamžik vymizení barvy indikátorového komplexu. Výpočet přesné koncentrace (titru) odměrného činidla Pro každou hodnotu graficky získaného objemu titračního činidla v bodě ekvivalence spočítat přesnou koncentraci odměrného činidla v mol.l^-1 : kde: m[PbCl2] je navážka PbCl[2] v mg, V[ekv][ ] objem odměrného činidla v bodě ekvivalence v ml, M[PbCl2] je molární hmotnost PbCl[2] v g.mol^-1 (M = 278,10 g.mol^-1) Statistické zpracování výsledků Ze získaných hodnot sestavit do protokolu následující tabulku: λ = 580 nm poř. číslo titrace 1 2 3 V[ekv ][ml] c[ChelIII] [mol.l^-1] průměr c[ChelIII] [mol.l^-1] s(c[ChelIII]) [mol.l^-1] rel.směr.odchylka c[ChelIII] Výpočet směrodatné odchylky s provést podle Deana a Dixona z rozpětí (viz text na konci úlohy). Pro další výpočty používat přesnou koncentraci se čtyřmi platnými ciframi. 9.2 Titračně fotometrické chelatometrické stanovení kationtu Cu^2+ v neznámém vzorku 9.2.1. Fotometrická titrace neznámého vzorku obsahujícího Cu^2+ Reakce probíhá při mírně zásaditém pH nepřekračujícím hodnotu 8. Tohoto pH lze dosáhnout přídavkem amoniakálního tlumiče. Měď tvoří s murexidem chelát žluté barvy (CuInd). Při titraci roztokem Chelatonu III se nejprve na Chelaton III vážou volné ionty Cu^2+, chelát CuY^2- je modrý. V okolí bodu ekvivalence dojde k barevné změně způsobené reakcí Volný indikátor má při daném pH modrofialovou barvu. 1 mol Na[2]H[2]Y » 1 mol Cu^2+ M(Cu) = 63,546 g.mol^-1 Příprava vzorku Neznámý vzorek ve 100 ml odměrné baňce doplnit po značku destilovanou vodou a dobře promíchat. Orientační titrace s vizuálním pozorováním barevné změny Do kyvety fotometru o objemu 30 ml s míchadlem napipetovat 10 ml destilované vody, špachtlí přidat indikátor murexid, promíchat na magnetické míchačce (roztok se zbarví do středně syté oranžové barvy) a poté přidat 10 ml roztoku vzorku s neznámým obsahem mědi. Připravený roztok by měl být zbarven žlutozeleně až žlutooranžově. Pomocí mikropipety do kyvety přidávat odměrný roztok Chelatonu III po 0,1 ml a za stálého míchání vizuálně pozorovat změny zbarvení roztoku. Těsně před předpokládaným bodem ekvivalence je nutné přidat 1 kapku amoniakálního tlumiče a titrovat až do přechodu do čistě fialového zbarvení. Nastavení fotometru Před každou změnou vlnové délky je potřeba provést pro určenou vlnovou délku nastavení fotometru při vložené srovnávací kyvetě s destilovanou vodou. Příprava roztoku k fotometrické titraci Do kyvety fotometru o objemu 30 ml s míchadlem napipetovat 10 ml destilované vody, špachtlí přidat indikátor murexid, promíchat na magnetické míchačce a poté přidat 10 ml roztoku vzorku s neznámým obsahem mědi. Připravený roztok bude žlutozelený až žlutooranžový. Po přidání správné množství indikátoru je absorbance roztoku před započetím titrace při λ = 460 nm v rozmezí 0,4 až 0,6. Titrace Při vlastní titraci je třeba přidávat pomocí mikropipety odměrný roztok nejprve po 0,1 ml a zaznamenávat absorbanci. Po přiblížení k předpokládanému bodu ekvivalence na ±0,1 ml, je třeba snížit objem přidávaného činidla dle potřeby až na 0,010 ml, současně je třeba těsně před předpokládaným bodem ekvivalence přidat 1 kapku amoniakálního tlumiče a poté titrovat až do přechodu do čistě fialového zbarvení.. Titraci opakovat třikrát. 9.2.2 Zpracování výsledků Pro každou titraci sestrojit grafickou závislost absorbance titrovaného roztoku na objemu přidávaného činidla, kde : · na vodorovnou osu vynést objem přidávaného odměrného činidla v ml · na svislou osu odpovídající hodnoty absorbance titrovaného roztoku Graficky zjistit spotřebu odměrného činidla v bodě ekvivalence proložením jedné přímku několika body těsně před koncovým zlomem křivky a druhé přímky několika body za koncovým zlomem křivky. Z průsečíku těchto přímek spustit kolmici k vodorovné ose a odečíst spotřebu odměrného činidla. Při zjišťování bodu ekvivalence se vychází z principu, že od okamžiku dosažení ekvivalence se zbarvení roztoku nemění, měří se buď konstantní zbarvení volné formy indikátoru nebo vymizení barvy indikátorového komplexu. Příklady titračních křivek při fotometrickém stanovení Cu^2+ jsou na obr. 9.1 a 9.2. Obr. 9.1: Fotometrická titrace Cu^2+ na murexid při 460 nm Obr. 9.2: Fotometrická titrace Cu^2+ na murexid při 550 nm Výpočet hmotnosti mědi v neznámém vzorku Dosazením do vzorce vypočítat hmotnost mědi ve vzorku: kde: V[ekv] je průměrná spotřeba odměrného činidla (ml), c[H2Y] je přesná koncentrace 0,01 M odměrného roztoku Chelatonu III, M[Cu] je molární hmotnost mědi (63,546 g.mol^-1), V[0] je objem odměrné baňky s neznámým vzorkem, V[pip] je objem roztoku pipetovaného do kyvety (10 ml). Statistické zpracování výsledků Zvlášť pro každou vlnovou délku zpracovat výsledky do následující tabulky do protokolu. Výpočet směrodatné odchylky s provést podle Deana a Dixona z rozpětí. λ = 460 nm poř. číslo titrace 1 2 3 V[ekv ][ml] m[Cu] [mg] průměr m[Cu] [mg] s(m[Cu]) [mg] rel.směr.odchylka 9.3. Postup měření na spektrofotometru UVVIS 1240 mini 1. Na ploše PC spustit program Fotometrická titrace. Po spuštění programu je třeba ho aktivovat kliknutím na ikonku „Continuous run“. 2. V záložce „Předpokládané objemy“ zvolte typ titrace: a) „orientační titrace“ - vyplnit kolonku „Navážená hmotnost chloridu olovnatého“ → po stlačení tlačítka „SPOČÍTAT“ se vypočítá předpokládaná spotřeba roztoku Chelatonu III. b) „přesná titrace“ vyplnit kolonku „Ekvivalenční objem z orientační titrace“ → po stlačení tlačítka „SPOČÍTAT“ se aktivuje tabulka s možností zadávání dávkování roztoku Chelatonu III (v tabulce v kolonce „Fotometrická titracce“ jsou již předdefinovanédoporučené objemy od 0 do 2,4 ml doplněné krokem 0,2 ml. 3. Nastavení spektrofotometru: Na hlavním panelu spektrofotometru pomocí tlačítka „RETURN“ se dostaneme na úvodní obrazovku na displeji. Po stlačení tlačítka „F4“ (PC Ctrl) se přepne kontrola ovládání spektrofotometru na připojený PC. 4. Nastavení programu - záložka „Fotometrická titrace“: Pro správnou funkci programu je nutné zvolit správný port, přes který je připojený spektrofotometr k PC. Z rolovací nabídky „VISA resource name“ je třeba vybrat port COM2. Po zvolení správného portu se kontrolka „Měření ukončeno“ rozsvítí zeleně a v poli „Absorbance text“ se zobrazí aktuální hodnota absorbance. 5. Na posuvníku „Pipetovaný objem“ nastavit objem přídavku roztoku Chelatonu III. Zpočátku přidávat po 0,2 ml, v oblasti bodu ekvivalence po co nejmenších objemech. 6. Po stlačení tlačítka „MĚŘIT“ se do tabulky naměřených hodnot přidá nový řádek s přidaným objemem Chelatonu III a danou naměřenou absorbancí. Celkový přidaný objem se zobrazí i v kolonce „Napipetováno celkem“. 7. Postup přidávání Chelatonu III pro požadovaný graf se zobrazuje v pravé části okna. 8. Po ukončení titrace otevřít záložku „Vyhodnocení titrace“: 9. Pro vyhodnocení titrace je nutné proložit grafem dvě přímky: a) pro proložení přímky, která prochází strmou částí grafu před bodem ekvivalence je nutné vyplnit hodnoty v levé části záložky b) pro proložení přímky, která prochází vodorovnou částí grafu za bodem ekvivalence je nutné vyplnit hodnoty v pravé části záložky Pořadová čísla jednotlivých titrací můžeme vyčíst z pole „Výstup měření“. Po stlačení tlačítka „VYHODNOTIT“ se přímky proloží grafem a určí se jejich průsečík, který lze vyčíst z pole „Ekvivalenční objem“. 10. Po provedení tří opakujících se titraci otevřít záložku „Statistické vyhodnocení analýzy“: 11. Po zadaní 3 ekvivalenčních objemů vybrat z rolovací nabídky „Typ vyhodnocení“: a) „Výpočet přesné koncentrace odměrného činidla“ pro výpočet přesné koncentrace odměrného roztoku Chelatonu III b) „Výpočet množství mědi v neznámém vzorku“ pro výpočet obsahu mědi ve vzorku. Výsledek statistického zpracování dat se zobrazí v poli „Statistické vyhodnocení“. 12. Záložka „Uložení“ slouží k uložení naměřených a vyhodnocených dat. Je třeba předběžně si vytvořit cestu pro jejich uložení (vytvořit si složku a zkopírovat sdresu): 9.4. Statistické vyhodnocení výsledků analýzy Pro statistické vyhodnocení výsledků analýzy použít matematicko-statistického postupu dle Dean-Dixona, který se používá pro zpracování malých souborů paralelních výsledků, jež jsou obvykle k dispozici při analýzách praktických vzorků. 1. Výsledky m[i] seřadit podle rostoucí velikosti. 2. Vypočítat rozpětí souboru R = m[3] -[ ]m[1]. 3. Zjistit, zda některý z výsledků m[i] není zatížen hrubou chybou, tj. zda se statisticky významně s určitou pravděpodobností neliší od ostatních paralelních výsledků stanovení. Použít Q-testu, vypočítat hodnoty Q[3] a Q[1] dle rovnic , a porovnat je s kritickou hodnotou Q(3, a) z tabulce statistických konstant (tab. III). Je-li Q[3] nebo Q[1] větší než Q(3; 0,05), znamená to, že příslušná hodnota je zatížena hrubou chybou a musí být ze souboru vyřazena. 4. Vypočítat průměrnou hodnotu m[x] jako hodnotu nejbližší správnému výsledku Vyhodnotit variabilitu paralelních výsledků, jako míru přesnosti stanovení vypočítat směrodatnou odchylku s (jako chybu jednotlivých měření) podle Dean-Dixona z rozpětí R s pomocí tabelované konstanty k[i],[ ]která je pro daný počet paralelních stanovení i uvedena v tabulce statistických konstant[ ](tab. 9.1) 5. Přesnost měření charakterizovat také směrodatnou odchylkou průměru s[x] 6. Protože se směrodatná odchylka vztahuje k určitému definovanému provedení analýzy a obvykle závisí i na obsahu stanovované složky, vyjadřit přesnost ve vztahu ke stanovovanému množství jako relativní směrodatnou odchylku s[r] 7. Pokud je známa směrodatnou odchylku s a průměr m[x], lze jako výsledek analýzy definovat interval (v jednotkách výsledku), v němž s určenou pravděpodobností leží správný výsledek (jde o definici intervalu spolehlivosti) m[x] ± K[i] × R Konstantu K[i] odečíst z tabulky statistických konstant (tab. 9.1) pro daný počet stanovení. Tab. 9.1: Statistické konstanty dle Dean-Dixona (pro a = 0,05) počet měření i k[i] K[i] Q 2 0.086 0,71 6,4 3 0,591 0,58 1,3 0,941 4 0,486 0,50 0,72 0,765 5 0,430 0,45 0,51 0,642 6 0,395 0,41 0,40 0,560 7 0,370 0,38 0,33 0,507 8 0,351 0,35 0,29 9.4. Vyhodnocení fotometrické titrace Při vyhodnocení stanovení Cu^2+ v neznámém vzorku v protokolu uvést: 1. Hodnoty nalezených koncentrací Chelatonu III a hmotností Cu^2+ v neznámém vzorku zaokrouhlené na platný počet míst, vyplněné tabulky a vyhodnocené grafy. 2. Statistické vyhodnocení výsledku analýz. 3. Zdůvodnění možného chybného stanovení.